不同腐乳醬營養(yǎng)、功能及呈味氨基酸量化表征

張建萍，解春芝,

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018）

腐乳與豆豉、醬油、豆醬并稱為我國四大傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，是經(jīng)磨漿、點(diǎn)漿、前酵、腌制、加輔料、后熟等工藝而成[1]。其風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)均衡，富含優(yōu)質(zhì)蛋白和不飽和脂肪酸（亞油酸、油酸等）[2-3]，8 種人體必需氨基酸齊全，且氨基酸模式可與牛奶、雞蛋相媲美[4]。經(jīng)微生物發(fā)酵后，腐乳消化率和生物效價也大幅提高，脹氣因子、豆腥味及苦澀味均被消除[5]。此外，豐富的活性成分賦予其良好的保健功效，如降膽固醇[6]、降血壓[7-8]、抗氧化[9]、降血糖活性[10]等。

傳統(tǒng)腐乳在發(fā)酵過程中，“禿斑”、“紅變”、“黃身”、“霉變”、“酸化”、“產(chǎn)氣”等現(xiàn)象時有發(fā)生。腐乳多為塊狀，生產(chǎn)中只能沿用手工操作進(jìn)行擺籠、搓毛、腌制、裝瓶等，無法機(jī)械化生產(chǎn)，難以提高生產(chǎn)效率，嚴(yán)重制約規(guī)?；a(chǎn)[11]。并且，塊狀的腐乳必須加封面汁液，否則，露空的腐乳會褐變發(fā)黑，甚至發(fā)臭，影響食用，限制了傳統(tǒng)腐乳市場的發(fā)展。針對這些問題，研發(fā)方便、質(zhì)量均一且涂抹性和延展性良好的膏狀腐乳醬，得到了商家及學(xué)者關(guān)注。目前市售腐乳醬均以腐乳為主料，添加水、食鹽、香辛料、甜味劑等調(diào)配而成，工藝繁雜，種類較少，并且鮮見腐乳醬的相關(guān)報道[12-13]，限制了人們對不同腐乳醬的整體認(rèn)知。

因此，本實(shí)驗(yàn)采集5 種市售腐乳醬，對比其常規(guī)營養(yǎng)和功能成分，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法綜合評價其呈味氨基酸，以期為腐乳醬的研發(fā)、生產(chǎn)工藝改善及消費(fèi)者選購提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集的5 種腐乳醬樣品，分別來自北京市（BJ-1和 BJ-2）上海市（SH）、廣東省（GD）和河北?。℉B）。

葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、齊墩果酸（均為色譜純） 中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心；γ-氨基丁酸、β-谷甾醇、豆甾醇、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、乙酸、三氟乙酸（均為色譜純）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

P1201高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；ALPHA 1-2LD PLUS冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；R206B凱氏定氮儀 上海申生科技有限公司； TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SZF-06A脂肪測定儀 上海精密儀器儀表有限公司；KQ2200DV超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；L5S紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；Cascada LS超純水機(jī) 美國PALL公司；L8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)理化指標(biāo)測定

水分含量測定：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法；蛋白質(zhì)含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法；脂肪含量測定：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》索氏抽提法；淀粉含量測定：參照GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》酶水解法；食鹽含量測定：參照GB 5009.42—2016《食鹽指標(biāo)的測定》直接滴定法；氨基酸態(tài)氮和總酸含量測定：參照SB/T 10170—2007《腐乳》電位滴定法。其中，脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉、食鹽、總酸、氨基酸態(tài)氮均以干基計(jì)。

1.3.2 功能成分測定

樣品制備：腐乳醬冷凍干燥后，研磨過100 目篩。稱取3.0 g樣品，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液中，超聲處理30 min，溫度40 ℃，功率600 W，離心20 min（7 000 r/min），過濾后，定容至50 mL，過膜（0.22 μm），得供試液。

黃酮類化合物測定：參照李昕等[14]高效液相色譜法，并略有調(diào)整。ZORABX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL，以乙腈（A）和0.1%乙酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫條件為：0～15 min，70%～50% B；1 5 ～2 5 m i n，5 0%～4 0% B；2 5 ～3 0 m i n，40%～30% B；30～40 min，30%～70% B。

植物甾醇和γ-氨基丁酸的測定：采用高效液相色譜方法，所用色譜儀、色譜柱、柱溫及進(jìn)樣量均與異黃酮測定相同。其中，植物甾醇流動相為0.1%乙酸-甲醇溶液，流速0.8 mL/min，波長210 nm，總運(yùn)行時間20 min。γ-氨基丁酸以甲醇（A）和去離子水（B）為流動相，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min。梯度洗脫條件：0～15 min，70%～50% B；15～25 min，50%～40% B；2 5 ～3 0 m i n，4 0%～3 0% B；3 0 ～4 0 m i n，30%～70% B。

大豆皂苷含量測定采用香草醛-高氯酸法[15-16]。配制不同質(zhì)量濃度齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，于60 ℃水浴蒸干后，加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液以及0.8 mL高氯酸，搖勻；于65 ℃加熱15 min，取出后冰水中冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸，充分混勻后靜置15 min。在560 nm波長處測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取200 μL樣品溶液，依次加入200 μL 5%的香草醛-冰醋酸溶液以及0.8 mL高氯酸，其余處理步驟同標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出腐乳醬中皂苷含量。各功能性成分均以干基計(jì)。

1.3.3 呈味氨基酸含量測定

參考Xie Chunzhi等[17]的方法，根據(jù)Tseng等[18]描述的游離氨基酸滋味特征，分為鮮味（天冬氨酸、谷氨酸）、甜味（丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）、苦味（精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸）和無味（半胱氨酸、賴氨酸、脯氨酸）4 類。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和PCA。在方差分析結(jié)果顯著時，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，并用不同小寫字母表示組間差異顯著（P＜0.05），相同小寫字母表示組間差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)分析

表 1 腐乳醬常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)分析Table 1 Nutritional composition of different sufu paste samples

如表1 所示， 腐乳醬水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（52.21%～67.71%），且差異顯著（P＜0.05）。可能是陰離子及其離子強(qiáng)度對蛋白凝膠持水力的影響，導(dǎo)致腐乳醬顆粒內(nèi)凝膠網(wǎng)絡(luò)的差異[19]。蛋白質(zhì)（6.78%～10.85%）、脂肪（4.71%～8.59%）和淀粉（5.30%～26.78%）是腐乳醬的主要營養(yǎng)成分，也是腐乳醬獨(dú)特風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量的差異主要取決于腐乳醬調(diào)配輔料、原料大豆以及發(fā)酵程度等。例如，BJ-1調(diào)配輔料中不含小麥粉，其淀粉含量（5.30%）遠(yuǎn)低于其他種類腐乳醬。腐乳醬中食鹽含量（8.47%～10.90%）低于腐乳（30.08～45.85 g/100 g）[17]， 這可能源于腐乳醬調(diào)配過程中大量水和輔料的添加降低了食鹽的濃度。除了賦予腐乳醬咸味，食鹽也可通過影響微生物酶活性，控制腐乳發(fā)酵過程中微生物代謝和抑制有害菌生長[20]。作為衡量腐乳質(zhì)量和發(fā)酵成熟度的重要參數(shù)[21]，腐乳醬中氨基酸態(tài)氮和總酸差異顯著（P＜0.05），質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.31%～0.82%和0.34%～1.16%。微生物發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸，是氨基酸態(tài)氮的重要來源[22-23]，而總酸則取決于微生物細(xì)胞自溶產(chǎn)生的具有羧基側(cè)鏈的游離氨基酸、脂肪酸、小分子肽、有機(jī)酸等[24]。

2.2 功能成分比較

圖 1 腐乳醬功能成分含量分布Fig. 1 Contents of functional components in different sufu paste samples

如圖1 所示，不同腐乳醬功能成分含量差異顯著（P＜0.05）。黃酮類化合物對多種疾病具有預(yù)防和治療功效，如消炎、抗老化、抗腫瘤、抑制骨質(zhì)疏松癥、減緩動脈硬化等[25-26]。由圖1A、B可知，葛根素含量最高（4.80～12.18 mg/100 g），其中BJ-1高達(dá)12.18 mg/100 g，約為HB的2.5 倍。其次分別為染料木素（0.21～0.32 mg/100 g）、大豆苷元（0.1 2 ～0.2 7 m g/1 0 0 g）和大豆苷（0.09～0.13 mg/100 g）。但其含量遠(yuǎn)低于腐乳，比如含鹽量為15%腐乳中的大豆苷元和染料木素在后酵第25天可達(dá)到最大值12.00 mg/100 g和19.67 mg/100 g，而大豆苷的含量則逐漸下降，直至無法檢出，說明糖苷被分解成相應(yīng)的苷元[27]，馬艷莉[28]和Yin Lijun[29]等也得出類似結(jié)論。研究表明，影響大豆制品中黃酮類化合物含量的因素很多，包括品種、貯藏條件、子粒部位、加工方法等[25]。就腐乳醬而言，豆腐制作過程中復(fù)雜的工序包括浸泡、蒸煮、磨漿、過濾、成型等，可導(dǎo)致異黃酮流失；另一方面，毛坯制備和腐乳后酵過程中，產(chǎn)生大量 β-葡萄糖苷酶，使異黃酮糖苷被分解成相應(yīng)的苷元和其他化學(xué)成分。γ-氨基丁酸含量豐富（6.82～13.67 mg/100 g），B J - 1 中 達(dá)1 3 . 6 7 m g / 1 0 0 g （ 圖1 C ） 。 腐乳后熟過程中，微生物生長代謝可有效促進(jìn)γ-氨基丁酸的累積，如短乳桿菌和地衣芽孢桿菌[30-31]。作為豆科植物的主要藥效成分之一，大豆皂苷多用于保健品、食品添加劑及化妝品中，具有降血脂以及抗衰老的作用[32]。 腐乳醬中大豆皂苷含量介于1.28 mg/100 g（BJ-2）和3.20 mg/100 g（HB）之間。與其他腐乳醬相比，BJ-1中豆甾醇和β-谷甾醇均最高，分別為0.07 mg/100 g和0.13 mg/100 g。其中，BJ-1中β-谷甾醇含量為BJ-2的4 倍左右（圖1D）。綜上所述，不同腐乳醬功能成分含量豐富，BJ-1最高，GD和HB次之。

2.3 呈味氨基酸譜分析

2.3.1 呈味氨基酸組成和含量分析

表 2 腐乳醬游離氨基酸含量Table 2 Free amino acid profiles of different sufu paste samples

游離氨基酸可作為風(fēng)味形成的前體物質(zhì)，對發(fā)酵食品尤其是以蛋白為主要發(fā)酵基質(zhì)的大豆發(fā)酵食品獨(dú)特滋味和香氣的形成具有重要貢獻(xiàn)[33]。如表2所示，腐乳醬中共檢測到15 種游離氨基酸，且差異顯著 （P＜0.05）。谷氨酸最豐富，含量為0.90～3.71 mg/g， 亮氨酸次之（0.37～0.60 mg/g）?？傆坞x氨基酸（total free amino acid，TFAA）含量最高的為HB，為7.48 mg/g，其次為BJ-2（5.54 mg/g），SH（4.99 mg/g）和GD（4.81 mg/g）含量相當(dāng)。必需氨基酸（essential amino acid，EAA）和抗氧化氨基酸（antioxidative amino acid，AFAA）含量最高的均為HB，分別為2.13 mg/g和0.84 mg/g，而EAA/TFAA和AFAA/TFAA最高的則均為BJ-1，其占比分別為0.46和0.18。游離氨基酸的組成和含量除與原料豆有關(guān)外，還與發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，如張慧林等[34]發(fā)現(xiàn)Weissella、Millerozyma和Aspergillus對傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬游離氨基酸含量具有重要影響。

圖 2 腐乳醬游離氨基酸滋味特征Fig. 2 Taste characteristics of free amino acids in different sufu paste samples

營養(yǎng)、安全和感官是評價食品的三大要素，而感官質(zhì)量最重的屬性之一是滋味[35]。因此，根據(jù)滋味特征，游離氨基酸被分為鮮味、甜味、苦味和無味4 類。由 圖2可知，HB、BJ-2和SH中鮮味氨基酸為主，其含量分別為3.71、2.82 mg/g和2.64 mg/g，而BJ-1（1.89 mg/g）和GD（1.92 mg/g）中苦味氨基酸略占優(yōu)勢。與腐乳的滋味特征譜一致，即咸味為主，并呈強(qiáng)烈鮮味，略帶苦 澀味[17]。鮮味氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸，可作為食品風(fēng)味增強(qiáng)劑，除源于發(fā)酵體系中蛋白質(zhì)分解代謝，還與腐乳醬調(diào)配過程中外源輔料谷氨酸鈉的添加密切相關(guān)，而苦味氨基酸則可能源于不協(xié)調(diào)的蛋白水解。甜味和無味氨基酸所占比例較小，且含量相當(dāng)。各呈味氨基酸相互協(xié)作，共同作用，賦予腐乳醬獨(dú)特滋味特征。

2.3.2 呈味氨基酸PCA

表 3 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic values and contributions of principal components

表 4 主成分的載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

PCA利用降維原理，既可簡化變量個數(shù)，又能獲取足量信息，避免了主觀隨意性[36]。如表3所示，前 4 個主成分的貢獻(xiàn)率分別為52.56%、23.91%、11.16%、5.08%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.70%。說明提取4 個主成分較合適，基本包含了所有游離氨基酸的組成信息。綜合 表3、4可知，PC1主要反映谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸的變異信息，PC2主要反映亮氨酸、酪氨酸、組氨酸的變異信息，PC3主要反映苯丙氨酸、精氨酸的變異信息，PC4主要反映脯氨酸的變異信息。

由于PCA中前4 個主成分反映了15 個指標(biāo)變量信息的92.70%，說明利用F1、F2、F3和F4綜合指標(biāo)對腐乳醬呈味氨基酸進(jìn)行評價是可行的，其對應(yīng)的線性關(guān)系式分別為：

F1=0.020X1-0.005X2+0.118X3+0.106X4+0.023X5+0.123X6-0.061X7+0.122X8+0.126X9+0.116X10+0.118X11+ 0.002X12+0.116X13-0.075X14+0.067X15

F2=0.237X1-0.211X2-0.076X3+0.105X4+0.259X5+0.008X6+0.134X7-0.005X8-0.007X9-0.075X10+0.048X11+ 0.182X12+0.056X13-0.039X14-0.174X15

F3=0.248X1+0.347X2+0.051X3-0.039X4+0.184X5+ 0.114X6+0.430X7+0.148X8+0.011X9+0.026X10-0.118X11-0.347X12-0.121X13-0.078X14+0.049X15

F4=-0.027X1+0.197X2-0.056X3+0.388X4+0.031X5+ 0.140X6-0.015X7-0.044X8+0.082X9+0.268X10+0.052X11-0.111X12+0.017X13+0.92014-0.396X15

表 5 腐乳醬主成分綜合得分及排序Table 5 Principal component scores and ranking of different sufu paste samples

主成分越重要，方差貢獻(xiàn)率越大[37]，以每個主成分所對應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，構(gòu)建綜合評價模型F=0.526F1+0.239F2+0.112F3+0.051F4，計(jì)算各樣品綜合得分。對不同腐乳醬綜合得分進(jìn)行排序，即可對各個樣本的呈味氨基酸組成進(jìn)行綜合評價，結(jié)果見表5。總綜合評分越高，表示該腐乳醬呈味氨基酸綜合品質(zhì)越好。呈味氨基酸組成綜合評分排序?yàn)镚D＞HB＞BJ-1＞BJ-2＞SH。說明不同腐乳醬呈味氨基酸綜合質(zhì)量存在差異，GD的呈味氨基酸綜合質(zhì)量最高，HB次之，SH最低。風(fēng)味，作為食品的重要屬性之一，決定著消費(fèi)者可接受度。食品風(fēng)味物質(zhì)包括呈香（香味）和呈味（滋味）兩部分，呈味主要源于游離氨基酸、游離脂肪酸、小分子肽等，而呈香物質(zhì)主要為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)僅就腐乳醬的呈味氨基酸進(jìn)行綜合評價，為腐乳醬的研發(fā)、生產(chǎn)工藝改善及消費(fèi)者選購提供了科學(xué)依據(jù)。后續(xù)研究應(yīng)聚焦于其他風(fēng)味成分，并結(jié)合感官分析，從而更為全面系統(tǒng)的評價腐乳醬的風(fēng)味品質(zhì)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分析了腐乳醬主要營養(yǎng)、功能成分及呈味氨基酸。結(jié)果表明，腐乳醬營養(yǎng)、功能成分豐富，且差異顯著（P＜0.05）。共檢測到15 種游離氨基酸，谷氨酸最豐富，亮氨酸次之。根據(jù)呈味特征，HB、BJ-2和SH中鮮味氨基酸為主，而BJ-1和GD中苦味氨基酸略占優(yōu)勢。PCA表明，前4 個主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.70%，可較好反映呈味氨基酸組成的基本信息。不同腐乳醬呈味氨基酸綜合評分存在差異，GD最高，HB次之，SH最低。該研究結(jié)果可為腐乳醬的研發(fā)、生產(chǎn)工藝改善及消費(fèi)者選購提供科學(xué)依據(jù)。腐乳醬食用方便，質(zhì)量均一，且涂抹性和延展性良好。但目前腐乳生產(chǎn)大多沿用傳統(tǒng)工藝，后熟時間長（2～6 個月），季節(jié)限制嚴(yán)重，廠房占用面積大，降低了其生產(chǎn)效率。而市售腐乳醬均是以塊狀腐乳為原料進(jìn)一步調(diào)配而成，工藝繁雜，生產(chǎn)周期更為漫長，導(dǎo)致其種類很少，嚴(yán)重制約了規(guī)?；a(chǎn)和推廣。因此，未來腐乳醬研究應(yīng)取長補(bǔ)短，著力于縮短后熟期，如毛坯微細(xì)化處理，菌劑強(qiáng)化發(fā)酵等，促進(jìn)腐乳醬產(chǎn)業(yè)發(fā)展。