干旱脅迫下蒙古冰草的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

王月英，黃廣學(xué)，孟利前，肖海峻

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442）

干旱是農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要限制因素，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量及種植范圍。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球干旱和半干旱地區(qū)約占土地總面積的36%，占耕地總面積的43%，全球由于缺水導(dǎo)致的作物減產(chǎn)遠(yuǎn)超其他因素[1-2]。蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）是禾本科冰草屬多年生草本植物，主要分布在內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏等干旱地區(qū)的沙質(zhì)草原[3]。冰草耐瘠薄、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣[4-5]，具防風(fēng)固沙和水土保持功能，有很高的生態(tài)價(jià)值[6-7]。冰草各種營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)較高，適口性好，具有極高的飼用價(jià)值[8-9]，近年來有不少關(guān)于冰草的遺傳育種，抗旱耐鹽等方面的研究報(bào)道[10-14]，利用冰草優(yōu)越的生物學(xué)特性，在生態(tài)環(huán)境被破壞的地區(qū)進(jìn)行天然草場(chǎng)補(bǔ)播和建植人工草地等方面取得了很大的進(jìn)展[15-16]，然而對(duì)蒙古冰草在干旱脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)的研究鮮見報(bào)道。iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)即同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)，是近年來最新開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)，具有分離能力強(qiáng)、分析范圍廣、定量結(jié)果可靠、靈敏度高、分析時(shí)間快、分離效果好、自動(dòng)化程度高，可檢測(cè)出低豐度蛋白等特點(diǎn)[17-18]。本研究采用iTRAQ技術(shù)研究干旱及復(fù)水處理下冰草葉片中的蛋白質(zhì)的變化，以期豐富蒙古冰草耐旱性分子生理研究。

1 材料與方法

1.1 材料

以蒙古冰草種子為試驗(yàn)材料，該種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原所種質(zhì)資源庫(kù)提供。考馬斯亮藍(lán)G250（購(gòu)于Amesco公司），SDS、PAGE、甲叉雙丙烯酰胺（均購(gòu)于SIGMA公司），甲醇、乙腈、甲酸（均購(gòu)于Fisher scientific公司）。

1.2 方法

蒙古冰草種子經(jīng)過10%次氯酸鈉溶液消毒15min，流水沖洗數(shù)次。選擇大小均一的塑料花盆，每盆裝1．5kg蛭石和草炭土（v/v=1∶3），將種子均勻撒播于盆中，然后用土輕輕覆蓋并澆透水，出苗后間苗，2～3片真葉時(shí)定苗，每盆選留長(zhǎng)勢(shì)均一的植株20株，待生長(zhǎng)到4～5片真葉時(shí)進(jìn)行干旱處理（土壤濕度20%）。對(duì)照組植株保持正常水分供應(yīng)（土壤濕度70%），干旱處理植株一直保持干旱狀態(tài)，在干旱處理12d后進(jìn)行復(fù)水并保持正常水分供應(yīng)。分別于處理0，4，8，12，16d采集蒙古冰草葉片進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1 蒙古冰草蛋白質(zhì)提取、消化和肽段的標(biāo)記 蛋白質(zhì)提取的方法參照三氯乙酸（TCA）/丙酮法提取[21-22]，使用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量[23]。同時(shí)用SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白樣品質(zhì)量。

每個(gè)樣品取100μg蛋白，用含0．1%SDS的TEAB補(bǔ)齊所有樣品相同體積。加入1μg·μL-1的Trypsin，每100μg蛋白質(zhì)底物加入 3．3μg的酶，37℃水浴 24h，然后補(bǔ)加 Trypsin 1μg，37℃處理 12h。凍干消化液，然后使用TEAB（水∶TEAB=1∶1）每管 30μL 復(fù)溶肽段[24]。

標(biāo)記試劑平衡至室溫，每管標(biāo)記試劑中加入70μL異丙醇，混勻1 min，離心甩至管底。將混好的標(biāo)記試劑加入到肽段中，不同樣品用不同大小的同位素標(biāo)記。混勻后，甩至管底，室溫靜置2h。真空抽干后標(biāo)記樣品。

1.2.2 蒙古冰草強(qiáng)陽離子交換色譜檢測(cè) 使用強(qiáng)陽離子交換柱（SCX）做預(yù)分離，采用逐步提高陽離子濃度的梯度洗脫使得肽段分離。標(biāo)記后樣品用A液（25%ACN，10mmol·L-1KH2PO4，用磷酸調(diào)pH值至3．0）稀釋10倍，磷酸調(diào) pH 值至 3．0，15000g 離心 10min，取上清 B 液為 25%ACN，2 mol·L-1KCl，10mmol·L-1KH2PO4，用磷酸調(diào)pH值至3．0。A液和B液超聲5～10min后，用有機(jī)膜過濾[25]。

1.2.3 蒙古冰草質(zhì)譜檢測(cè) 收集上述分離的肽段，用C18反相色譜除鹽純化，用1mL甲醇活化柱料，流速1s 2～3滴。5%ACN平衡，每秒1滴。樣品用1mL MilliQ水溶解過柱。1mL 5%乙腈洗柱除鹽，每秒1滴。500μL純乙腈洗脫，每秒1滴。低溫離心抽干乙腈。0．1%甲酸復(fù)溶肽段。

Q-Exactive 質(zhì)譜儀檢測(cè)肽段信號(hào)，Nano-LC 的洗脫條件及梯度：A 液（水，0．1%FA），B 液（乙腈，0．1%FA），色譜柱為 C18（100mm×75mm），孔徑 300A，粒徑 5μm，流速為 40mL·min-1。

1.2.4 蒙古冰草蛋白質(zhì)定性與定量分析 將得到的質(zhì)譜圖輸入到PD（Proteome Discoverer 1．3，thermo）軟件進(jìn)行篩選（母離子質(zhì)量范圍為350～6000Da；二級(jí)質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)為10；信噪比S/N域值為1．5）。PD提取后的譜圖用mascot進(jìn)行搜索，PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析。

1.2.5 蒙古冰草定量蛋白生物信息分析 通過Mascot軟件，排除肽段鑒定得分過低的、鑒定到的并非蛋白所特有的（non-unique peptide）、使整體結(jié)果偏差較大的，所得到肽段的定量信息經(jīng)取中位值（若肽段種類數(shù)為偶數(shù)個(gè)，則取中間兩個(gè)數(shù)的幾何平均值），得到蛋白的定量信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古冰草蛋白組學(xué)定量分析

由圖1可知，供試樣品蛋白質(zhì)量好，條帶清晰雜質(zhì)較少，定量用的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0．184x+0．008（R2=0．994）。 干旱處理 0d 的蛋白質(zhì)含量為 1．8g·L-1，處理 4d 為 1．4g·L-1，處理 8d 為 1．9g·L-1，處理 12d 為 1．4g·L-1，干旱處理12d后復(fù)水處理4d蛋白質(zhì)含量為1．6g·L-1。

2.2 蒙古冰草蛋白組學(xué)定性分析

Q-Exactive質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)也得到了較好的碎片信息（圖 2），最終得到 315377 個(gè)譜圖，其中 69280（21．9%）為匹配上的部分。總共得到11724種肽段，其中2828（24%）條匹配上的蛋白，匹配上的肽段集中在10～20個(gè)氨基酸，其中長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸的出現(xiàn)頻次超過8000次（圖3）。上述參數(shù)說明檢測(cè)覆蓋度較好，肽段大部分長(zhǎng)度在10個(gè)氨基酸以上，可以更好的用于生物信息學(xué)分析。

2.3 干旱處理下蒙古冰草的差異蛋白分析

對(duì)匹配上的2828條蛋白序列進(jìn)行分析，并將測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量與對(duì)照樣品中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行計(jì)算得到一個(gè)比值（處理/對(duì)照），其中差異倍數(shù)大于1．2的為上調(diào)蛋白，在蒙古冰草抗旱過程中起正調(diào)控作用，提高本身抗旱能力；差異倍數(shù)小于0．8的為下調(diào)蛋白，在抗旱過程中起負(fù)調(diào)控作用，降低干旱對(duì)植株本身造成的傷害。干旱后復(fù)水4d的蒙古冰草開始恢復(fù)生理狀態(tài)，但并未恢復(fù)到正常水平。與干旱處理12d相比，復(fù)水后差異表達(dá)蛋白數(shù)目明顯減少，與干旱處理4d和干旱處理8d相比，復(fù)水后差異蛋白依舊呈現(xiàn)較高的水平（圖4）。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)Figure 1 SDS-PAGE test

圖2 Q-Exactive質(zhì)譜檢測(cè)圖Figure 2 Q-Exactive mass spectrum

圖3 肽段長(zhǎng)度分布圖Figure 3 Peptide length distribution

取各樣品中顯著上調(diào)的蛋白繪制韋恩圖（圖5A），發(fā)現(xiàn)有20個(gè)蛋白在干旱處理樣品中一直呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)（表1）。即在冰草開始遭受干旱脅迫時(shí)，這些蛋白立即開始上調(diào)表達(dá)，持續(xù)脅迫過程中一直處在較高的表達(dá)水平。這些持續(xù)上調(diào)的蛋白與其他蛋白不同，更有可能參與冰草干旱抗逆的整個(gè)代謝途徑。韋恩圖除共有部分的其他每一個(gè)部分都代表不同時(shí)期的表達(dá)差異，例如有28個(gè)蛋白在干旱脅迫4 d時(shí)上調(diào)，在后期干旱脅迫過程中沒有上調(diào)，說明這些蛋白可能是參與脅迫響應(yīng)，干旱持續(xù)時(shí)隨著冰草抗逆機(jī)制調(diào)節(jié)到正常水平；有141個(gè)蛋白在干旱脅迫時(shí)沒有顯著上調(diào)，在復(fù)水后顯著上調(diào)，說明這些蛋白可能參與冰草水分吸收及機(jī)體修復(fù)等功能。這些蛋白在調(diào)控過程中是正向調(diào)控作用，相對(duì)應(yīng)的同時(shí)存在一些負(fù)調(diào)控作用的蛋白（圖5B和表2），這些負(fù)向調(diào)控的蛋白在冰草抗干旱脅迫中同樣起著至關(guān)重要的作用。

圖4 干旱及復(fù)水處理中差異蛋白的數(shù)量Figure 4 Number of differential proteins in dry and rehydrationtreatment

圖5 干旱處理上調(diào)蛋白（A）、下調(diào)蛋白（B）和干旱后復(fù)水處理的蛋白（C）Figure 5 Drought up-regulated protein(A)，drought down-regulated protein(B)and protein of rehydration after drought(C)

表1 干旱處理持續(xù)上調(diào)蛋白Table 1 Up-regulated proteins in dry condition

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫對(duì)植物影響廣泛，它可以表現(xiàn)在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，如種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，直到開花結(jié)實(shí)[26-27]。植物的抗旱性強(qiáng)弱在很大程度上取決于水分脅迫下細(xì)胞的持水能力以及干旱脅迫后細(xì)胞的復(fù)水能力[28]。本研究通過對(duì)干旱脅迫下蒙古冰草蛋白質(zhì)組學(xué)的測(cè)定，篩選出15個(gè)在干旱情況下持續(xù)上調(diào)的蛋白和6個(gè)持續(xù)下調(diào)的蛋白，這些蛋白在植物處于脅迫的情況下維持植物的滲透壓、減少植物的失水方面起著至關(guān)重要的作用。

蒙古冰草葉片在干旱脅迫處理時(shí)相對(duì)含水量雖然下降較快，但復(fù)水處理后仍能恢復(fù)到脅迫前的狀態(tài)，這也表明冰草對(duì)相對(duì)含水量具有較高的調(diào)節(jié)能力[12-14]。干旱處理12d后復(fù)水處理4d，冰草正是處于恢復(fù)狀態(tài)。通過比較蛋白組發(fā)現(xiàn)有1個(gè)基因（Q40001）是在干旱情況下一直處于下調(diào)狀態(tài)的，但是在復(fù)水后是處于上調(diào)的（圖7）。這一現(xiàn)象說明這一基因在冰草干旱以及復(fù)水恢復(fù)時(shí)期都起著關(guān)鍵作用，由此推測(cè)冰草極強(qiáng)的抗旱能力與這一蛋白有著很大的相關(guān)性。通過查詢蛋白的注釋信息，可以看到該蛋白是一種鎂離子螯合酶。鎂離子是葉綠素的重要成分，許多文獻(xiàn)報(bào)道在植物干旱脅迫下葉綠素降解，這個(gè)鎂離子螯合酶的變化情況與葉綠素的變化趨勢(shì)相符合[26-27]。在干旱脅迫的情況下，鎂離子螯合酶下調(diào)，導(dǎo)致新的葉綠素產(chǎn)生減少以及已有的葉綠素降解降低葉片本身的光合作用，盡量避免葉片氣孔閉合帶來的水分損失。在復(fù)水后，鎂離子螯合酶上調(diào)合成葉綠素，大量的葉綠素合成迅速提高植株整體光合效率，使得植株更快恢復(fù)到正常狀態(tài)。

表2 干旱處理持續(xù)下調(diào)蛋白Table 2 Down-regulated proteins in dry condition

通過iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)即同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)對(duì)植物整體蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，其核心意在尋找某種特定因素引起樣本之間蛋白質(zhì)組的差異，揭示并驗(yàn)證蛋白質(zhì)組在生理或病理過程中的變化，從而更易于揭示機(jī)體對(duì)內(nèi)外界環(huán)境變化產(chǎn)生反應(yīng)的本質(zhì)規(guī)律[19-20]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)可以研究蒙古冰草在干旱情況下蛋白質(zhì)組的變化情況，了解冰草抗旱機(jī)制，鑒定和發(fā)現(xiàn)與冰草抗旱性相關(guān)的蛋白。對(duì)冰草抗旱相關(guān)蛋白質(zhì)研究，不僅能夠選育更加優(yōu)良的冰草品種，而且能為其他非抗旱物種提供候選基因支持，對(duì)農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)的發(fā)展有著極其重要的意義。