植物抗病毒機(jī)制研究進(jìn)展

代紅艷，郭 巍

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，沈陽 110161）

植物在生長(zhǎng)和發(fā)育過程中會(huì)受到多種病原物的侵襲，如病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲等。植物病毒是農(nóng)作物的主要病原之一，病毒病害發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重，且植物病毒分子變異復(fù)雜，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在較大威脅，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。與動(dòng)物病毒不同，植物病毒不能直接侵入植物表皮，需要借助昆蟲、真菌等載體或植物表皮的機(jī)械傷口、氣孔等進(jìn)入植物細(xì)胞，其中80%的植物病毒借助昆蟲、線蟲等載體進(jìn)行侵染[2]。病毒一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞，即脫去外殼蛋白，釋放病毒基因組，并利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量完成自我表達(dá)和復(fù)制，在植物體內(nèi)通過胞間連絲實(shí)現(xiàn)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，利用維管系統(tǒng)的韌皮部篩管組織進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸，從而實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)侵染[3]。

植物采用多種防御機(jī)制限制病毒的侵染，復(fù)制和運(yùn)動(dòng)，其中比較保守的機(jī)制有免疫受體信號(hào)傳導(dǎo)和基因沉默（RNA沉默）[4-6]。病毒在侵染植物細(xì)胞時(shí)會(huì)向胞內(nèi)釋放效應(yīng)因子（effector），干擾和破壞植物的基礎(chǔ)免疫，引發(fā)植物的胞內(nèi)免疫受體蛋白識(shí)別病毒的效應(yīng)因子并激活效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫 （effectors-triggered immunity，ETI）過程[7]。病毒的效應(yīng)因子與植物的胞內(nèi)免疫受體蛋白相互競(jìng)爭(zhēng)，協(xié)同進(jìn)化。近年來研究表明，植物細(xì)胞膜表面的模式識(shí)別受體 （pattern recognition receptor，PRR）也能夠限制病毒感染，引起病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）觸發(fā)的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）[8]。 例如，研究發(fā)現(xiàn)一種跨膜免疫受體NIK1（nuclear shuttle protein-interacting kinase 1，NIK1），其結(jié)構(gòu)類似于參與PTI的共受體激酶BAK1（brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1），已被證明可以通過抑制宿主翻譯來防御DNA病毒[9]。此外，病毒成功侵入植物細(xì)胞后，在復(fù)制的過程中會(huì)產(chǎn)生病毒來源的小分子RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA），vsiRNA通過反向互補(bǔ)配對(duì)沉默病毒基因組，消除病毒RNA，從而抑制病毒的擴(kuò)散，即RNA沉默引起的防御機(jī)制。隨著植物防御策略的進(jìn)化，RNA沉默通常會(huì)被共同進(jìn)化的病毒編碼的RNA沉默抑制子/蛋白（viral suppressor of RNA silencing，VSR）（即病毒效應(yīng)因子/蛋白）所抑制，從而增強(qiáng)對(duì)宿主的致病性。基于近來關(guān)于植物-病毒相互作用的研究報(bào)道，本文從先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)和RNA沉默介導(dǎo)兩方面綜述植物抗病毒機(jī)制，重點(diǎn)介紹植物在共同進(jìn)化競(jìng)爭(zhēng)中克服病毒侵染的機(jī)制。

1 植物先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制

植物的天然免疫系統(tǒng)具有雙重識(shí)別應(yīng)答的機(jī)制，即固有免疫（第1層防御系統(tǒng)）和效應(yīng)物引起的免疫（第2層防御系統(tǒng)）[10]。在病原菌侵染植物的初期，病原相關(guān)分子模式 （PAMP），例如細(xì)菌鞭毛蛋白、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、真菌的葡聚糖、幾丁質(zhì)，會(huì)被PRR識(shí)別[11]，這個(gè)過程被稱作PTI，也是植物的固有免疫，是植物的第1層防御系統(tǒng)。在植物與微生物協(xié)同進(jìn)化過程中，病原菌進(jìn)化出一些能抑制PTI信號(hào)途徑，如向胞內(nèi)釋放效應(yīng)因子來躲避或干涉植物的第1層防御系統(tǒng)，這便引發(fā)宿主植物產(chǎn)生針對(duì)性更強(qiáng)的由抗性基因編碼抗性蛋白（R蛋白），也稱胞內(nèi)免疫受體來識(shí)別病原菌分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)因子[12]。這種由效應(yīng)物促發(fā)的免疫稱作ETI，屬于植物的第2層防御系統(tǒng)[13]。

1.1 病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫

病原菌入侵植物后，植物早期的PTI應(yīng)答反應(yīng)十分迅速，包括激活相關(guān)離子通道、改變膜的通透性、促絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的激活、HR、活性氧 （reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)以及一些病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）蛋白的產(chǎn)生和積累[14]，這些防衛(wèi)反應(yīng)限制了病原物的生長(zhǎng)，從而起到抗病功能。PRR能夠識(shí)別多種病原菌，是PTI的基礎(chǔ)，是防御反應(yīng)的第一層堡壘。富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶（leueine-rich repeat RLK，LRR-RLK）是植物中最主要的一類PRR，在調(diào)控植物體生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗非生物和生物脅迫過程中也扮演著重要作用[15-17]。LRR-RLK由胞外結(jié)構(gòu)LRR（LxxLxLxxNxL）重復(fù)基序、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)蛋白激酶區(qū)組成，其胞外LRR結(jié)構(gòu)在病原菌信號(hào)識(shí)別過程發(fā)揮最重要的作用。自第一個(gè)LRR-RLK基因從玉米中分離出以來，許多LRR-RLK基因及其功能通過實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)[18-19]。FLS2（flagellin sensitive 2）是模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)PRR，也是目前作用機(jī)制研究得最為透徹的一個(gè)PRR。FLS2胞外具有28個(gè)LRR基序，能夠識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白N端保守的22個(gè)氨基酸（flg22）。FLS2與flg22的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)FLS2和BAK1（BRI1-associated receptor kinase1）形成異源二聚體，從而磷酸化下游蛋白，進(jìn)而觸發(fā)MEKK1-MKK4/5-MPK3/6信號(hào)級(jí)聯(lián)，正調(diào)節(jié)抗病性[20-21]。BAK1是植物油菜素內(nèi)酯的信號(hào)通路中BRI1的受體[22]，后歸屬于擬南芥植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生類受體激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）家族成員，也被稱為SERK3，胞外具有5個(gè)LRR。目前，已發(fā)現(xiàn)多數(shù)胞外域較長(zhǎng)的類受體激酶如EFR、PEPR、Eix1都需要與胞外域較短的BAK1或SERK家族蛋白結(jié)合形成異源二聚體以識(shí)別不同的信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞死亡和先天免疫反應(yīng)[23-24]。

先前的報(bào)道認(rèn)為，與真菌和細(xì)菌有所不同，病毒大多數(shù)能避開位于細(xì)胞膜上的模式識(shí)別受體PRR的識(shí)別，逃脫植物的第1層防御系統(tǒng)，病毒的防御主要依賴第2層防御系統(tǒng)的胞內(nèi)R蛋白[25]。然而，近年來也有關(guān)于PTI信號(hào)傳導(dǎo)途徑上游PRR蛋白抵御病毒的研究報(bào)道。免疫共受體BAK1及BKK1（BAK1-like kinase 1）有助于擬南芥抵抗多種RNA病毒，如煙草花葉病毒 （Tobacco mosaic virus，TMV），蕪菁皺縮病毒 （Turnip crinkle virus，TCV）和油菜花葉病毒（Oilseed rape mosaic virus，ORMV）[8,26]。此外，還有一種結(jié)構(gòu)類似于共受體蛋白激酶的免疫受體NIK1，可抵御甘藍(lán)曲葉病毒（cabbage leaf curl virus，CaLCuV）等DNA病毒[9]。NIK1被鑒定為雙生病毒核穿梭蛋白（nuclear shuttle protein，NSP）的靶標(biāo)，因此被命名為核穿梭蛋白互作激酶（NSP-interacting kinase，NIK）[27]。CALIL等[9,28]認(rèn)為與配體結(jié)合后的 NIK1能夠使下游組件 RPL10（ribosomal protein L10）轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，而RPL10與LIMYB蛋白（L10-Interacting MYB domain-containing protein）互作，全面抑制編碼核糖體蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，從而系統(tǒng)性地抑制翻譯，減弱病毒蛋白的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)植物對(duì)病毒的耐受性。NIK1協(xié)同LIMYB蛋白抑制系統(tǒng)性翻譯是一種新發(fā)現(xiàn)的植物抗病毒防御機(jī)制，證實(shí)了PTI信號(hào)途徑也能對(duì)植物病毒起抵抗作用。

1.2 效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫

FLOR在1971年提出了“基因?qū)颉奔僬f，認(rèn)為抗病是植物所具有的抗病基因和與之相應(yīng)的病原物的無毒基因（Avr gene）結(jié)合時(shí)才得以表現(xiàn)的[29]。植物宿主R基因在識(shí)別病原體編碼的無毒因子/效應(yīng)因子的過程會(huì)引起植物的高敏應(yīng)答，導(dǎo)致病原體侵入部位和周圍細(xì)胞的快速死亡或壞死，以防止病原體在植物中傳播，這種癥狀表現(xiàn)被稱為超敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）[30]。“基因?qū)颉奔僬f描述了植物的第2層防御系統(tǒng)ETI，而ETI的核心便是由R基因編碼的胞內(nèi)免疫受體R蛋白。NBS-LRR類基因是R基因的最大的一個(gè)類群，這類R基因最顯著的結(jié)構(gòu)特征就是含有胞內(nèi)核苷酸結(jié)合序列NBS和富含亮氨酸重復(fù)LRR序列。NBS-LRR類R基因亦可根據(jù)其編碼蛋白的N末端（TIR和CC）結(jié)構(gòu)域的不同分為兩類：TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR[29]，TIR和CC結(jié)構(gòu)域在宿主識(shí)別病原效應(yīng)子的過程中發(fā)揮重要作用。目前大多數(shù)已知的R蛋白均屬于TIR-NBSLRR或CC-NBS-LRR[29]。

煙草N基因是第一個(gè)鑒定出的R基因，對(duì)于TMV具有一定的抗性[31]。目前，大量的植物抗病毒R基因被克隆和鑒定，例如番茄中防御番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的Sw-5基因[32]，馬鈴薯中防御馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）的Rx1和Rx2基因[33-34]，擬南芥中防御煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）的RTM1和RTM2基因和抵御黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的RPP8/HRT家族的RCY1基因[35-37]。胞內(nèi)免疫受體Sw-5b可以識(shí)別TSWV運(yùn)動(dòng)蛋白的21個(gè)保守氨基酸的病毒效應(yīng)基序，進(jìn)而對(duì)該病毒進(jìn)行防御[32]。番茄Tm-1基因的編碼蛋白與病毒復(fù)制酶相互作用，擾亂病毒基因組復(fù)制，進(jìn)而對(duì)TMV產(chǎn)生顯著抗性[38]。在不斷的進(jìn)化過程中，病毒等病原微生物也會(huì)突變或產(chǎn)生新的效應(yīng)因子來逃避或者抑制植物的ETI，而植物也會(huì)進(jìn)化出新的R蛋白，再次激活ETI。植物與病原菌之間基因?qū)虻南嗷プ饔弥写嬖谥环N競(jìng)爭(zhēng)，同時(shí)也是一種平衡，從長(zhǎng)期的角度看，這種相互作用呈現(xiàn)Z字形的“拉鋸戰(zhàn)”局面[14]。

2 RNA沉默介導(dǎo)的植物抗病毒機(jī)制

RNA沉默（RNA silencing），是一種廣泛存在于植物、真菌、動(dòng)物和人等真核生物體內(nèi)的保守機(jī)制，具有特異性的核苷酸序列（21～30 nt小RNA）能夠?qū)е峦磎RNA降解、蛋白翻譯抑制、DNA甲基化，以及異染色質(zhì)形成的表觀遺傳學(xué)效應(yīng)[39]。小RNA誘發(fā)的基因沉默發(fā)生在兩種水平上，靶標(biāo)mRNA的特異性降解和蛋白質(zhì)翻譯抑制屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）；DNA甲基化、異染色質(zhì)化引起的沉默屬于轉(zhuǎn)錄基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）。RNA沉默現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是在1990年，JORGENSEN等[40]對(duì)矮牽牛導(dǎo)入色素合成相關(guān)的查爾酮合成酶基因，結(jié)果許多花朵的顏色變成白色或花白色。導(dǎo)入的基因和與其相似的內(nèi)源基因同時(shí)被沉默，被稱為共抑制現(xiàn)象（Co-suppression）。至今，30年的探索使植物RNA沉默的理論體系越來越成熟，RNA沉默技術(shù)也得到了更廣泛的應(yīng)用。

2.1 植物中病毒來源小RNA的生物合成

RNA沉默最顯著的特征就是能產(chǎn)生具有序列特異性調(diào)控功能的小RNA，長(zhǎng)度通常為21～30 nt。植物細(xì)胞中存在 miRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）、ta-siRNA（trans-acting small interfering RNA）和 natsiRNA（natural antisense siRNA）等內(nèi)源的小RNA分子[41]，其中最主要的是miRNA和siRNA。miRNA是長(zhǎng)度約21 nt的單鏈RNA分子，由植物內(nèi)源MIR基因編碼；siRNA是長(zhǎng)度約24 nt的單鏈RNA分子，沒有特定的編碼基因，是由處于異染色質(zhì)區(qū)的重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座元件等轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，由長(zhǎng)的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子切割產(chǎn)生[42]。近年來的小RNA組的高通量深度測(cè)序結(jié)果表明，植物細(xì)胞中80%以上的小RNA是siRNA[43]，其主要作用是維持基因組的完整性。

近幾年的研究表明，在病毒侵染的宿主植物中發(fā)現(xiàn)了大量的病毒來源的小RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）[44]。目前研究認(rèn)為vsiRNA的產(chǎn)生是病毒復(fù)制過程中形成的dsRNA或者內(nèi)部折疊形成的部分dsRNA被DCL（Dicer-like）蛋白加工形成的[45-47]。植物體內(nèi)存在4種DCL蛋白，負(fù)責(zé)加工不同的dsRNA產(chǎn)生不同的vsiRNA，其中DCL4和DCL2分別加工產(chǎn)生21 nt和22 nt的vsiRNA[48]。感染正鏈RNA病毒的植物體內(nèi)主要積累由DCL4加工產(chǎn)生的21 nt vsiRNA[46,49]，但是在dcl4功能缺失突變體中，主要積累由 DCL2加工的22 nt vsiRNA。野生型蕪菁皺縮病毒TCV編碼的沉默抑制子P38可以干擾DCL4的功能，所以在TCV感染的植物宿主中只積累依賴 DCL2的 22 nt vsiRNA[50]。而DCL3只有在 dcl2/dcl4雙突變體中加工出 24 nt的vsiRNA，因而推測(cè)DCL3在對(duì)抗RNA病毒過程中作用較小[51-53]。而在DNA病毒感染的植物中DCL3是最活躍的vsiRNA加工蛋白，擬南芥dcl3突變體感染雙生病毒的癥狀非常嚴(yán)重，而野生型和dcl2/dcl4雙突變體感染雙生病毒癥狀可以得到緩解，由此可見，DCL3對(duì)抵御DNA雙生病毒的重要性[51]。無論在RNA病毒還是DNA病毒中，DCL1只是協(xié)助其他幾個(gè)DCL蛋白，間接參與了vsiRNA的產(chǎn)生過程[54-55]。由于21 nt的vsiRNA主要參與RNA沉默介導(dǎo)的植物抗病毒防御，所以推測(cè)植物的DCL4蛋白在抗病毒過程中發(fā)揮最主要的作用[49-50,56]。

2.2 病毒誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默

2.2.1 vsiRNA對(duì)病毒基因組的調(diào)控 在病毒感染的植物細(xì)胞中，由DCL蛋白加工而成的vsiRNA被稱作初級(jí)vsiRNA。這些vsiRNA能夠被含有Argonaute（AGO）的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）招募，在ATP的參與下，siRNA解雙鏈，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與病毒基因組RNA結(jié)合，在AGO蛋白的剪切作用下，病毒RNA降解，從而抑制病毒的擴(kuò)散。被剪切的病毒基因組RNA片段利用植物宿主的RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDR）蛋白擴(kuò)增成新的dsRNA，繼而又被DCL蛋白識(shí)別加工成新的vsiRNA，被稱為次級(jí)vsiRNA。初級(jí)vsiRNA和次級(jí)vsiRNA借助植物的胞間連絲和維管系統(tǒng)被運(yùn)輸?shù)街車?xì)胞，或者長(zhǎng)距離運(yùn)輸，沉默信號(hào)被進(jìn)一步擴(kuò)散，進(jìn)而更加有效地限制病毒的復(fù)制和系統(tǒng)侵染[57-58]。

病毒基因組復(fù)制過程中能產(chǎn)生vsiRNA，同時(shí)vsiRNA對(duì)病毒基因組具有反饋調(diào)節(jié)作用。AGO-RISC沉默復(fù)合體對(duì)于vsiRNA對(duì)靶基因的剪切過程發(fā)揮重要的作用[56]。擬南芥中鑒定出10種AGO蛋白[59]，在番茄（Solanum lycopersicum）中鑒定出15個(gè)AGO蛋白[60-61]，在本氏煙草中鑒定出9個(gè)AGO同源物[62]。擬南芥AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO7和AGO10可以結(jié)合vsiRNA，從而參與抗病毒防御[51,63-64]。 已有研究顯示，AGO1在植物抗病毒防御中可能起著最重要作用[58]，AGO2可輔助AGO1發(fā)揮功能[65]。然而，本氏煙草的AGO2在抗番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）的沉默作用中起著關(guān)鍵作用[66]。此外，AGO4在感染CMV的本氏煙草中體現(xiàn)了抗病毒功能[67]，AGO18在水稻防御水稻條紋病毒（Rice stripe tenuivirus，RSV）和水稻矮縮病毒（Rice dwarf phytoreovirus，RDV）過程中發(fā)揮重要作用[64]。有研究表明，不同AGO蛋白復(fù)合物對(duì)小RNA的招募與其5’端的首位堿基有關(guān)[68-70]。AGO1主要識(shí)別首位堿基為“U”的小RNA，如大多數(shù)miRNA；AGO2和AGO4偏好首位堿基為“A”的小RNA；AGO5主要識(shí)別首位堿基為“C”的小RNA。在抗病毒過程中，AGO蛋白在招募vsiRNA時(shí)是否遵循同樣的規(guī)律則需進(jìn)一步的研究。

2.2.2 病毒編碼的RNA沉默抑制因子 為了抵抗RNA沉默介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制，許多植物病毒進(jìn)化產(chǎn)生了具有RNA沉默抑制活性的蛋白，使病毒得以躲避宿主的防御機(jī)制，侵染并復(fù)制，這類蛋白即病毒編碼的RNA沉默抑制因子（Viral suppressor of RNA silencing，VSR）[71-74]。VSR能夠提高病毒侵染寄主的成功率，決定著植物病毒致病性的強(qiáng)弱，所以又被稱為病毒的致病因子和癥狀決定因子，VSR本身也為證明RNA沉默的抗病毒機(jī)制提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[75]。VSR種類豐富，可以通過干擾RNA沉默的各個(gè)階段破壞植物的防御機(jī)制，產(chǎn)生一種反防御，從而導(dǎo)致病毒RNA積累[52]。馬鈴薯 Y病毒（Potato virus Y，PVY)的HC-Pro（Helper component-proteinase）蛋白是第一個(gè)被鑒定的VSR，也是病毒傳播和系統(tǒng)性運(yùn)動(dòng)所必要的蛋白酶的輔助組分[76]。黃顯德等[77]通過構(gòu)建番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）的全長(zhǎng)侵染性克隆及其突變體，分析了HC-Pro中調(diào)控病毒致病力的保守氨基酸位點(diǎn)，獲得了弱毒突變體，并發(fā)現(xiàn)弱毒突變體中病毒蛋白的積累水平確實(shí)均顯著低于野生型病毒，顯示HC-Pro在調(diào)控病毒致病力發(fā)揮著重要的功能。鄧竹根等[75]通過轉(zhuǎn)化本氏煙草鑒定了草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）的致病因子P6蛋白。VALLI等[78]的研究表明黃瓜黃脈病毒（Cucumber vein yellowing virus）的沉默抑制子P1b蛋白能夠特異性結(jié)合21 nt siRNA，阻礙其行使抗病功能?；诘鞍谆プ鲗?shí)驗(yàn)，GONZALEZ等研究發(fā)現(xiàn)CMV的2b蛋白可以與AGO蛋白結(jié)合，阻止AGO蛋白對(duì)vsiRNA的切割，進(jìn)而阻斷病毒誘導(dǎo)的基因沉默過程[79]。

2.2.3 vsiRNA對(duì)宿主轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控 vsiRNA指導(dǎo)AGO-RISC沉默復(fù)合體對(duì)病毒RNA的序列特異性剪切作用，同時(shí)也可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)靶向宿主基因，指導(dǎo)AGO-RISC沉默復(fù)合體對(duì)宿主基因進(jìn)行特異性剪切引起PTGS。植物病毒的這種致病機(jī)制也逐步被證實(shí)，近年來的深度測(cè)序技術(shù)也證實(shí)了此類致病機(jī)制，研究中獲得的大量20～24 nt的siRNA可以比對(duì)到病毒基因組序列中，且存在明顯的熱點(diǎn)區(qū)域[80]?；ㄒ嘶ㄈ~病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）的35S的前導(dǎo)序列是產(chǎn)生vsiRNA熱點(diǎn)區(qū)域，其中一段20 nt的序列與擬南芥Atlg76590基因的5’UTR區(qū)域幾乎完全互補(bǔ)配對(duì)，在受CaMV侵染的擬南芥中，Atlg76590基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明了CaMV的vsiRNA對(duì)擬南芥基因的調(diào)控作用[55]。CMV的侵染可引起宿主的黃化癥狀，測(cè)序發(fā)現(xiàn)該病毒的衛(wèi)星RNA來源的vsiRNA特異靶向了1個(gè)葉綠素生物合成的相關(guān)基因（CHLI）的22 nt序列，導(dǎo)致CHLI基因的顯著下調(diào)，破壞了葉綠素生物合成途徑，從而引起黃化癥狀[81]。早期研究認(rèn)為病毒侵染植物引發(fā)的病癥主要是VSR對(duì)宿主發(fā)育功能相關(guān)的重要的內(nèi)源siRNA的調(diào)控作用[82-84]，近年來研究發(fā)現(xiàn)vsiRNA可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)靶向宿主基因，引起宿主基因的沉默，影響宿主發(fā)育，形成各類病毒感染癥狀。與此同時(shí)，不同的VSR也可能抑制vsiRNA對(duì)潛在宿主靶標(biāo)的調(diào)控。此外，vsiRNA對(duì)于宿主基因表達(dá)的調(diào)控程度也可能取決于vsiRNA的豐度[85]。

2.3 病毒誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因沉默

近來也有研究指出，siRNA介導(dǎo)的甲基化所引起的TGS也是抵抗DNA病毒的一種防御方式[86]。由DCL3參與加工而形成的24 nt siRNA是一些甲基化轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase）活化的起始信號(hào)。siRNA與AGO4、AGO6或AGO9結(jié)合，介導(dǎo)甲基化轉(zhuǎn)移酶使DNA區(qū)域包含胞嘧啶-鳥嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)（稱為CG島）、CNG（N：A/T/G/C）和CHH（H：A/T/C）中的胞嘧啶核苷C與組蛋白H3亞基的第9個(gè)賴氨酸K（lysine residue K9 in histone H3，H3K9）發(fā)生甲基化，基因表達(dá)因此而受到抑制，即siRNA在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了基因的表達(dá)[87-88]。植物利用siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化作為對(duì)雙生病毒的表觀遺傳的防御，擬南芥甲基化缺陷型突變體對(duì)雙生病毒更易感[89-90]。一些DNA病毒可通過干擾對(duì)甲基循環(huán)中的關(guān)鍵蛋白DCL3、AGO4等來抑制TGS過程[53]。雙生病毒成員中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（T omato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的β衛(wèi)星編碼的蛋白βC1致病因子通過抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH）的活性靶向甲基化循環(huán)，來穩(wěn)定雙生病毒/β衛(wèi)星RNA復(fù)合體，最終誘發(fā)病癥[91]。雙生病毒還可以通過降低甲基轉(zhuǎn)移酶1（Methyltransferase 1，MET1）和植物甲基化周期的關(guān)鍵酶染色體甲基化酶3（Chromomethylase 3，CMT3）的轉(zhuǎn)錄水平，來干擾病毒感染宿主的DNA甲基化機(jī)制[92]。

3 展望

植物的先天免疫系統(tǒng)和RNA沉默介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制是目前研究比較清楚的兩條抗病毒途徑，能夠抑制病毒的增殖和系統(tǒng)侵染。同時(shí)，病毒也通過不斷變異和編碼VSR對(duì)植物進(jìn)行反防御。病毒的VSR既能夠作為效應(yīng)因子破壞植物的第1層免疫系統(tǒng)，又能夠作為沉默抑制子干擾RNA沉默，是病毒致病性強(qiáng)弱的重要決定因子。近年來植物的抗病毒防御研究取得了重大進(jìn)展，但是關(guān)于病毒的致病性策略和植物防御之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系等關(guān)鍵問題，仍尚不明晰。例如，并不清楚能夠引起植物PTI防御的病毒PAMP是什么，能夠識(shí)別病毒的PRR尚未被確定。植物的R基因與病毒的效應(yīng)因子互作后，如何引起系統(tǒng)性抗性需要進(jìn)一步研究。當(dāng)前，有關(guān)vsiRNA在翻譯水平上起抑制作用的抗病研究報(bào)道還非常少。此外，病毒-植物相互作用可以調(diào)節(jié)植物激素通路，引起激素介導(dǎo)的防御反應(yīng)，如水楊酸信號(hào)、茉莉酸信號(hào)和油菜素內(nèi)酯信號(hào)。植物還可以通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）作為抗病毒防御策略[28,93]。不同的防御途徑之間相互交叉，協(xié)同作用。第1層免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白LRR-RLK能夠參與水楊酸信號(hào)、油菜素內(nèi)酯信號(hào)和脫落酸等植物激素信號(hào)途徑[94]。番茄斑點(diǎn)枯萎病毒的vsiRNA能夠靶向多種編碼抗性相關(guān)蛋白的基因，如CC-NBS-LRR蛋白、AP2乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子和熱激轉(zhuǎn)錄因子A3[95]。然而，未來植物抗病毒相關(guān)研究不但在于對(duì)已知防御策略的深入研究，還在于整合不同的植物防御策略（RNA沉默、先天免疫和激素信號(hào)），這些防御策略的協(xié)同作用有望確保對(duì)病毒產(chǎn)生更加強(qiáng)大而持久的防御反應(yīng)。