采后番木瓜果實(shí)炭疽病病原菌分離鑒定及其拮抗菌的篩選

王雅君1,邵遠(yuǎn)志1,何文琪1,尤文靜1,葛春暉1,李 雯

(1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南?？?570228;2.海南大學(xué)園藝學(xué)院,海南?？?570228)

番木瓜(CaricapapayaL.)又稱木瓜、乳瓜、萬壽果,是著名的熱帶和亞熱帶水果之一,我國番木瓜主要種植于廣東、海南、廣西、云南、福建、臺灣等地[1]。番木瓜營養(yǎng)豐富,含多種維生素,具有抗氧化活性,有“百益果王”之稱[2]。除此之外,番木瓜有一定的藥用價(jià)值,可助消化、健脾胃[3],具有預(yù)防高血壓以及防癌的保健功效[4],故深受消費(fèi)者的喜愛。番木瓜屬于呼吸躍變型果實(shí),采后成熟衰老快、易受生物和非生物脅迫的影響等特點(diǎn)[5],因此,番木瓜采后及貯藏運(yùn)輸過程中常出現(xiàn)果實(shí)發(fā)病腐爛等問題。有研究表明,番木瓜采后腐爛的原因主要受到真菌的侵染作用[6],現(xiàn)已在番木瓜果實(shí)上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15種以上的致病真菌,其中由炭疽菌(Colletotrichumsp.)引起的炭疽病是番木瓜采后貯藏與運(yùn)輸?shù)闹饕『χ籟7-8]。在海南,番木瓜受炭疽病菌的侵染率為20.3%～34.4%[9],由此造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前,防治番木瓜采后病害的有效措施是使用化學(xué)殺菌劑,這其中常用的化學(xué)殺菌劑有特克多、多菌靈、苯來特和甲基托布津等[10]。但長期高濃度使用化學(xué)殺菌劑可誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性,其藥物殘留也對人類健康也有直接威脅[11-12]。生物防治作為一種新型、綠色、安全、能有效控制采后病害的途徑深受研究者們的關(guān)注[13]。生防菌在減少和替代化學(xué)殺菌劑的使用方面有著較大的潛力[14],其中,芽孢桿菌是目前研究最多的生防菌之一[15-16]。大量研究表明,芽孢桿菌能有效控制熱帶果實(shí)采后病害的發(fā)生,如芒果炭疽病[17]、香蕉枯萎病[18]、枇杷腐爛病及炭疽病[19]等,目前少有芽孢桿菌防控采后番木瓜病害的研究。

本研究從番木瓜炭疽病病果中分離鑒定了一株新型海南地區(qū)番木瓜炭疽病病原菌。針對此病原菌,從果園土壤中分離篩選得到一株拮抗效果較好的拮抗菌,在果實(shí)上進(jìn)行了活體拮抗驗(yàn)證試驗(yàn),并對可能涉及的拮抗機(jī)理進(jìn)行初步研究,以期為番木瓜采后病害的生物防治技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)病番木瓜果實(shí) 從海南省?？?、瓊海番木瓜種植地采集;番木瓜 “日升”,挑選健康、大小一致的果實(shí),7～8成熟,海南省海口市南北水果市場選購;供試土壤 于2018年4月17日和7月13日從海南省?？?、瓊海果園采集12種不同果樹根系5～20 cm的土壤,密封分裝后,立即帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃保存,用于拮抗菌的分離;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose ager,PDA) 新鮮去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,1000 mL蒸餾水;牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 牛肉浸膏3 g,細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g,NaCl5 g,瓊脂18 g,1000 mL蒸餾水,培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min后待用;Ezup柱式真菌、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)體系各種試劑 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑 均為分析純。

BCM-1000生物凈化工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;ZEALWAYGR60DA高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司;Nikon ECLIPSE Ci-s/Ci-L顯微鏡 南京衡橋儀器有限公司;FYL-YS-280L恒溫培養(yǎng)箱 北京福意電器有限公司;NRY-211恒溫培養(yǎng)搖床 上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;AL-204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BIC-300人工氣候箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣液的制備 拮抗菌懸液:拮抗菌于28 ℃、200 r/min牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液于10000 r/min離心10 min,棄上清后用無菌水重懸,得到菌懸液用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)所需濃度。

無細(xì)胞濾液:將發(fā)酵液離心后,取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后獲得。

滅菌液:將發(fā)酵液于121 ℃滅菌20 min獲得。

病原菌孢子懸液:采用無菌接種環(huán)小心刮取病原菌菌體并接種于15 mL無菌水中,隨后用紗布過濾,并使用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)濃度至1×107孢子/mL。

1.2.2 番木瓜炭疽病病原菌的分離純化 參照袁雪等[20]的方法并稍作修改,用無菌小刀切取果實(shí)病健交界處5 mm×5 mm見方的果皮,依次用75%(V/V)的乙醇和1%(V/V)的次氯酸鈉浸泡30 s,隨后用無菌水清洗3次,濾紙吸干水分后置于PDA培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)3～5 d。待長出菌落后,挑取少量邊緣菌絲植入新的PDA培養(yǎng)基中,重復(fù)上述操作直至獲得純化菌株。將純化后的菌株保存于PDA斜面中,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 致病性檢驗(yàn) 選取健康、大小一致的番木瓜用1%(V/V)的次氯酸鈉消毒1 min后用自來水沖凈、晾干。用打孔器(直徑為8 mm)在番木瓜表面刺2個(gè)1 mm深的傷口,吸取25 μL用無菌蒸餾水配制的1×107孢子/mL病原菌孢子懸浮液接種于番木瓜傷口處,以接種等量無菌水作為對照,果實(shí)置于溫度25 ℃、相對濕度為90%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,每天記錄發(fā)病情況并計(jì)算發(fā)病率。取明顯發(fā)病的果實(shí),按照1.2.1的方法進(jìn)行病原菌再分離,觀察是否與初始分離菌株一致。其中發(fā)病率計(jì)算公式如下:

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 病原菌形態(tài)特征及初步鑒定 將純化后的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上于28 ℃下培養(yǎng),記錄菌落形態(tài)特征,在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子及孢子梗形態(tài),參照《真菌鑒定學(xué)手冊》[21]進(jìn)行病原菌初步鑒定。

1.2.4.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定 采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌DNA,使用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,序列測定委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.4.3 序列分析 將測序結(jié)果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對,并結(jié)合數(shù)據(jù)庫中的同源序列,利用MEGA6.0軟件中的Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性研究

1.2.5.1 溫度對病原菌生長及產(chǎn)孢能力的影響 取于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的病原菌,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于PDA中央,分別置于10、15、20、25、30、35和40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.5.2 光照、pH對病原菌生長及產(chǎn)孢能力的影響 取于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的病原菌,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于PDA中央,分別置于28 ℃條件下以全光照、全黑暗和12 h光暗交替3種光照處理,5 d后測量菌落直徑和產(chǎn)孢量。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基pH分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10和11,待平板凝固后將直徑為5 mm的菌餅放置于平板中央,PDA平板于28 ℃培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.5.3 不同碳源對病原菌生長及產(chǎn)孢能力的影響 參照楊秀梅等[22]的方法,分別以葡萄糖、D-果糖、D-麥芽糖、山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉和D-半乳糖作為碳源加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于平板中央,于28 ℃培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.6 拮抗菌的分離純化 參照冉繼平等[23]的方法并稍加修改,取10 g土壤樣品放入90 mL無菌水中于28 ℃、100 r/min搖床振蕩2～3 h,采用平板稀釋法,將泥樣稀釋至10-3、10-4、10-5,涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取形態(tài)各異的單菌落進(jìn)行平板劃線分離,直至獲得單一菌落,于4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.7 拮抗菌的篩選 通過平板對峙實(shí)驗(yàn)對拮抗菌進(jìn)行初篩,采用濾紙片法[24]對初篩菌株進(jìn)行復(fù)篩,測量抑菌帶半徑并計(jì)算拮抗指數(shù),對拮抗效果最好的菌株進(jìn)行保存。拮抗指數(shù)計(jì)算公式如下:

1.2.8 拮抗菌鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]觀察拮抗菌形態(tài)特征,結(jié)合生理生化特性對拮抗菌W-2進(jìn)行初步鑒定。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對拮抗菌進(jìn)行測序,將序列結(jié)果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對分析,利用MEGA6.0軟件中的Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.9 拮抗菌對病原菌菌絲生長的影響 取于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的病原菌,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于PDA中央,參照Guardado等[26]的方法,將篩選出的拮抗菌W-2配制成濃度為1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL的菌懸液,將4片無菌濾紙片浸泡不同菌懸液后分別放置于距菌餅約30 mm處,PDA平板于28 ℃培養(yǎng)5 d,觀察菌絲生長情況并測量抑菌圈半徑。

1.2.10 拮抗菌對病原菌孢子萌發(fā)的影響 參照Li等[27]的方法并稍加修改,在10 mL離心管中加入100 μL用無菌蒸餾水配制的1×107孢子/mL病原菌孢子懸浮液,再加入等量的4個(gè)濃度為1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL的拮抗菌懸液和無菌水,于28 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng),分別在6和12 h后通過顯微鏡400×鏡下觀察100個(gè)孢子的萌發(fā)情況,一般孢子芽管長度為孢子長度的1.5倍時(shí)視為萌發(fā)。孢子萌發(fā)率計(jì)算公式如下:

1.2.11 拮抗菌不同組分對病原菌的影響 將4片無菌濾紙片分別浸泡濃度為1×108CFU/mL的發(fā)酵液、1×108CFU/mL菌懸液、無細(xì)胞濾液、滅菌液和無菌水后分別放置于距菌餅約30 mm處,以無菌水作為對照。病原菌接種方法、培養(yǎng)條件及測量方法同1.2.5。

1.2.12 番木瓜果實(shí)上拮抗菌對番木瓜炭疽菌的抑制效果 將番木瓜果實(shí)按照1.2.2的方法清洗、晾干后,用無菌打孔器(直徑為8 mm)在果身刺2個(gè)1 mm深的傷口,將果實(shí)分為3組:A組:只接種50 μL無菌水,作為對照;B組:接種25 μL無菌水和25 μL濃度為1×107CFU/mL病原菌孢子懸液;C組:接種25 μL濃度為1×108CFU/mL拮抗菌懸液和25 μL濃度為1×107CFU/mL病原菌孢子懸液。將處理后的3組果實(shí)放置于25 ℃、相對濕度為90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后,觀察并記錄果實(shí)的病斑直徑和發(fā)病率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用Excel處理,使用GraphPad Prism 5軟件繪圖,采用SPSS 17.0軟件中的Duncan法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜炭疽病病原菌鑒定結(jié)果與致病性檢驗(yàn)分析

2.1.1 番木瓜炭疽病病原菌初步鑒定 在PDA培養(yǎng)基上分離純化得到番木瓜炭疽病病原菌,將其命名為WT-1。病原菌菌落呈圓形(圖1A),菌絲生長速度較為緩慢,約5～7 d長滿平板。菌絲生長初期為白色,后期變?yōu)榛野咨?背部褐色至黑色(圖1B)。通過光學(xué)顯微鏡觀察,菌絲有隔膜,多分支(圖1C)。病原菌在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)第5 d產(chǎn)孢,分生孢子堆為黃褐色,分生孢子呈橢圓形,單孢,中部有1個(gè)油球,內(nèi)含物為顆粒狀(圖1D)。根據(jù)《真菌鑒定學(xué)手冊》,初步鑒定其為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)。

圖1 病原菌WT-1第5d菌落形態(tài)和在顯微鏡下菌絲和分生孢子形態(tài)(400×)Fig.1 Morphology of the bacterial pathogenWT-1 on the 5th day and morphology ofmycelia and conidia under the microscope(400×)注:A和B為病原菌菌落形態(tài);C為病原菌菌絲形態(tài);D為孢子形態(tài)。

2.1.2 病原菌致病性檢驗(yàn) 本試驗(yàn)將從果實(shí)病交界處分離純化獲得的病原菌進(jìn)行培養(yǎng),制備1×107CFU/mL孢子懸浮液接種于果實(shí)刺傷傷口,由圖2B-2可知,第3 d時(shí),接種孢子懸浮液的番木瓜傷口處開始輕微發(fā)病,出現(xiàn)水漬狀圓形病斑。第6 d時(shí),番木瓜發(fā)病率達(dá)94%,水漬狀逐漸擴(kuò)大,病斑直徑達(dá)30～36 mm,病斑為暗褐色,中央凹陷,有同心輪紋(圖B-3),部分傷口中央出現(xiàn)橙紅色粘質(zhì)?；蛐『邳c(diǎn),這與番木瓜炭疽病發(fā)病癥狀一致(圖A-2),而對照組無發(fā)病情況(圖CK)。按照1.2.1的方法取果皮組織進(jìn)行分離,得到的病原菌與WT-1具有相同的形態(tài)特征,因此驗(yàn)證了病原菌WT-1為番木瓜炭疽病病原菌。

圖4 病原菌WT-1的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 WT-1 phylogenetic tree based on ITS sequence

圖2 番木瓜炭疽病的癥狀特征和致病性檢驗(yàn)圖片F(xiàn)ig.2 Symptoms and pathogenicity testpictures of papaya anthracnose注:圖A-1為采后第0 d番木瓜果實(shí);圖A-2為采后自然環(huán)境下發(fā)病果實(shí);圖B-1為接種病原菌第0 d的果實(shí);圖B-2為接種病原菌第3 d發(fā)病果實(shí);圖B-3為接種病原菌第6 d發(fā)病果實(shí);圖CK為對照組,即接種無菌水第6 d的番木瓜果實(shí)。

2.1.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定分析 利用ITS1和ITS4引物將提取的病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段約為500～700 bp,經(jīng)測序得到一條長度560 bp的ITS序列,將測序結(jié)果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對,發(fā)現(xiàn)此序列與Glomerellamagna(KC815123.1)的相似性為100%。

圖3 病原菌ITS電泳圖Fig.3 Electrophoregram of pathogen ITS 注:M為DNA Ladder Mix marker;WT-1為病原菌ITS擴(kuò)增產(chǎn)物。

采用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,如圖4所示,WT-1與Glomerellamagna處于同一分支,參照《植物病原真菌學(xué)》[28]可知Glomerella為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)的有性態(tài)小叢殼屬。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,確定菌株WT-1為番木瓜炭疽菌(Glomerellamagna)。

2.2 病原菌生物學(xué)特性研究

2.2.1 溫度對病原菌生長及產(chǎn)孢能力的影響 根據(jù)圖5可以看出,在不同溫度條件下病原菌菌絲均能生長,但在溫度為10和40 ℃條件下菌落直徑顯著低于其他處理組(P<0.05),而且未產(chǎn)生孢子。在溫度為30 ℃條件下病原菌菌落直徑及產(chǎn)孢量顯著高于其他處理組(P<0.05),表明病原菌最適生長溫度及產(chǎn)孢溫度約為30 ℃。

圖5 溫度對病原菌WT-1生長及產(chǎn)孢能力的影響Fig.5 Effects of temperature on myceliumand sporulation of WT-1注:不同小字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異性顯著(P<0.05);圖6～圖8同。

2.2.2 光照、pH對病原菌生長及產(chǎn)孢能力的影響 由圖6可以看出,在3種光照條件下菌絲均能生長,其中全黑暗條件下菌絲生長情況顯著低于全光照和12 h光暗交替處理(P<0.05)。全光照和12 h光暗交替條件下菌絲直徑無明顯差異,但是在12 h光暗交替條件下產(chǎn)孢量最高。

圖6 光照對病原菌WT-1生長及產(chǎn)孢能力的影響Fig.6 Effects of light on myceliumand sporulation of WT-1

根據(jù)圖7可知,病原菌在pH為4～11時(shí)均能生長,但pH過高或過低時(shí)會相對緩慢病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢能力,病原菌菌絲生長的pH最適范圍為6～8,產(chǎn)生孢子的pH最適范圍為7～8。

圖7 pH對病原菌WT-1生長及產(chǎn)孢能力的影響Fig.7 Effects of pH value on myceliumand sporulation of WT-1

2.2.3 不同碳源對病原菌生長及產(chǎn)孢能力的影響 由圖8可知,病原菌在不同碳源條件下均能生長,其中病原菌菌絲在以葡萄糖、果糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長情況顯著大于其他碳源(P<0.05),且3種碳源條件下產(chǎn)孢量也大于其他處理組,其中葡萄糖最優(yōu),其次為果糖,蔗糖次之。

圖8 碳源對病原菌WT-1生長及產(chǎn)孢能力的影響Fig.8 Effects of carbon sourceson mycelium and sporulation of WT-1

2.3 拮抗菌的篩選結(jié)果

從果園土壤中分離純化得到63株菌,通過初篩得到22株具有拮抗效果的菌株,復(fù)篩獲得7株對Glomerellamagna具有較好拮抗效果的菌株(表1)。其中菌株W-2的拮抗能力最強(qiáng),其拮抗指數(shù)達(dá)到3.23,抑菌帶半徑達(dá)12.70 mm。

表1 拮抗菌株對病原菌WT-1抑制效果復(fù)篩結(jié)果Table 1 Results of the inhibition ofantagonistic strains on pathogen WT-1

注：同列不同小字母表示差異性顯著(P<0.05);表3～表5同。

2.4 拮抗菌的鑒定結(jié)果

2.4.1 拮抗菌形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,拮抗菌W-2菌落呈圓形無隆起(圖9A),乳白色,表面有褶皺,不透明,邊緣不整齊,菌落較濕潤,生長迅速。通過顯微鏡觀察,菌體細(xì)胞呈直桿狀(圖9B),鏈狀排列,產(chǎn)橢圓形或圓卵形芽孢,無莢膜。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特性(表2),參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》可以初步鑒定菌株W-2為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

圖9 拮抗菌W-2第5 d菌落形態(tài)和顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(400×)Fig.9 Antagonistic antibacterial W-2 colony morphologyand cell morphology under microscope(400×)

2.4.2 拮抗菌16S rDNA序列分析 拮抗菌16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果如圖10所示,擴(kuò)增片段約為1500 bp,經(jīng)測序得知其序列長度為1493 bp,將測序結(jié)果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對,結(jié)果表明,菌株W-2與Bacillusatrophaeus(CP024051.1)的相似性為100%。根據(jù)MEGA6.0構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知,菌株W-2和B.atrophaeus位于同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,可確定菌株W-2為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖11 拮抗菌W-2基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.11 Phylogenetic tree of W-2 based on 16S rDNA sequence

表2 拮抗菌W-2的生理生化測試結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristic of W-2

圖10 拮抗菌W-2 16S rDNA電泳圖Fig.10 PCR amplification of 16S rDNA sequence of W-2注:M為DNA Ladder Mix marker;W-2為拮抗菌16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

注：“+”表示陽性,“-”表示陰性。

2.5 拮抗菌對病原菌菌絲生長的影響

由表3可以看出,4個(gè)濃度的拮抗菌W-2對番木瓜炭疽病菌絲生長均有明顯的抑制作用,濃度為1×108和1×109CFU/mL時(shí)抑制效果較好,且濃度為1×109CFU/mL時(shí),抑制效果最優(yōu)。從圖12A可以看出,在菌株W-2的作用下,抑菌帶周邊病原菌菌絲無法向外繼續(xù)生長,而且邊緣有一條很明顯的深色條帶。通過顯微鏡觀察抑菌帶附近的菌絲發(fā)現(xiàn)其形態(tài)發(fā)生改變,其中圖12B菌絲體短小膨大。

表3 不同濃度W-2對WT-1菌絲生長的影響Table 3 Antagonistic effects of W-2at different concentrations on mycelium of WT-1

圖12 拮抗菌對病原菌菌絲生長的影響(400×)Fig.12 Effect of antagonistic antibioticson the growth of pathogenic mycelia(400×)注:B中(a)為膨大菌絲形態(tài)。

2.6 拮抗菌對病原菌孢子萌發(fā)的影響

如表4所示,在拮抗菌W-2菌懸液的作用下,大部分病原菌孢子的萌發(fā)被抑制。處理6 h后與對照組相比,濃度為1×108和1×109CFU/mL的拮抗菌懸液對病原菌孢子的相對抑制率為100%。處理12 h后,濃度為1×108和1×109CFU/mL的拮抗菌懸液孢子的平均萌發(fā)率分別為20.67%和20.00%,顯著低于對照組(P<0.05)。通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)部分孢子生長畸形,有些孢子油球變多(圖13A)。

表4 不同濃度W-2對孢子萌發(fā)率的影響Table 4 Effect of W-2 at differentconcentrations on conidial germination rate

圖13 拮抗菌W-2對病原菌WT-1孢子的影響(400×)Fig.13 Effects of W-2 on conidialmorphology of WT-1(400×)注:A中(a)為畸形孢子形態(tài),(b)為孢子油球變多孢子形態(tài);B為正常孢子形態(tài)。

2.7 拮抗菌不同組分對病原菌的影響

如表5所示,拮抗菌發(fā)酵液、菌懸液和無細(xì)胞濾液對病原菌菌絲生長均有抑制作用。其中發(fā)酵液的拮抗效果優(yōu)于菌懸液,拮抗效果顯著優(yōu)于無細(xì)胞濾液(P<0.05)。菌懸液拮抗效果優(yōu)于無細(xì)胞濾液,兩者差異不顯著,說明拮抗菌的抑制作用是菌懸液與產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)共同作用的結(jié)果。另外,滅菌液對病原菌并無抑制作用,說明滅菌后拮抗物質(zhì)已失活。

表5 W-2不同組分對WT-1菌絲生長的拮抗影響Table 5 Antagonistic effects of W-2 at different partson mycelium of Glomerella magna

2.8 番木瓜果實(shí)上拮抗菌對番木瓜炭疽菌的抑制效果

由圖14可以看出,貯藏5 d時(shí),對照組A的番木瓜果實(shí)尚未發(fā)病,而接種了病原菌孢子懸液的B組和C組的果實(shí)均出現(xiàn)發(fā)病情況。之后,番木瓜果實(shí)上的病斑直徑和發(fā)病率隨著貯藏時(shí)間的延長而增大。貯藏第7 d,3組的病斑直徑分別為11.30、21.60和16.60 mm,發(fā)病率分別為20.00%、79.57%和50.03%。與B組相比,C組的病斑直徑明顯降低了5.00 mm,而且發(fā)病率顯著降低30%(P<0.05)。結(jié)果表明,B.atrophaeus有效的抑制了番木瓜炭疽菌在番木瓜傷口處的生長。

圖14 番木瓜傷口處病斑直徑和發(fā)病率隨貯藏時(shí)間的變化Fig.14 Changes of lesion diameters and decayincidence in papaya wound with the preservation days注:圖例中A-無菌水;B-無菌水+病原菌孢子懸液;C-拮抗菌懸液+病原菌孢子懸液。不同小字母表示同一貯藏時(shí)間的不同處理間差異性顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

番木瓜炭疽病是影響番木瓜采后貯藏運(yùn)輸最為嚴(yán)重的病害之一,因海南省氣候高溫多雨,在番木瓜生長季節(jié),氣候環(huán)境也極其適合炭疽病菌的繁殖,致使該病發(fā)病迅速。在海南地區(qū),經(jīng)報(bào)道的番木瓜炭疽病病原菌目前有兩種,分別是膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici)[29]。在本試驗(yàn)中,從發(fā)病果實(shí)病健交界處分離獲得了一株番木瓜炭疽病有性態(tài)致病菌株Glomerellamagna。該菌株的最適生長溫度及產(chǎn)孢溫度為30 ℃,在12 h光暗交替條件下產(chǎn)孢量最高;菌絲生長的最適pH范圍為6～8,pH在7～8時(shí)可產(chǎn)生大量孢子,最適碳源為葡萄糖。將此菌株于美國菌種保藏中心(ATCC)進(jìn)行搜索,發(fā)現(xiàn)Glomerellamagna是一株可以引起西瓜、南瓜和黃瓜等葫蘆科植物炭疽病的病原菌,于2010年首次在中國臺灣發(fā)現(xiàn)并報(bào)道該病原菌[30]。Glomerellamagna作為一株海南地區(qū)新型的番木瓜炭疽病病原菌,有待對其進(jìn)一步研究。

近年來,人們對安全健康、環(huán)境友好型農(nóng)產(chǎn)品的需求日益增加,生物防治作為一種可取代化學(xué)殺菌劑的新途徑,在采后果蔬防腐保鮮方面有較大的潛力。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)若干拮抗微生物能夠有效控制番木瓜采后炭疽病。石晶盈等[31]分離并篩選出1株內(nèi)生細(xì)菌惡臭假單胞菌生物變種Ⅰ(PseudomonasputidabiovarⅠ),對采后番木瓜疫病和炭疽病具有抑制作用。陳亮[32]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)發(fā)酵液產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對C.gloeosporioide有較好的抑制效果。孫合美等[33]篩選出4株對C.gloeosporioides和C.capsici均有良好拮抗性的優(yōu)良木霉菌(Trichodermasp.)。本試驗(yàn)針對分離獲得的新型番木瓜炭疽病病原菌Glomerellamagna,開展拮抗菌的篩選。從果園土壤中篩選獲得7株拮抗菌,其中菌株W-2拮抗能力最強(qiáng),將其鑒定為萎縮芽孢桿菌,該菌在離體和活體防效試驗(yàn)中對番木瓜炭疽菌都具有明顯的拮抗效果。

大量研究表明,萎縮芽孢桿菌能抑制多種植物病原菌的生長,其作用機(jī)制可能包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、產(chǎn)嗜鐵素、鈍化病原菌的寄生和繁殖能力等[15]。Li等[34]從胡麻植株土樣中分離出的萎縮芽孢桿菌SF1對胡麻枯萎病有抑制作用。萎縮芽孢桿菌B5的發(fā)酵產(chǎn)物通過分泌脂肽伊枯草菌素、桿菌霉素和表面活性肽等物質(zhì),對刺果番荔枝和牛油果炭疽病病原菌的菌絲和孢子均有較強(qiáng)的抑制作用[26]。Zhang等[35]報(bào)道了一株對黃瓜白粉病和番茄灰霉病具有較強(qiáng)的抑制作用萎縮芽孢桿菌CAB-1,其代謝產(chǎn)物鄰茴香胺能有效抑制B.cinerea菌絲的生長。本研究的體外試驗(yàn)表明,在拮抗菌W-2作用下,番木瓜炭疽菌的菌絲短小、膨大,隔膜消失,孢子形態(tài)異常。而且拮抗菌發(fā)酵液、菌懸液和無細(xì)胞濾液對病原菌菌絲生長均有抑制作用,這可能與拮抗菌直接的抑菌作用或在代謝過程中分泌的抗菌物質(zhì)有關(guān),但相關(guān)機(jī)理及抗菌物質(zhì)仍需進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為海南地區(qū)番木瓜炭疽病新型致病菌Glomerellamagna的生物防治提供了理論基礎(chǔ),為后續(xù)針對拮抗菌拮抗機(jī)理的進(jìn)一步研究做了鋪墊。