樹(shù)莓類擬盤多毛孢葉斑病病原菌的鑒定

孟婷婷 ，齊鷹博 ，劉 闖 ，劉艷茹 ，代漢萍 ，嚴(yán)雪瑞

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) a.植物保護(hù)學(xué)院，b.園藝學(xué)院，沈陽(yáng) 110161）

樹(shù)莓(Rubus idaeus L．)是薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬多年生落葉灌木植物[1]，已成為我國(guó)一個(gè)新興的果樹(shù)樹(shù)種，其果實(shí)含有多種糖、氨基酸、果膠質(zhì)、花青素、黃酮和多種對(duì)人體有益的微量元素，具有凝血、降壓、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗癌、抗細(xì)胞增殖等多種功能[2]。目前我國(guó)樹(shù)莓病害的研究報(bào)道不多。傅俊范教授課題組先后在遼寧產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了樹(shù)莓病蟲(chóng)害調(diào)查，2010年出版了《小漿果病蟲(chóng)害防治原色圖譜》，涉及了托拉米、美22和費(fèi)爾多德等品種上常見(jiàn)8種病害。其中樹(shù)莓灰霉病是對(duì)產(chǎn)量影響最大的病害，各基地均有發(fā)生，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）危害造成，其發(fā)生的嚴(yán)重程度與氣候條件關(guān)系密切，一般損失10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可以使樹(shù)莓絕收。常見(jiàn)的葉斑病主要有樹(shù)莓灰斑病、炭疽病和斑枯病等。樹(shù)莓灰斑病主要由薔薇色尾孢霉（Cercospora rosicola）侵染葉片引起，在葉片上形成深褐色不規(guī)則病斑；樹(shù)莓炭疽病病原為炭疽菌屬真菌（Colletotrichum sp．），在葉片上形成中心白色邊緣褐色病斑；樹(shù)莓斑枯病病原為殼針孢屬真菌（Septoria sp．），在葉片上形成褐色病斑，常匯聚連片引起葉枯。根癌病是危害樹(shù)莓根部的一種細(xì)菌性病害，病原為根癌土壤桿菌（A-grobacterium tumefaciens），地下部發(fā)病對(duì)地上部植株生長(zhǎng)產(chǎn)生較大影響，該病隨栽培年限加長(zhǎng)呈現(xiàn)逐年加重趨勢(shì)。樹(shù)莓銹病由少隔多胞銹菌（Phragmidium pauciloculare）侵染引起，僅在樹(shù)莓野生資源上發(fā)現(xiàn)，目前尚未侵染栽培品種。樹(shù)莓黏菌病的病原腐生于樹(shù)莓莖基部及樹(shù)莓園地落葉、腐草上，在遼寧樹(shù)莓生產(chǎn)基地時(shí)有發(fā)生，由白煤絨菌（Fuligo septica）引起該癥狀。樹(shù)莓苗期立枯病主要由茄絲核菌（Rhizoctonia solani）為害，在遼寧樹(shù)莓育苗基地發(fā)現(xiàn)，不同的年份發(fā)生嚴(yán)重度差異大，做好土壤消毒是控制該病發(fā)生的最有效途徑。此外，王娜等報(bào)道了由病原菌（Coniothyrium fuckelii）引起的樹(shù)莓葉枯病。戴啟東等報(bào)道了遼寧地區(qū)樹(shù)莓炭疽病，其病原菌為（Colletotrichum gloeosporiodis）[3-11]。2017年，在遼寧省沈陽(yáng)樹(shù)莓產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了擬盤葉斑病，病斑近橢圓形，灰白色，大小約為0．5～0．8 cm。為了明確該病害的致病菌，本研究通過(guò)組織分離，單孢純化，致病性測(cè)定，形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)等一系列相關(guān)研究鑒定樹(shù)莓葉斑病病原并考察其生物學(xué)特性，為明確病原菌的分類地位，科學(xué)的指導(dǎo)病害防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樹(shù)莓感病葉片采自1a生樹(shù)莓植株。2017年8月，分離菌回接試驗(yàn)于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及致病性測(cè)定 通過(guò)組織分離[12]和單孢分離的方法，對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化。用滅菌后的手術(shù)刀于病鍵交界處切取5 mm×5 mm組織塊若干，放入PDA平板上，然后置于25℃溫箱中培養(yǎng)。待其長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落邊緣的菌絲置PDA上培養(yǎng)，待其產(chǎn)孢后，經(jīng)單胞分離后獲得純培養(yǎng)菌落。將其接種到PDA斜面上，置于4℃溫箱中保存，備用。

選取1a生樹(shù)莓植株進(jìn)行致病性測(cè)定試驗(yàn)。病原菌在PDA培養(yǎng)生長(zhǎng)5 d后打取直徑為 5mm的菌餅作為接種體，采用針刺法進(jìn)行葉片創(chuàng)傷，將菌餅帶菌面貼于傷口處作為接種組，以無(wú)菌PDA圓餅貼于傷口處作為對(duì)照組，設(shè)3次重復(fù)。處理組和對(duì)照組均置于28℃環(huán)境下觀察，保濕48h后分別撤掉菌餅和PDA圓餅，分別于處理第3天、第5天和第7天記錄發(fā)病情況。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將病原菌放置在PDA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)，觀察其病原菌的菌落顏色，生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢情況等。用Olympus BX43顯微鏡觀察其分生孢子的形態(tài)，測(cè)量孢子大小及頂端附屬絲的長(zhǎng)度。

1.2.3 病原菌分子系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定 目前擬盤多毛孢屬真菌的分子系統(tǒng)發(fā)育研究方法比較完善，骨架樹(shù)分析已經(jīng)完成。對(duì)該屬未知菌的種群分析主要采用ITS、β-tubulin和tef1基因聯(lián)合建樹(shù)即可[9]。本研究中系統(tǒng)發(fā)育分析首先采用了骨架樹(shù)比對(duì)進(jìn)行初鑒定，隨后擴(kuò)充近緣種建樹(shù)，進(jìn)行種群鑒定的思路。所用模式菌株來(lái)源于已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[13-18]，所屬的ITS、TUB和EF1基因均在Genbank中下載。

采用改良的CTAB法提取致病菌的DNA，分別采用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增 ITS 基因；引物 BT2A(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’)和 BT2B(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’)擴(kuò)增 β-tubulin 基因，EF1-526F(5’-GTCGTYGTY-ATYGGHCAYGT-3’)和 EF1-1567R(5’-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3’)擴(kuò)增 tef1 基因。 PCR 反應(yīng)體系為 25μL，包括 10×PCR buffer 2．5μL，MgCl2（25mmol·L-1）2．5μL，模板 DNA 1μL，dNTP（10mmol·L-1）0．5μL，TaqDNA 聚合酶(5U·μL-1）0．2 μL，引物（20mmol·L-1）各 0．5μL，ddH2O 17．3μL。 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果通過(guò) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)采用CLUSTAL X 2．1軟件進(jìn)行分析。系統(tǒng)發(fā)育建樹(shù)采用MEGA 7．0最大似然法（ML）進(jìn)行分析，Bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1000次。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性研究 病原菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后，用5mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，將5 mm菌餅分別置于不同碳源（葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，可溶性淀粉）培養(yǎng)基，不同的氮源[NaNO3，(NH4)2SO4，NH4H2PO4，半胱氨酸，甘氨酸]培養(yǎng)基，不同基質(zhì)（PDA，OA，樹(shù)莓煎汁，松針，查彼）培養(yǎng)基下培養(yǎng)，每個(gè)處理組重復(fù) 3次，25℃下恒溫培養(yǎng)。置于 6個(gè)不同溫度（10，15，20，25，28，30℃）下黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于不同光照（完全黑暗，完全光照，12h黑暗12h光照交替）下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。分別于處理3，5，7d使用十字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并使用軟件Excel和SPSS17．0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與致病性的測(cè)定

樹(shù)莓?dāng)M盤葉斑病，病斑灰白色，近橢圓形（圖1A）。對(duì)樹(shù)莓葉斑病病樣進(jìn)行分離，對(duì)分離菌進(jìn)行單胞純化，最終獲得了15株菌落表現(xiàn)一致的菌株，選取1株代表菌株，其編號(hào)為SNHS12B，它引起的病害癥狀表現(xiàn)為葉部病斑近橢圓形，灰白色，大小約為0．5～0．8cm代表菌株在接種樹(shù)莓后置于28℃條件中培養(yǎng)，3d后出現(xiàn)棕色病斑，7d后接種部位出現(xiàn)深棕色病斑，病斑大小發(fā)展為1．8 cm，對(duì)照組均不發(fā)?。▓D1B和C）。對(duì)接種后的發(fā)病部位進(jìn)行病原菌再次分離，均獲得與原始菌株一樣的病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

該菌在PDA培養(yǎng)基置于25℃溫箱中培養(yǎng)15 d后，菌落白色，輪紋明顯，菌落背面淡黃色（圖1D）。子實(shí)體為黑色墨汁狀，分布密集。分生孢子(圖1E和F)為紡錘形，具有5個(gè)細(xì)胞，4個(gè)隔膜，頂端具3～4根附屬絲，形態(tài)學(xué)特征與擬盤多毛孢屬真菌吻合。 該菌分生孢子大小為 （39．7～44．9）×（9．1～11．6）μm，平均（40．1×10．5）μm；分生孢子頂端附屬絲 2～4 根，長(zhǎng)度為（19．3～36．2）μm，平均 32．6μm。 分生孢子特征與 Neopestalotiopsis megna描述相近[11]。

圖1 樹(shù)莓?dāng)M盤葉斑病病斑及病菌特征Figure 1 Raspberry leaf spot symptom and its pathogen phenotype

2.3 病原菌分子系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定

對(duì)代表菌株的ITS、β-tublin和tef1進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，分別得到了521 mbp、446 mbp和1046 mbp片段。將代表菌的ITS序列放入NCBI中比對(duì)，結(jié)果表明共與N.megna的 ITS序列相似度達(dá)100%，再次從屬水平上證明該菌屬于新擬盤多毛孢屬。進(jìn)一步采用三基因聯(lián)合建樹(shù)方法將代表菌與擬盤骨架樹(shù)上各分支部分代表模式菌株進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明該菌與N.aotearoa和N.piceana位于同一分支（結(jié)果未在此文提供），該步驟找到了該菌在系統(tǒng)骨架樹(shù)上所處的具體分支位置，為后續(xù)與近緣模式種的收集與比對(duì)提供了具體方向，通過(guò)文獻(xiàn)查閱最終獲得 7 個(gè)種[N.aotearoa，棒狀擬盤多毛孢（N.clavispora），N.magna，N.australis，N.formicarum，N.honoluluana和N.piceana]作為二次建樹(shù)的模式種 （表1）。近緣種分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，供試菌株SNHS12B與N.megna代表菌株處于同一分支，并與其他近緣種區(qū)分，且自展值支持率達(dá)到99%（圖2）。根據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明該病原菌為N.megna。

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

比較不同碳源(葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，可溶性淀粉)可知，葡萄糖、麥芽糖為最適碳源，培養(yǎng)7d后菌落直徑可達(dá)6.37cm。比較不同氮源[NaNO3，(NH4)2SO4，NH4H2PO4，半胱氨酸，甘氨酸]可知，最適氮源為甘氨酸，培養(yǎng)7d后菌落直徑可達(dá)5.07cm，與其他條件下差異明顯。

表1 用于ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的相關(guān)菌株信息及其基因登錄號(hào)Table 1 Related strain information and its genetic accession number for ML phylogenetic tree

圖2 聯(lián)合ITS、β-tubulin和tef1基因序列構(gòu)建的樹(shù)莓葉斑病菌的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 ML phylogenetic tree of raspberry leaf spot disease constructed with ITS,β-tubulin and tef1 gene sequences

比較不同溫度（10，15，20，25，28，30℃）下菌落生長(zhǎng)情況可知，最適溫度為 28℃，培養(yǎng) 7d 后菌落直徑可達(dá)7．89cm，與其他條件下差異明顯。比較不同光照(完全黑暗，完全光照，12h黑暗12h光照交替)下菌落生長(zhǎng)情況可知，不同光照條件下菌落生長(zhǎng)無(wú)明顯差異。比較不同培養(yǎng)基(PDA，OA，樹(shù)莓煎汁，松針培養(yǎng)基，查彼)中菌落的生長(zhǎng)情況可知，PDA為該菌落生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基，培養(yǎng)7d后菌落直徑可達(dá)8．09cm，與其他條件下差異明顯。

圖3 不同碳源對(duì)樹(shù)莓?dāng)M盤葉斑病菌的菌落生長(zhǎng)影響Figure 3 The effect of carbon source on colony growth of the pathogen caused raspberry leaf spot

圖4 不同氮源對(duì)樹(shù)莓?dāng)M盤葉斑病病菌的菌落生長(zhǎng)影響Figure 4 The effect of nitrogen sourceon on colony growth of the pathogen caused raspberry leaf spot

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)樹(shù)莓?dāng)M盤葉斑病病菌的菌落生長(zhǎng)影響Figure 5 The effect of different medium on colony growth of the pathogen caused raspberry leaf spot

圖6 不同溫度對(duì)樹(shù)莓?dāng)M盤葉斑病病菌的菌落生長(zhǎng)影響Figure 6 The effect of different temperature on colony growth of the pathogen caused raspberry leaf spot

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)的擬盤菌葉斑病為樹(shù)莓種植中新發(fā)現(xiàn)的一種病害，田間危害較重。本研究通過(guò)組織分離，單孢純化，致病性測(cè)定，形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)發(fā)育鑒定等一系列研究，發(fā)現(xiàn)該病由N.megna危害造成。該菌在PDA培養(yǎng)基上菌落為白色，其上密布許多針狀分生孢子器，菌落背面呈淡黃色。分生孢子，具4個(gè)隔膜，中間3個(gè)細(xì)胞深色，頂孢和尾孢無(wú)色，頂端附屬絲3～4根，尾孢中生柄明顯。分生孢子大小平均為40．1×10．5μm； 頂端附屬絲長(zhǎng)度平均為 32．6μm。 此前 N.megna曾報(bào)道在厥類植物上引起危害[15]，本研究是N.megna危害樹(shù)莓的首次報(bào)道。

圖7 不同光照對(duì)樹(shù)莓?dāng)M盤葉斑病病菌的菌落生長(zhǎng)的影響Figure 7 The effect of light on colony growth of the pathogen caused raspberry leaf spot

擬盤多毛孢屬真菌是一類重要的植物病原菌，可為害多種植物，特別是果樹(shù)與經(jīng)濟(jì)林，造成減產(chǎn)和嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[16]。該屬真菌分布較廣，可出現(xiàn)同種作物在不同地區(qū)由不同擬盤菌種群危害的現(xiàn)象。如藍(lán)莓上報(bào)道的擬盤多毛孢真菌危害就出現(xiàn)上述情況。廣西地區(qū)報(bào)道的藍(lán)莓葉斑病由棕櫚擬盤多毛孢（P.trachicarpicola）引起[19]；福建長(zhǎng)汀藍(lán)莓枝枯病由N.chrysea引起[20]；吉林省長(zhǎng)春發(fā)生的藍(lán)莓葉斑病由石楠擬盤多毛孢（P.photiniae）引起[21]；山東藍(lán)莓葉斑病由棒狀擬盤多毛孢（N.clavispora）引起[22]。同樣的情況也出現(xiàn)在鐮孢菌上，在江西產(chǎn)區(qū)引起藍(lán)莓葉枯病的病原菌為亞細(xì)亞鐮孢菌（Fusarium asiaticum）[23]，而在浙江地區(qū)引起藍(lán)莓根腐病的病原菌為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）[24]。由此可見(jiàn)，由于生境的不同，亦存在同一屬不同種群危害寄主的情況。此外，本課題組還報(bào)道了由P.adusta引起的樹(shù)莓葉斑病[25]，與本文報(bào)道的N.megna引起的樹(shù)莓葉斑病在癥狀、病菌形態(tài)上可明顯區(qū)分。

目前，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）真菌鑒定主要采用形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)特性相結(jié)合的方法[13，18]。2012年，MAHARACHCHIKUMBURA提出了該屬分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)，即使用ITS、β-tubulin和tef1三段基因進(jìn)行聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析可將現(xiàn)有絕大多數(shù)的模式種很好地區(qū)分，該方法的出現(xiàn)被視為擬盤菌鑒定的里程碑。2014年，MAHARACHCHIKUMBURA[16]對(duì)Pestalotiopsis屬進(jìn)行修訂。將該屬分為3個(gè)屬，除Pestalotiopsis之外，還新成立了Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis 2個(gè)屬。本研究使用了國(guó)際統(tǒng)一鑒定分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。

對(duì)病原菌生物學(xué)特性的研究，可以為該病害的后續(xù)防控、科學(xué)研究提供病原菌背景信息。該菌的生物學(xué)特性結(jié)果表明：PDA為該菌落生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基，葡萄糖、麥芽糖為最適碳源，半胱氨酸為最適氮源。該菌生長(zhǎng)的最適溫度為28℃，光照對(duì)其菌落生長(zhǎng)影響不顯著。從這些數(shù)據(jù)可以推斷該菌有可能更適應(yīng)高溫高濕氣候，且不需特殊生長(zhǎng)因子。