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    解淀粉芽孢桿菌mtnN基因?qū)ζ渖锖铣?S-腺苷甲硫氨酸的影響

    2020-04-02 03:32:44阮麗英溫志友魏雪團
    食品科學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:甲硫氨酸工程菌反義

    阮麗英,溫志友,魏雪團,

    (1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.愛荷華州立大學(xué)食品科學(xué)與人類營養(yǎng)系,美國 愛荷華州 埃姆斯 50013)

    S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種重要的生物活性物質(zhì),參與轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫和轉(zhuǎn)氨丙基等多種類型的生化反應(yīng)[1-2],從而影響體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和磷脂等物質(zhì)的合成與代謝[3-4]。 SAM顯著影響細胞代謝活動,充足的SAM是維持機體正常運轉(zhuǎn)的重要保證,缺乏SAM會出現(xiàn)一系列不良癥狀[5-6]。 研究表明,SAM對肝病、關(guān)節(jié)炎及抑郁癥等疾病具有良好的預(yù)防和治療效果[7-11]。因此,開發(fā)SAM相關(guān)的功能食品和藥品具有重要的價值。

    SAM可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn),由微生物體內(nèi)的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP合成[12]。 目前S A M 的研究主要集中在酵母菌、大腸桿菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒桿菌,多通過強化微生物表達S-腺苷甲硫氨酸合成酶,進而將更多的L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為SAM[13-14]。如He Junyun等[15]在畢赤酵母中強化表達外源S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAM2,并敲除SAM分支途徑中的β-胱硫醚合成酶基因,經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后,工程菌在5 L發(fā)酵罐中SAM產(chǎn)量高達13.5 g/L。然而,以甲硫氨酸為底物成本較高,且甲硫氨酸轉(zhuǎn)化率較低(15%~42%),導(dǎo)致SAM價格高[16-17]。有研究者通過葡萄糖或天冬氨酸為原料合成SAM。如Chen Yawei等[18]以葡萄糖為底物從頭合成SAM,通過調(diào)控ATP和NADPH強化了E. coli合成SAM的能力,然而目前的產(chǎn)量不足10 mg/L; Han Guoqiang等[19]敲除了谷氨酸棒桿菌SAM支鏈途徑和抑制因子基因(mcbR、thrB和Ncgl2640),強化表達了血紅蛋白基因和甲硫氨酸合成酶基因,以葡萄糖為底物,SAM產(chǎn)量達到196.7 mg/L??傮w而言發(fā)酵產(chǎn)量較低,有待進一步提高。

    解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有食用安全、生長快速、易于培養(yǎng)等優(yōu)點,目前已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[20-21]。近年來,隨著芽孢桿菌系統(tǒng)生物學(xué)和基因操作工具的發(fā)展,極大推動了芽孢桿菌代謝工程的發(fā)展[22-23]。KEGG數(shù)據(jù)庫顯示,B. amyloliquefaciens中存在完整的SAM代謝途徑,然而還鮮見通過B. amyloliquefaciens發(fā)酵生產(chǎn)SAM的報道。在B. amyloliquefaciens中,基因mtnN編碼S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase,SAHN,EC 3.2.2.9),如圖1所示,該酶既可以參加SAM循環(huán)途徑,又可以參加甲硫氨酸循環(huán)途徑,這兩個循環(huán)途徑都消耗SAM[24]。因此,提出假設(shè):阻斷或降低mtnN基因的表達可同時抑制SAM循環(huán)途徑和甲硫氨酸循環(huán)途徑,從而促進SAM的積累。為驗證這個假設(shè),本研究通過基因敲除技術(shù)和反義RNA抑制技術(shù)構(gòu)建系列工程菌株,考察mtnN基因?qū). amyloliquefaciens合成SAM的影響,闡釋了mtnN基因?qū)AM合成的影響規(guī)律,為SAM高產(chǎn)菌株的代謝工程育種提供了新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒

    本研究所用到的菌株和質(zhì)粒如表1、2所示。其中 E. coli DH5α用于構(gòu)建載體。

    1.1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物

    本研究所用的主要引物見表3,引物合成和質(zhì)粒測序由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司和北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

    表 3 實驗所用PCR引物Table 3 Sequences of primers used for PCR in this study

    1.1.3 培養(yǎng)基

    Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,酵母浸出粉5.0 g/L,氯化鈉10.0 g/L,pH 7.2~7.4,固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%。

    B. amyloliquefaciens電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備所用生長培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中添加0.5 mol/L山梨醇;洗滌培養(yǎng)基:0.5 mol/L甘露醇,0.5 mol/L山梨醇,10%(體積分?jǐn)?shù))甘油;恢復(fù)培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中含有0.5 mol/L山梨醇,0.38 mol/L甘露醇。

    SAM發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖80 g/L,蛋白胨10 g/L,玉米漿5 g/L,天冬氨酸3 g/L,尿素2 g/L,(NH4)2SO46.3 g/L, NaCl 2.5 g/L,KH2PO43 g/L,MgSO4·7H2O 4.2 g/L,pH 6.5~6.7。

    1.1.4 工具酶和試劑

    Trans Start?FastPfu DNA聚合酶、Trans Start?easy Taq DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司;dNTPS、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DL5000 Marker 日本TaKaRa公司;瓊脂糖 西班牙Spanish公司;DNA抽提試劑盒 武漢楚誠正茂科技工程有限公司;DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒 美國Omega BioTek公司;卡那霉素(kanamycin,Kan)、四環(huán)素(tetracycline,Tet)、溶菌酶、山梨醇、甘露醇(Biosharp進口分裝) 武漢楚誠正茂科技工程有限公司; 甲醇為色譜級,其他均為國產(chǎn)分析級純或進口分裝。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Alpha Imager EP凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司;AR5120通用型精密天平 美國奧豪斯公司;CR21G高速冷凍離心機 日本Hitachi公司;DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;H Q L 3 0 0 B 恒溫大幅振蕩搖床 武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司;Legend Micro17R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司; MLS-3750高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司;QL-861渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Research?固定量程移液器 德國艾本德股份公司;SKP-02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-2F 潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Thermal Cycler (My Cycler) PCR儀 美國Bio-Rad公司;722型分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司;DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 分子水平操作

    E. coli質(zhì)粒的小量抽提:美國Omega BioTek公司的質(zhì)粒提取試劑盒,參照說明書中提取步驟。

    PCR擴增:所用引物見表3,依次加入常規(guī)PCR體系(表4)各成分,混勻后進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環(huán);72 ℃延伸5 min;12 ℃保持5 min。其中,退火溫度依據(jù)引物的Tm值,延伸時間依據(jù)基因片段大小和聚合酶擴增效率。

    表 4 常規(guī)PCR體系Table 4 Reaction system of conventional PCR

    SOE-PCR依次加入各成分(表5),混勻后進行擴增反應(yīng)。SOE-PCR程序:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,先運行8 個循環(huán),后運行:95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環(huán),72 ℃延伸5 min,12 ℃保持5 min。其中,退火溫度依據(jù)引物的Tm值,延伸時間依據(jù)基因片段大小。

    表 5 SOE-PCR體系Table 5 Reaction system of SOE-PCR

    DNA的純化及回收:按照純化及膠回收試劑盒(美國Omega BioTek公司)說明書上的步驟純化回收DNA。

    1.3.2 mtnN基因缺失菌株的構(gòu)建

    重組載體的構(gòu)建:選取m t n N 基因上下游序列約500 bp為同源臂片段,設(shè)計上游同源臂片段引物(ΔmtnN-AF和ΔmtnN-AR)和下游同源臂片段引物(ΔmtnN-BF和ΔmtnN-BR)。以B. amyloliquefaciensHZ-12的基因組DNA作為模板,分別擴增得到上下游同源臂片段,產(chǎn)物純化回收后作為兩段同源臂SOE-PCR的模板,用引物ΔmtnN-AF和ΔmtnN-BR進行擴增,產(chǎn)物純化回收后與敲除載體T2(2)-ori同時用BamHI和XbaI進行雙酶切,產(chǎn)物回收后用T4連接酶4 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞,挑取單菌落進行菌落PCR驗證,確定為陽性克隆后,提取質(zhì)粒測序,構(gòu)建成功的敲除載體為T2(2)-oriΔmtnN。

    感受態(tài)的制備:B. amyloliquefaciensHZ-12平板劃線,挑取適量菌體接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)8 h;培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于50 mL生長培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r/min培養(yǎng)3 h,使OD600nm達1.5~2.5;將培養(yǎng)液倒入無菌的50 mL離心管中,置冰上預(yù)冷10 min,6 500 r/min離心5 min收集菌體;用20 mL預(yù)冷的洗滌培養(yǎng)基洗滌菌體3~4 次,6 500 r/min離心5 min,棄上清液,將菌體重懸于800 μL洗滌培養(yǎng)基中,每100 μL分裝于1.5 mL離心管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    電轉(zhuǎn)化:將5~10 μL質(zhì)粒DNA(50 ng/μL)加入B. amyloliquefaciensHZ-12感受態(tài)細胞,輕柔混勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)化杯中,冰浴10 min后,電脈沖轉(zhuǎn)化儀2.4 kV電擊一次,迅速加入800 μL恢復(fù)培養(yǎng)基,于37 ℃、100 r/min恢復(fù)培養(yǎng)3 h,涂布于含Kan抗生素平板,37 ℃靜置培養(yǎng)16~18 h。挑取轉(zhuǎn)化子單菌落劃線于Kan抗性平板,培養(yǎng)10~12 h后進行菌落PCR驗證。

    單交換菌株的篩選及驗證:驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,45 ℃、 180 r/min培養(yǎng)12 h;培養(yǎng)物稀釋10-6倍涂布Kan抗性平板,45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng);挑單菌落劃線于Kan抗性平板,45 ℃培養(yǎng)10 h左右,用驗證引物和T2引物進行菌落PCR驗證。

    雙交換菌株的篩選及驗證:獲得的單交換菌株在5 mL LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代,每代12 h,每次取100 μL前一代培養(yǎng)物接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng);將最后一代培養(yǎng)物稀釋105~106倍,涂布LB平板;對其上長出的單菌落分別對應(yīng)點種于LB平板和含Kan的LB平板上;選取在LB平板生長而在含Kan的平板不生長的單菌落進行PCR驗證,篩選雙交換菌株。

    1.3.3 反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌的構(gòu)建

    重組載體的構(gòu)建:通過引物m t n N a s R N A-F 和mtnNasRNA-1-R,以互補于目標(biāo)基因的5’端不翻譯序列和目標(biāo)基因編碼區(qū)的序列為模板進行擴增,通過NcoI和XhoI對具有反義RNA序列的pUC19-asRNA質(zhì)粒和PCR得到的目的片段asRNA分別進行雙酶切,然后將酶切后的質(zhì)粒和片段連接進行轉(zhuǎn)化,得到含有目的片段asRNA的質(zhì)粒pUC19-mtnNasRNA。通過引物P43-F和mtnNasRNAP43-R擴增P43啟動子,通過引物mtnNasRNA-F和rrnB-R(質(zhì)粒本身含有的終止子下游引物),以質(zhì)粒pUC19-mtnNasRNA為模板進行擴增,PCR產(chǎn)物回收純化后,以引物P43-F和rrnB-R進行SOE-PCR,用BamHI和XbaI對得到的片段進行雙酶切,回收純化后與同樣經(jīng)過雙酶切純化后的穿梭質(zhì)粒pHY300進行酶連,轉(zhuǎn)化后得到質(zhì)粒pHYmtnNasRNA-1。通過引物P43-F和mtnNasRNA-P43-R擴增P43啟動子,通過引物mtnNasRNA-F和mtnNasRNA-2-R(mtnNasRNA-3-R),以質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-1為模板進行擴增,產(chǎn)物回收純化后與pHY-mtnNasRNA-1質(zhì)粒同時用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI進行雙酶切,產(chǎn)物回收后進行酶連,轉(zhuǎn)化后得到質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-2(pHYmtnNasRNA-3),所用的引物如表3所示。

    電轉(zhuǎn)化:按1.3.2節(jié)方法制備B. amyloliquefaciensHZ-12的感受態(tài)細胞,將抽提得到的表達質(zhì)粒pHYmtnNasRNA-1、pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3以及空載體pHY300PLK分別電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,涂布Tet抗性平板,37 ℃培養(yǎng)12~16 h得到轉(zhuǎn)化子,取一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化子分別進行菌落PCR驗證,引物用pHY300-F和pHY300-R。

    1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件

    從超低溫冰箱中取出保藏的菌種劃線LB平板培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)基12 h。挑取適量菌體于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)9 h(反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌種子培養(yǎng)基中加 8 μg/mL Tet抗生素)。吸取1.5%菌液接種于裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶,37 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)60 h,每個菌設(shè)置3 個搖瓶重復(fù)。

    1.3.5 SAM的高效液相色譜檢測

    取發(fā)酵液0.5 mL,加1.5 mL 0.4 mol/L高氯酸提取1 h(每15 min振蕩一次),10 000 r/min離心5 min。取800 μL上清液,加100 μL 2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值。利用高效液相色譜檢測,色譜柱為XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),檢測器為紫外檢測器,流動相為甲醇與40 mmol/L NH4H2PO2-2 mmol/L庚烷磺酸鈉(18∶82,V/V),流速0.8 mL/min,進樣量20 μL,柱溫30 ℃,檢測波長254 nm。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    每組實驗設(shè)計3 個重復(fù),采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,評估數(shù)據(jù)差異的顯著性,計算±s,采用 Origin 8.5進行圖表繪制。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 mtnN基因缺失對解淀粉芽孢桿菌SAM的影響

    2.1.1 mtnN基因缺失菌株的構(gòu)建

    利用1.3.2節(jié)方法構(gòu)建重組載體T2(2)-oriΔmtnN,利用表3中相應(yīng)的引物擴增構(gòu)建T2(2)-oriΔmtnN的上下游同源臂,上下游同源臂大小分別為776 bp和784 bp,二者經(jīng)SOE-PCR融合后的產(chǎn)物大小為1 560 bp,上下游同源臂SOE-PCR融合片段與T2(2)-ori質(zhì)粒經(jīng)酶切和酶連后轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α,選取驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子,抽提質(zhì)粒并用BamHI和XbaI酶切質(zhì)粒,電泳檢測結(jié)果如圖2所示,重組質(zhì)粒酶切片段大小與預(yù)期相符合,構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒測序結(jié)果顯示正確,表明敲除質(zhì)粒T2(2)-oriΔmtnN構(gòu)建成功。

    圖 2 重組質(zhì)粒T2(2)-oriΔmtnN雙酶切驗證Fig. 2 Identification of recombinant plasmid T2(2)-oriΔmtnN by double enzymatic digestion

    將已構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒T2(2)-oriΔmtnN電轉(zhuǎn)化至B. amyloliquefaciensHZ-12中,篩選出陽性轉(zhuǎn)化子,并按照1.3.2節(jié)的方法進行單交換和雙交換篩選突變株。經(jīng)菌落PCR驗證正確的雙交換菌株,抽提其基因組DNA,并用ΔmtnN-YF和ΔmtnN-YR分別驗證陽性交換突變株和原始菌株B. amyloliquefaciensHZ-12,片段大小分別為1 965、2 681 bp,PCR驗證電泳圖如圖3所示,回收陽性交換突變株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)測序確認堿基正確無誤。將構(gòu)建成功的缺失mtnN基因的菌株命名為HZ-12ΔmtnN。

    圖 3 HZ-12ΔmtnN菌株的PCR電泳圖Fig. 3 Electrophoretogram of PCR-amplified products from strain HZ-12ΔmtnN

    2.1.2 mtnN基因缺失對SAM含量的影響

    為考察mtnN基因的缺失對B. amyloliquefaciens HZ-12合成SAM的影響,按照1.1.3節(jié)和1.3.4節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對工程菌株HZ-12ΔmtnN進行發(fā)酵驗證,發(fā)酵周期60 h。發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測SAM產(chǎn)量和菌體生物量(OD600nm),結(jié)果如圖4所示。

    圖 4 缺失mtnN基因?qū)AM產(chǎn)量及菌體生物量的影響Fig. 4 Effect of mtnN knockout on SAM yield and biomass

    由圖4可以看出,工程菌HZ-12ΔmtnN的生物量相比于原始菌HZ12降低了26%,說明SAHN對菌體的生長有一定的作用,缺失后菌體的生長變緩。此外,工程菌 HZ-12ΔmtnN的SAM產(chǎn)量僅有4.54 mg/L,與原始菌HZ12相比降低了51%,這可能與菌體生長受阻有關(guān)。

    2.2 反義RNA抑制mtnN基因表達對解淀粉芽孢桿菌SAM的影響

    2.2.1 反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌的構(gòu)建

    為在不影響菌體生長繁殖的條件下,探索SAHN對B.amyloliquefaciensHZ-12合成SAM的影響。利用反義RNA技術(shù)抑制mtnN基因的表達,考察抑制SAHN對B. amyloliquefaciensHZ-12 SAM合成的影響。由于反義RNA的抑制效率與反義RNA在目標(biāo)基因5’端不翻譯區(qū)域結(jié)合位置有關(guān),因此在mtnN基因5’端不翻譯區(qū)域選擇了不同的結(jié)合區(qū)域,結(jié)合長度分別為100、77 bp和144 bp,而基因編碼區(qū)域選擇的結(jié)合長度為100 bp。利用1.3.3節(jié)方法構(gòu)建重組載體pHY-mtnNasRNA-1、pHYmtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3。以B. subtilis 168的基因組為模板,根據(jù)表3引物通過PCR擴增啟動子P43,大小為305 bp,通過引物mtnNasRNA-F和rrnB-R,以質(zhì)粒pUC19-mtnNasRNA為模板擴增目的片段和rrnB終止子,大小分別為200、250 bp,經(jīng)SOE-PCR融合后的產(chǎn)物大小為755 bp,SOE-PCR融合片段與質(zhì)粒pHY300經(jīng)酶切和酶連后轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α,轉(zhuǎn)化后得到質(zhì)粒pHYmtnNasRNA-1。通過引物mtnNasRNA-F和mtnNasRNA-2-R (mtnNasRNA-3-R),以質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-1為模板擴增,大小分別為177、244 bp,產(chǎn)物回收純化后與pHY-mtnNasRNA-1質(zhì)粒經(jīng)酶切和酶連后轉(zhuǎn)化至 E. coli DH5α。選取驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子,抽提質(zhì)粒并用BamHI和XbaI酶切質(zhì)粒,電泳檢測結(jié)果如圖5所示,重組質(zhì)粒酶切片段大小與預(yù)期相符合,構(gòu)建好的質(zhì)粒測序結(jié)果顯示正確,表明pHY-mtnNasRNA-1、 pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖 5 重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig. 5 Identification of recombinant plasmids by double enzymatic digestion

    圖 6 重組菌株質(zhì)粒PCR驗證Fig. 6 PCR validation of plasmids from recombinant strains

    將已構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-1、pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3電轉(zhuǎn)化至B. amyloliquefaciensHZ-12中,用引物pHY-F/pHY-R進行菌落PCR驗證,挑選正確的陽性克隆子進行質(zhì)粒DNA提取,通過PCR驗證(圖6),并測序進一步驗證,確認序列正確無誤,說明反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3構(gòu)建成功。

    2.2.2 反義RNA抑制mtnN基因表達對SAM含量的影響

    研究表明,反義RNA能一定程度抑制某特定基因的表達,而菌體的生長繁殖不受影響。為驗證反義RNA抑制mtnN基因?qū). amyloliquefaciensHZ-12合成SAM的影響,按照1.1.3節(jié)和1.3.4節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3以及對照菌株HZ-12/pHY300和原始菌HZ-12進行發(fā)酵驗證,發(fā)酵周期60 h。并測定發(fā)酵終點的SAM產(chǎn)量和菌體生物量(OD600nm)。

    圖 7 反義RNA抑制mtnN基因表達對SAM含量的影響Fig. 7 Effect of mtnN expression inhibition by asRNA on SAM production

    由圖7可以看出,工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3發(fā)酵后SAM產(chǎn)量分別為14.58、12.27 mg/L和12.49 mg/L, 相比于對照菌HZ-12/pHY300分別提高了44%、22%和24%,其中工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1效果最明顯。由于反義RNA的抑制效率與反義RNA在目標(biāo)基因5’端不翻譯區(qū)域結(jié)合位置有關(guān),所以在mtnN基因5’端不翻譯區(qū)域選擇不同的結(jié)合區(qū)域,對mtnN基因的抑制程度不同,從而影響SAM循環(huán)途徑,導(dǎo)致不同的SAM產(chǎn)量。而工程菌的生物量與對照菌相比沒有明顯差別,說明反義RNA抑制mtnN基因的表達既可促進SAM的積累,又不影響菌體的生長。

    3 討 論

    SAM是人體必需的生物活性輔因子,廣泛參與生物體內(nèi)各種代謝反應(yīng),尤其是作為甲基供體參與生物體內(nèi)一百多種甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)[25-26]。mtnN基因同時參與SAM的兩個循環(huán)利用途徑,敲除或抑制該基因有望降低SAM的循環(huán)利用,促進SAM的積累。本研究基于基因敲除技術(shù)和反義RNA特異性抑制技術(shù),成功構(gòu)建了mtnN基因缺失菌株HZ-12ΔmtnN以及抑制mtnN的反義RNA工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和 HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3。通過發(fā)酵驗證,發(fā)現(xiàn)缺失mtnN基因的菌株生長受到嚴(yán)重抑制,這與其他研究結(jié)果一致,SAHN在細胞內(nèi)具有重要作用,其活性的下降會造成胞內(nèi)SAH的累積,SAH是SAM依賴甲基轉(zhuǎn)移酶的反饋抑制劑,胞內(nèi)低濃度的SAH的積累就會使甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)得到全面抑制,從而嚴(yán)重影響細菌的生長和分裂[27]。同時,缺失菌株HZ-12ΔmtnN SAM產(chǎn)量僅有4.54 mg/L,與原始菌HZ12相比降低了51%,這可能是其菌體生長受阻造成的直接結(jié)果。

    傳統(tǒng)的基因敲除方法可能會導(dǎo)致菌體生長受緩甚至死亡,而反義RNA介導(dǎo)的調(diào)控機制可以被用于代謝途徑的微調(diào),常用于平衡細胞生長和產(chǎn)物的合成[28-30]。同樣,本研究所構(gòu)建的反義RNA抑制mtnN基因工程菌株,對菌體的生長沒有顯著的抑制作用。同時,工程菌的SAM產(chǎn)量相比于對照菌均有顯著的提高,特別是工程菌 HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1,SAM的產(chǎn)量提高了44%。本研究通過反義RNA抑制技術(shù)精細調(diào)控mtnN基因,在不影響菌株生長的條件下,顯著增強了SAM的合成,為SAM生產(chǎn)菌的代謝工程育種提供了一種新型的策略。總體而言,目前從頭合成SAM的產(chǎn)率普遍較低。究其原因可能是目前微生物自身合成甲硫氨酸的能力普遍較弱,未來的研究需通過系統(tǒng)代謝工程改造強化菌株自身合成甲硫氨酸的能力,進一步提高SAM的產(chǎn)量。

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