沙棘果多酚提取工藝優(yōu)化及其抗阿爾茨海默癥活性

,2,*

(1.佳木斯大學藥學院,黑龍江佳木斯 154007;2.黑龍江中醫(yī)藥大學中藥學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬多年生落葉灌木或小喬木,別名醋柳、黑刺,主要分布在歐亞大陸地區(qū),我國是世界上沙棘資源蘊藏量最豐富的的國家,占世界總面積的95%以上,素有“沙棘王國”之稱[1]。沙棘果含有豐富的多糖、黃酮、酚類化合物、脂肪酸等生物活性成分[2-5],具有抗氧化、抗菌、抗炎、護肝等功效[6-9]。多酚是一類多羥基酚及其衍生物的次級代謝產(chǎn)物,對人體健康有保護作用,其鄰位酚羥基極易被氧化,具有良好的抗氧化活性。隨著天然產(chǎn)物開發(fā)利用的興起,多酚由于其獨特的功能結(jié)構(gòu)和生理活性被廣泛關(guān)注[10]。

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種慢性神經(jīng)中樞系統(tǒng)退行性疾病,主要特征表現(xiàn)為癡呆和大腦中神經(jīng)元細胞的損傷,嚴重威脅老年人身體健康和生活質(zhì)量,隨著世界人口老齡化的發(fā)展,已經(jīng)成為當今世界亟需解決的重大難題[11]。AD病因和病程尚未明確,臨床上的治療手段只能改善AD患者癥狀,并不能達到治療的效果,目前仍缺乏有效預防和治療的藥物及方法[12]。而整體綜合調(diào)治,多環(huán)節(jié)、多系統(tǒng)、多靶點發(fā)揮作用正是中醫(yī)藥的特點和優(yōu)勢[13]。

目前國內(nèi)外關(guān)于SBP的研究主要集中在成分鑒定和心臟保護等方面,關(guān)于抗AD的活性研究鮮見報道,本實驗采用超聲波輔助提取,通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法對SBP提取工藝進行優(yōu)化,并通過藥理實驗探索SBP的抗AD活性,為天然植物抗AD成分研究及研制新型高效低毒抗AD藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠 雄性,8周齡,(20±2) g,60只,由佳木斯大學動物實驗中心提供,動物許可證號SYXK(黑)2013-001;沙棘果 佳木斯民生藥行提供;奧拉西坦膠囊 石藥建團歐意藥業(yè)有限公司;乙酰膽堿酯酶測定試劑盒、乙酰膽堿測定試劑盒、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;酒石酸亞鐵 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化鋁 天津市凱通化學試劑有限公司;D-半乳糖 北京化學試劑公司;以上試劑均為分析純。

FA2004型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;DL-5-B型離心機 上海安亭科學儀器廠;765紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FC型酶標儀 賽默飛世爾儀器有限公司;Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司;XSP-13C-LP顯微鏡 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘果多酚的提取 準確稱取1.0 g沙棘果粉于50 mL具塞錐形瓶中,加入10 mL體積分數(shù)60%乙醇,超聲提取20 min,以4000 r/min離心10 min,收集上清液,得沙棘果多酚粗提液。

1.2.2 多酚提取量的測定 以沒食子酸為標準品,選用酒石酸亞鐵法測定多酚含量[14],在540 nm波長處測其吸光度,重復3次,以吸光度A為縱坐標,質(zhì)量濃度C為橫坐標,繪制標準曲線。按照回歸方程計算得提取液中多酚含量。計算多酚提取量。計算公式如下:

式中:C表示總酚質(zhì)量濃度,mg/mL;N表示稀釋倍數(shù);V表示提取液體積,mL;M表示沙棘粉質(zhì)量,g/DW。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 固定超聲功率200 W和提取溫度50 ℃,分別采用體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,超聲時間30 min,液料比20∶1 mL/g,提取3次,考察不同體積分數(shù)乙醇溶液對沙棘果乙醇提取物提取量的影響;采用最佳體積分數(shù)乙醇,超聲時間分別為10、20、30、40、50 min,液料比20∶1 mL/g,提取3次,考察不同超聲時間對沙棘果乙醇提取物提取量的影響;采用最佳體積分數(shù)乙醇,最佳超聲時間,液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g,提取3次,考察不同液料比對對沙棘果乙醇提取物提取量的影響。

1.2.4 星點設(shè)計優(yōu)化提取工藝 根據(jù)前期實驗篩選,本實驗主要考察乙醇濃度(%)、超聲時間(min)、液料比三個因素對多酚提取量的影響,進行單因素實驗。使用Design-Expert 8.0.6軟件,采用星點設(shè)計分析方法進行工藝優(yōu)化,水平取值用0、±1、±α代碼表示,實驗時再轉(zhuǎn)化為實際操作值。三因素的星點設(shè)計α=1.732,因素水平見表1,綜合單因素實驗結(jié)果,以乙醇濃度(A)、超聲時間(B)和液料比(C)為自變量,多酚提取量為因變量,進行星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化實驗。

表1 星點設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels used in CCD-RSM

1.2.5 沙棘果多酚抗AD作用考察

1.2.5.1 沙棘果多酚純化 按照前文優(yōu)化的最佳條件制備粗提液,取層析柱,加入400 g經(jīng)乙醇活化的AB-8大孔吸附樹脂,保證柱內(nèi)無氣泡并用蒸餾水水沖至柱內(nèi)無乙醇,取25 mL粗提液,緩慢倒入層析柱中,蒸餾水洗脫后,以60%的乙醇洗脫,分別收集洗脫液,減壓(0.95 MPa)濃縮至約為原體積的五分之一,經(jīng)冷凍干燥得多酚提取物[15]。

1.2.5.2 動物分組及給藥 小鼠置于標準條件下(室溫23±1 ℃),濕度40%～60%,光照/暗循環(huán)12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機分為空白組、模型組、陽性組、SBP高、中、低劑量組,每組10只。常規(guī)飼養(yǎng),進食前除空白組小鼠外各組腹腔注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1(生理鹽水配制)和灌胃AlCl320 mg·kg-1·d-1(雙蒸水配制)造模[16],空白組注射等量生理鹽水和灌胃等量雙蒸水,連續(xù)60 d。造模同時給藥,陽性組灌胃給予奧拉西坦260 mg·kg-1·d-1[17]，模型組和空白組灌胃給予等量雙蒸水[18]按生藥材劑量灌胃給藥,高劑量組1.214 g·kg-1·d-1,中劑量組0.607 g·kg-1·d-1,低劑量組0.303 g·kg-1·d-1,每天1次。

1.2.5.3 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗分為定位航行試驗和對位空間探索實驗[19]。定位航行試驗:主要評價小鼠的學習能力,給藥后第55 d開始進行定位航行實驗,在第一象限放置隱蔽平臺,選任一位置將小鼠面向池壁放入水池,記錄小鼠從入水至爬上隱蔽平臺所需的時間,即為逃避潛伏期。如1 min內(nèi)小鼠未找到隱蔽平臺,則將小鼠引導至平臺并停留10 s,并將逃避潛伏期記錄為1 min。每天訓練4次,連續(xù)訓練5 d,每天固定時間段訓練。對位空間探索實驗:主要評價小鼠的記憶能力。給藥60 d后進行對位空間探索實驗,即將隱蔽平臺撤掉,在原放置平臺的對位象限處放入小鼠,記錄小鼠首次進入原平臺位置的時間,即探索潛伏期,并記錄1 min內(nèi)大鼠進入原平臺區(qū)的次數(shù),即探索次數(shù)[20]。

1.2.5.4 小鼠大腦生化指標測定 水迷宮實驗結(jié)束后,禁食24 h,脫頸處死,取小鼠大腦,加入9倍預冷的生理鹽水勻漿,4 ℃下12000 r/min離心20 min,取上清液,嚴格按ELISA試劑盒說明書測定各組動物大腦中乙酰膽堿(Ach)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)及乙酰膽堿酯酶(AchE)含量。

1.2.5.5 組織病理切片 取小鼠全腦,用10%甲醛PBS緩沖溶液(0.1 mol/mL)浸泡48 h固定,石蠟包埋,HE染色,使用二甲苯透明,中性樹膠封片。100倍顯微鏡鏡檢,圖像采集分析,觀察海馬結(jié)構(gòu)病理變化[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

根據(jù)“1.2.2”項下方法,以質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標,以吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程為Y=0.2133X-0.0513(R2=0.9967),表明沒食子酸在0.5～2.5 mg/mL呈良好線性關(guān)系,可用于多酚含量計算。結(jié)果見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 單因素實驗結(jié)果

圖2 乙醇濃度對沙棘果多酚提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol concentrationon the contents of SBP

乙醇濃度對沙棘果多酚提取量的影響結(jié)果見圖2,由圖2可知,多酚提取量隨乙醇濃度增加呈先增加后減少的趨勢,當乙醇濃度為70%時提取量最高?？赡芤驗镾BP結(jié)構(gòu)復雜,極性跨度較大,溶劑的極性對多酚提取量有較大影響[22]。超聲時間對沙棘果多酚提取量的影響如圖3所示,當超聲時間為10～50 min時,多酚提取量隨超聲時間增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當超聲時間為30 min時,多酚提取量最高,這可能是因為超聲時間過長可能會導致多酚類物質(zhì)發(fā)生分解,聚合等副反應(yīng)[23]。液料比對沙棘果多酚提取量的影響如圖4所示,隨液料比增加多酚提取量先增加后減少,當液料比為20∶1時提取量最高,可能是液料比達到20∶1 mL/g時,溶劑對多酚的溶解基本達到飽和。

圖3 超聲時間對沙棘果多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on the contents of SBP

圖4 料液比對沙棘果多酚提取量的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratioon the contents of SBP

2.3 多元二次回歸模型的建立

表2 CCD-RSM設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of CCD-RSM

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 Variance analysis of binomial fitting

注：**表示極顯著差異(P<0.001),*表示顯著性差異(P<0.05)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化與預測

效應(yīng)面圖是在各因素交互作用下得到的結(jié)果,根據(jù)二次多項式模型固定三個變量中的任意變量,其值取中值,繪制歸一值與令兩個變量之間的3D效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖5,從效應(yīng)面圖可以判斷最佳點均落在試驗考察區(qū)域內(nèi),根據(jù)曲面的傾斜度以及顏色變化可知超聲時間與乙醇濃度兩因素對響應(yīng)值影響最大,根據(jù)等高線的疏密程度以及形狀可知超聲時間和乙醇濃度兩因素交互作用最大,根據(jù)所得模型確定最佳工藝條件為乙醇濃度71.23%,超聲時間31.54 min,液料比20.26∶1 mL/g,在此優(yōu)化條件下多酚提取量為3.1047 mg/g。

圖5 各因素交互作用對多酚提取量影響的效應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on polyphenal yield

表4 定位航行實驗結(jié)果Table 4 Positioning navigation test results

注：與模型組比較,*差異顯著P<0.05,**差異極顯著P<0.01;與空白組比較,#差異顯著P<0.05,##差異極顯著P<0.01;表6～表7同。

2.5 驗證試驗

結(jié)合優(yōu)化結(jié)果和實際操作,選擇乙醇濃度71%、液料比20∶1 mL/g、提取時間32 min為最佳條件,按上述條件進行3組平行試驗,提取量均值為3.0813 mg/g,RSD=1.65%,表明該提取工藝穩(wěn)定重現(xiàn)性好。

2.6 沙棘果多酚抗AD活性

2.6.1 沙棘果多酚的純化 取純化后所得多酚提取物,按“1.2.2”項下進行多酚含量測定,多酚含量可達58.3%。

2.6.2 Morris水迷宮實驗

2.6.2.1 定位航行試驗 如表4所示,與空白組比較,第54、57～60 d模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05),說明模型組小鼠學習能力減弱,表明造模成功;與模型組相比,第57 d,陽性組和SBP高劑量組小鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05);第59 d,陽性組和SBP高劑量組小鼠逃避潛伏期極顯著縮短(P<0.01),SBP中劑量組和SBP低劑量組逃避潛伏期有所縮短,無顯著性差異,SBP對小鼠的學習能力有改善作用,高劑量組活性最好。

2.6.2.2 空間探索實驗 如表5所示,與空白組比較,模型組小鼠探索潛伏期顯著縮短,探索次數(shù)顯著減少(P<0.05);說明模型組小鼠記憶能力減弱出現(xiàn)記憶障礙,表明造模成功,與模型組相比,陽性藥組、SBP高劑量組和SBP中劑量組小鼠探索潛伏期顯著延長,探索次數(shù)顯著增加(P<0.05);SBP低劑量組小鼠探索潛伏期有所延長,探索次數(shù)有所增加,無顯著性差異,SBP對小鼠記憶能力有很好的改善作用,其中高劑量和中劑量組活性較好。

表6 各組小鼠腦內(nèi)Ach、AchE和ChAT含量Table 6 Contents of Ach,AchE and ChAT in brain of rats in each group

表5 空間探索實驗結(jié)果Table 5 Space exploration experiment results

2.6.3 小鼠腦內(nèi)Ach、AchE和ChAT含量的測定 如表6所示,與空白組比較,模型組小鼠腦中Ach和ChAT含量極顯著降低,AchE含量極顯著升高(P<0.01),說明小鼠膽堿能系統(tǒng)功能紊亂,表明造模成功;與模型組比較,陽性組小鼠腦內(nèi)Ach和ChAT含量極顯著性升高,AchE含量極顯著性降低(P<0.01);SBP高劑量組Ach含量極顯著升高,AchE含量極顯著降低(P<0.01),ChAT含量顯著升高(P<0.05);SBP中劑量組小鼠腦內(nèi)AchE含量顯著性降低,ChAT含量顯著性升高(P<0.05);SBP低劑量組Ach和ChAT含量有所升高、AchE含量有所降低,無顯著性差異,SBP對膽堿能系統(tǒng)具有很好的調(diào)節(jié)作用,高劑量組活性較好。

2.7 病理觀察

由圖6可知,空白組和陽性藥物組海馬神經(jīng)元排列緊密,數(shù)量較多,形態(tài)完整,染色正常,未出現(xiàn)壞死;模型組海馬神經(jīng)細胞明顯稀疏,出現(xiàn)大面積壞死,著色較深;SBP高劑量組海馬神經(jīng)細胞排列規(guī)則,無明顯病變;SBP中劑量組海馬細胞少量損傷和凋亡,細胞排列較整齊,著色較深;SBP低劑量組海馬細胞出現(xiàn)一定程度的損傷或凋亡,結(jié)果表明SBP能抑制小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡,其中高劑量組活性最佳。

圖6 小鼠海馬HE病理變化情況Fig.6 HE staining pathologic changes of mice hippocampus

3 討論與結(jié)論

本實驗通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化得到SBP最佳提取工藝為乙醇濃度71%,超聲時間32 min,液料比20∶1 mL/g,多酚提取量為3.0813 mg/g,高于已報到SBP提取量1.8%[24]。Ach是主要的神經(jīng)遞質(zhì),在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有重要作用,其能刺激膽堿能功能已被證明[25],ChAT參與Ach的合成過程,AchE參與Ach的水解過程。當腦內(nèi)Ach含量不足時會導致膽堿能系統(tǒng)障礙造成學習記憶障礙[26]。本實驗采用D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘發(fā)AD動物模型,探究SBP對AD模型小鼠學習記憶能力的改善作用,水迷宮實驗結(jié)果表明SBP能夠改善AD小鼠的學習記憶能力,可能與其對海馬神經(jīng)元的保護作用及對膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用有關(guān)[27-28]。長期大量的D-半乳糖和三氯化鋁的攝入會導致膽堿能系統(tǒng)紊亂和海馬神經(jīng)細胞損傷[29],SBP對AD動物模型引起的Ach和ChAT含量降低及AchE含量上升有良好的調(diào)節(jié)作用,SBP能通過調(diào)節(jié)ChAT和AchE水平影響Ach的合成與水解,恢復膽堿能系統(tǒng)生理功能;病理觀察結(jié)果表明SBP能抑制小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡;SBP可通過調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)和保護海馬神經(jīng)細胞發(fā)揮抗AD活性,其具體機制尚不明確,可以繼續(xù)通過深入的結(jié)構(gòu)特征、藥理機制和構(gòu)效關(guān)系等研究加以證實。