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    混合酵母發(fā)酵對刺葡萄酒香氣成分 氣味活性的調(diào)整作用

    2020-04-02 03:32:12李愛華王凌云王倩倩張琳尉陶永勝
    食品科學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:酒樣乙酯葡萄酒

    李愛華,王凌云,粟 俊,王倩倩,張琳尉,陶永勝,

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.商洛市蠶果站,陜西 商州 726000;3.湖南刺葡萄研究中心,湖南 洪江 418200;4.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

    我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)方興未艾,由于大部分釀酒葡萄品種引自歐洲,產(chǎn)品多樣化受限,質(zhì)量同質(zhì)化問題突出。為實現(xiàn)中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的本土化和多元化,我國特有的葡萄品種逐漸受到關(guān)注。刺葡萄(Vitis davidiiFo?x)是我國獨有的野生葡萄種,與鮮食葡萄相比,刺葡萄一般果粒小、果皮厚、顏色深、產(chǎn)量高,釀制的葡萄酒具有特殊的氣味特征[1]。關(guān)于刺葡萄酒的釀造研究,多數(shù)集中在刺葡萄及其酒中的營養(yǎng)功能性成分,例如色素和多酚物質(zhì)[2-3],而對刺葡萄酒香氣淡弱的技術(shù)問題仍然缺少針對性研究,因此研究刺葡萄酒增香釀造的理論并開發(fā)相應(yīng)技術(shù)手段具有產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要意義。

    釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,Sc)因其較高的乙醇轉(zhuǎn)化率、乙醇耐受性以及發(fā)酵純凈度,一直是葡萄酒生產(chǎn)中的主流酵母。近10年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一些非釀酒酵母具有促進葡萄酒風(fēng)味形成的作用。然而,大多數(shù)非釀酒酵母由于乙醇的耐受性差,很難保證葡萄發(fā)酵的順利進行和完成。于是,非釀酒酵母與Sc的混合發(fā)酵成為葡萄酒增香釀造的一種有效方式[4]。截止目前,許多優(yōu)選非釀酒酵母菌株已被用于混合發(fā)酵改善葡萄酒風(fēng)味,但不同種的非釀酒酵母與Sc混合發(fā)酵的葡萄酒在香氣成分與感官質(zhì)量方面也存在較大差異[5]。發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)與Sc的混合發(fā)酵有利于增加酒中高級醇、乙酸酯以及中鏈脂肪酸的含量[6-7]。膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)的參與能提高酒中C6化合物、萜烯醇和一些酯類的含量,從而增強葡萄酒的果香和花香,但也有增加動物味的風(fēng)險[8]。戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)參與的混合發(fā)酵能夠增加酒中萜烯醇的含量[9],同時特異性地增加短鏈脂肪酸乙酯的含量,從而增強葡萄酒的果香及其香氣復(fù)雜性[10]。

    漢遜屬酵母(Hanseniaspora)之前一直被認(rèn)為是啟動葡萄汁乙醇發(fā)酵的尖端酵母,其高產(chǎn)乙酸的特性不利于形成高質(zhì)量葡萄酒的風(fēng)味[11]。隨后研究發(fā)現(xiàn),一些優(yōu)選的漢遜屬酵母具有高產(chǎn)糖苷酶的能力,且其糖苷酶對葡萄酒的釀造環(huán)境有較強的適應(yīng)性[12]。此外,一些優(yōu)選漢遜屬酵母在發(fā)酵期間還能促進果香酯類物質(zhì)的生成,利于形成葡萄酒的香氣復(fù)雜性[13]。本實驗室前期在我國葡萄酒生境下篩選獲得1 株葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum,Hu),具有較高的適應(yīng)葡萄酒釀造環(huán)境的糖苷酶活性,并且在與Sc混合發(fā)酵過程中,能夠顯著促進一些果香酯類物質(zhì)的生成,明顯增強葡萄酒中的溫帶水果香氣[14-15]。本實驗研究優(yōu)選漢遜酵母菌株混合發(fā)酵對刺葡萄酒香氣質(zhì)量的調(diào)整作用,通過分析優(yōu)選Hu與Sc混合發(fā)酵對刺葡萄酒香氣成分的促進效果,旨在揭示混合發(fā)酵引起刺葡萄酒典型的品種香氣成分和發(fā)酵香氣成分的變化,確定理想的酵母接種策略,為刺葡萄酒增香釀造提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 原料

    刺葡萄:品種為“湘珍珠”,2017年10月采自湖南洪江縣“湖南刺葡萄研究中心”葡萄園(N27°14′25.49″,E110°18′10.10″),葡萄汁含糖量152.5 g/L,葡萄汁含酸量4.3 g/L(以酒石酸計),衛(wèi)生狀況良好。

    1.1.2 酵母與培養(yǎng)基

    Sc:CEREVISIAE釀酒酵母活性干粉(Actiflore?Laffort,F(xiàn)rance)。

    Hu:本實驗室優(yōu)選,中國典型培養(yǎng)物保藏中心的菌株,保藏號為M 2013658。

    培養(yǎng)基[16]:酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium,YEPD)、發(fā)酵培養(yǎng)基,所用培養(yǎng)基配制后均需121 ℃滅菌20 min。

    1.1.3 試劑

    葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、亞硫酸(含SO26%)(均為分析純) 天津化學(xué)試劑公司;乙酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、1-丁醇、己酸乙酯、(Z)-3-己烯-1-醇、2-辛醇、辛酸乙酯、里哪醇、2,3-丁二醇、癸酸乙酯、β-大馬酮、己酸、苯乙醇、辛酸等42 種化學(xué)標(biāo)品(均為色譜純) 美國Sigma公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    固相微萃取(solid-phase micro extraction,SPME)裝置(配有57330-U聯(lián)用手柄、DVB/CAR/PDMS萃取纖維(50/30 μm,2 cm)) 美國Supelco公司;QP2020氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀 日本島津公司;色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國Agilent公司。

    1.3 方法

    1.3.1 葡萄酒釀造

    刺葡萄原料200 kg,除梗破碎,同時添加60 mg/L的SO2,分裝至20 L玻璃罐中,4 ℃低溫浸漬12 h,隨后升溫至20 ℃接種酵母啟動發(fā)酵。發(fā)酵啟動后添加蔗糖使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到(11±0.5)%,控制發(fā)酵溫度25~28 ℃,每天壓皮渣帽3 次,同時監(jiān)測相對密度和溫度,待相對密度小于1.020時分離皮渣,壓榨酒繼續(xù)發(fā)酵,溫度控制在18~20 ℃之間,當(dāng)相對密度低于0.996,監(jiān)測還原糖質(zhì)量濃度,低于2 g/L時,添加60 mg/L的SO2終止發(fā)酵,將葡萄酒轉(zhuǎn)入干凈衛(wèi)生的細(xì)口玻璃瓶中滿罐密封貯藏,4 ℃貯藏,隨后進行3 次自然澄清和1 次膨 潤土(1 g/L)下膠處理,直至次年4月進行香氣成分分析。發(fā)酵各處理重復(fù)2 次。

    發(fā)酵接種策略[16]:Hu與Sc細(xì)胞數(shù)量比1∶1接種,各酵母菌株經(jīng)YEPD培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后接種葡萄醪,接種量按照106CFU/mL計算。接種處理:1)Hu和Sc同時接種(CF);2)Hu提前Sc 24 h接種(SF1);3)Hu提前Sc 48 h接種(SF2);4)Sc純接種(CK)。

    1.3.2 香氣成分的儀器分析

    SPME條件:取8 mL葡萄酒樣于裝有內(nèi)標(biāo)物質(zhì) (2-辛醇,0.4 mg/L)和磁力攪拌子的15 mL頂空瓶中,加入2.0 g NaCl,啟動攪拌子,在40 ℃水浴中平衡15 min,而后插入DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭,40 ℃吸附30 min,立即將萃取頭在GC進樣口解吸5 min后手動進樣,進行GC-MS分析。

    GC-MS條件:不分流進樣;柱升溫程序:以3 ℃/min從40 ℃升至130 ℃,再以4 ℃/min從130 ℃升至250 ℃,保持8 min;離子源、連接桿及進樣口的溫度均為250 ℃;電子源電壓70 eV;質(zhì)譜掃描范圍25~350 u,掃描頻率0.2 次/s。

    定性定量方法:采用與標(biāo)準(zhǔn)品特征離子比對、NIST 2017譜庫檢索的方法定性。采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物,無標(biāo)準(zhǔn)品的化合物以化學(xué)結(jié)構(gòu)相似和分子質(zhì)量相近為原則選擇標(biāo)準(zhǔn)品曲線進行定量。

    1.3.3 葡萄酒中氣味成分的活性比較

    通過各類揮發(fā)性成分的累積氣味活性值(即香氣成分含量與嗅覺閾值的比值,odor active value,OAV)比較不同處理酒樣的香氣質(zhì)量。首先,計算各處理酒樣中 同化學(xué)類別香氣成分的累積OAV(即Σ OAV),得到香 氣活性累積值矩陣為[Xij],其中i代表不同化學(xué)類別,j代表不同處理樣品,然后通過歸一化處理(即除以不同處理中對應(yīng)類別的最大值Ximax)映射到[0,1]區(qū)間,得到矩陣[Yij]。對Yij作雷達(dá)圖直觀展示不同處理酒樣中不同化學(xué)類別香氣成分的氣味活性變化,進行香氣質(zhì)量比較。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    不同發(fā)酵處理間的數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析(ANOVA),并進行Duncan檢驗的多重比較,不同發(fā)酵處理間的香氣成分分布規(guī)律采用主成分分析(principal component analysis,PCA),數(shù)據(jù)處理運用SPSS 19.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)軟件實現(xiàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 香氣成分的SPME-GC-MS分析

    表 1 不同發(fā)酵處理酒樣中香氣成分的SPME-GC-MS分析Table 1 SPME-GC-MS analysis of aroma compounds of wine samples from different fermentation treatments

    續(xù)表1

    不同發(fā)酵處理酒樣中共定量分析出47 種香氣成分(表1),其中品種香氣成分13 種,包括C6化合物、萜烯類、C13-去甲類異戊二烯、硫醇、揮發(fā)性酚類、醛酮類6 類;發(fā)酵香氣成分34 種,包括高級醇、脂肪酸、酯類、苯乙基類化合物4 類。

    對不同處理樣品中10 類香氣物質(zhì)進行PCA,前2 個主成分分別占總體方差的57.0%和30.5%,前2 個主成分上香氣類別的載荷及酒樣的分布見圖1。C6化合物、硫醇、揮發(fā)性酚類、醛酮類、高級醇、短鏈脂肪酸乙酯、其他酯以及苯乙基類化合物主要分布在酒樣SF2周圍,處于PC1正向端。CK酒樣在PC1負(fù)向端,周圍分布有萜烯類和C13-去甲類異戊二烯。脂肪酸和中鏈脂肪酸乙酯處于PC2正向端,CF和CK在其左右,而SF1在PC2負(fù)向端。綜合分析可得,SF2促進了大多數(shù)發(fā)酵香氣成分的生成,除硫醇外,不利于品種香氣成分的積累。

    圖 1 前2 個主成分上香氣化合物類別的載荷及供試酒樣的分布Fig. 1 Loadings of various classes of aroma compounds and distribution of wine samples on the first two PCs

    2.2 品種香氣分析

    混合發(fā)酵酒樣中萜烯類、C13-去甲類異戊二烯化合物的含量明顯比CK酒樣中的低(表1),對于C6化合物,混合發(fā)酵卻增加了酒樣中的該類物質(zhì)含量,并且隨著Sc接種時間的延遲增加幅度越大,相比CK酒樣,SF2酒樣中的1-己醇含量顯著升高。值得注意的是,在刺葡萄干紅葡萄酒中檢測到了2 種硫醇類物質(zhì),3-甲硫基丙酸乙酯和3-甲硫基-1-丙醇,并且與CK酒樣相比混合發(fā)酵顯著提高硫醇類化合物含量,增加量在50%左右。另一類在混合發(fā)酵樣品中含量顯著增加的是揮發(fā)性酚,丁子香酚是供試酒樣中檢測到的唯一的揮發(fā)性酚,在混合發(fā)酵酒樣中的含量顯著高于CK酒樣,且含量接近于嗅覺閾值。醛酮類物質(zhì)在不同酒樣之間差異不大。對OAV大于0.1的品種香氣成分進行PCA,結(jié)果如圖2所示。PC1和PC2分別占總體方差的52.0%和35.4%。不同發(fā)酵處理之間差異明顯,與CK相比,混合發(fā)酵增加了β-大馬酮、3-甲硫基-1-丙醇、1-己醇、丁子香酚的質(zhì)量濃度,其中含量較大的里哪醇與β-紫羅蘭酮的含量遠(yuǎn)不及CK酒樣中的多,這也是混合發(fā)酵引起萜烯類和C13-去甲類異戊二烯化合物含量下降的主要原因。

    圖 2 前2 個主成分上品種香氣成分的載荷及供試酒樣的分布Fig. 2 Loadings of varietal aroma compounds and distribution profiles of wine samples on the first two PCs

    2.3 發(fā)酵香氣分析

    對于發(fā)酵香氣成分,混合發(fā)酵顯著增加了刺葡萄酒中高級醇的含量,但其總質(zhì)量濃度低于250 mg/L(表1)。 混合發(fā)酵酒樣中,異丁醇、1-丁醇、異戊醇、1-辛醇、 3-甲基-1-戊醇、3-乙氧基-1-丙醇和2,3-丁二醇的含量顯著高于CK酒樣,其中異戊醇的OAV大于1,1-丁醇和2,3-丁二醇的OAV小于0.1,其余OAV在0.1~1之間。供試酒樣中一共檢測到15 種酯類物質(zhì),概括為乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯、中鏈脂肪酸乙酯和其他酯類。由表1可見,順序接種處理顯著提高了刺葡萄酒中乙酸酯的含量,其中乙酸乙酯的質(zhì)量濃度是CK酒樣中的2~4 倍,這是因為SF2處理中Hu存活時間較長,產(chǎn)生的乙酸及其酯類也更多。乙酸酯中乙酸異戊酯含量顯著增加,且其OAV大于1,賦予刺葡萄酒香蕉香氣特征。供試酒樣中檢測出3 種短鏈脂肪酸乙酯,分別為2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯和丁酸乙酯,它們的OAV均大于1,CF和SF2處理顯著提高了它們的質(zhì)量濃度,可增強葡萄酒的果香。而混合發(fā)酵顯著降低了刺葡萄酒中中鏈脂肪酸乙酯的質(zhì)量濃度,尤其是順序接種處理。此外,混合發(fā)酵顯著提高了刺葡萄酒中其他酯的質(zhì)量濃度,尤其是乳酸乙酯,含量比CK酒樣中增加了約50%。相比CK酒樣中的脂肪酸含量,順序接種處理酒樣中的含量顯著降低,而CF酒樣中的含量卻明顯升高,這與中鏈脂肪酸乙酯的含量變化一致。對于苯乙基類化合物,混合發(fā)酵顯著提高了苯乙基類化合物的含量,其中SF2處理中的含量是CK酒樣中的1.8 倍(表1)。

    圖 3 前2 個主成分上發(fā)酵香氣成分的載荷及供試酒樣的分布Fig. 3 Loadings of fermentative aroma volatiles and distribution profiles of wine samples on the first two PCs

    對OAV大于0.1的發(fā)酵香氣成分進行PCA,PC1、PC2分別占數(shù)據(jù)總體方差的45.7%和43.8%,前2 個主成分上發(fā)酵香氣成分的載荷及供試酒樣分布見圖3。分析可見,不同接種處理對發(fā)酵香氣成分含量的影響大不一樣,混合發(fā)酵明顯增加了刺葡萄酒中的發(fā)酵香氣成分含量,其中順序接種處理明顯有利于乙酸酯類、短鏈脂肪酸乙酯類和苯乙基類成分的增加,CF處理在乙醇酯和脂肪酸含量上有優(yōu)勢,而CK酒樣僅在中鏈脂肪酸乙酯含量上較高。

    2.4 累積氣味活性分析

    圖 4 不同發(fā)酵處理的刺葡萄酒樣中各類揮發(fā)性成分的累積氣味活性比較Fig. 4 Comparison of cumulative odor activity values of all volatile chemicals in wine samples from different fermentation treatments

    將供試葡萄酒中不同化學(xué)類別的揮發(fā)性成分的OAV累積,并作不同發(fā)酵處理之間的數(shù)據(jù)歸一化處理,比較結(jié)果如圖4所示。混合菌種發(fā)酵處理不利于刺葡萄酒中品種香氣成分的氣味表現(xiàn),盡管C6化合物、揮發(fā)性酚和硫醇的OAV有所提高,但由表1可知,混合發(fā)酵并沒有讓其質(zhì)量濃度超過嗅覺閾值,反而重要的萜烯類和C13-去甲類異戊二烯類化合物的氣味活性明顯下降。混合發(fā)酵提高了刺葡萄酒中發(fā)酵香氣成分的氣味活性,CF在乙醇酯的氣味活性上有明顯優(yōu)勢,而順序接種提高了乙酸酯和苯乙基類化合物的氣味活性,尤其是SF2處理。根據(jù)來源于刺葡萄酒原料和乙醇發(fā)酵中各類氣味成分的香氣特征,CF和SF2處理酒樣相比CK酒樣有較好的果香和花香,其中CF果香更好,SF2花香更濃。

    3 討 論

    本研究混合發(fā)酵處理顯著影響了刺葡萄酒中香氣成分的化學(xué)輪廓,并且對品種香氣成分和發(fā)酵香氣成分的影響作用有刺葡萄和接種方式的獨特性。品種香氣成分主要來源于葡萄果皮中香氣前體物質(zhì)的水解[27],主要有萜烯類、C13-去甲類異戊二烯化合物、C6化合物等,其含量決定了葡萄酒香氣的品種典型性。萜烯類化合物是由葡萄萜烯類香氣糖苷在乙醇發(fā)酵過程中酶解釋放,里哪醇是葡萄酒中含量較高的萜烯醇,對葡萄酒香氣有積極作用[28]。C13-去甲類異戊二烯化合物源于葡萄中類胡蘿卜素的分解,其中β-大馬酮、β-紫羅蘭酮是非芳香型葡萄品種酒中較為重要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)[29]。本研究中,混合發(fā)酵降低了萜烯類和C13-去甲類異戊二烯化合物的含量,這與先前在歐亞種葡萄中增香釀造的結(jié)果相悖[8-9]。 可能這兩類物質(zhì)的前體在刺葡萄中的含量比歐亞種葡萄少,混合發(fā)酵促進前體水解的游離態(tài)物質(zhì)隨發(fā)酵過程揮發(fā)損失,造成混合發(fā)酵酒樣中這些物質(zhì)的含量較低。混合發(fā)酵增加了刺葡萄酒中C6化合物和揮發(fā)性酚類的含量,并且增加幅度隨Sc接種時間的延遲而加大。高含量的C6化合物常常是葡萄酒生青味的原因,較高含量的揮發(fā)性酚也會帶給葡萄酒香氣的負(fù)面效應(yīng),但累積OAV分析說明混合發(fā)酵對這兩類物質(zhì)的氣味促進作用有限。刺葡萄酒中硫醇類物質(zhì)含量較高,并且本研究中混合發(fā)酵提高了該類物質(zhì)的含量。Gil等[30]發(fā)現(xiàn)在Hu參與的混合發(fā)酵Monastrell葡萄酒中3-甲硫基-1-丙醇的含量顯著升高,且具有果香貢獻。3-甲硫基丙酸乙酯是一種較罕見的香氣物質(zhì),目前僅在瓊瑤漿、玫瑰香葡萄酒中鑒定出少量的該物質(zhì)[31]。由此推斷,增加的硫醇類物質(zhì)可能會給刺葡萄酒的果香帶來積極影響。

    葡萄酒發(fā)酵香氣成分主要來源于酵母在乙醇發(fā)酵過程中的代謝副產(chǎn)物,高級醇是其中含量最多的一類化合物,有研究表明,葡萄酒中低于300 mg/L的高級醇會帶來令人愉悅的香氣復(fù)雜性[32]。本研究中,混合發(fā)酵雖然顯著增加了刺葡萄酒中高級醇的含量,但總質(zhì)量濃度低于300 mg/L,有6 種高級醇OAV大于0.1,說明Hu和Sc的混合發(fā)酵能夠增強刺葡萄酒的醇香特征。酯類物質(zhì)是葡萄酒中含量僅次于高級醇的發(fā)酵香氣成分,本研究順序接種處理顯著提高了刺葡萄酒中乙酸酯的質(zhì)量濃度,這是Hu菌株具有高產(chǎn)乙酸的特性所致[11]。值得注意的是,混合發(fā)酵增加了刺葡萄酒中果香類短鏈脂肪酸乙酯的含量,卻顯著降低了中鏈脂肪酸乙酯的含量,尤其是順序接種處理,這與Hu和Sc混合發(fā)酵在歐亞種葡萄酒處理中的結(jié)果[15]相悖,這可能是刺葡萄品種本身的差異所引起的,值得深入研究。對于其他酯類,雖然混合發(fā)酵顯著提高了乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯的質(zhì)量濃度,但由于其OAV較低,增加的幅度不足以影響香氣質(zhì)量。脂肪酸是乙醇發(fā)酵過程中酵母的正常代謝產(chǎn)物,也是維持酯類水解平衡的重要物質(zhì),但是較高含量的脂肪酸(~11 mg/L) 會給葡萄酒帶來酸臭味[33]。本研究中,順序接種處理酒樣中的脂肪酸含量顯著降低,而CF酒樣中的含量卻明顯升高,并且所有處理中脂肪酸的質(zhì)量濃度低于 5 mg/L。苯乙基類化合物通常具有玫瑰花的香氣特征,對葡萄酒的香氣質(zhì)量可產(chǎn)生積極的影響。有研究揭示,嗜高壓有孢漢遜酵母(H. osmophila)與Sc混合發(fā)酵可使歐亞種葡萄酒中乙酸苯乙酯的含量提高了2~8 倍[34]。 本研究中,優(yōu)選菌株的混合發(fā)酵顯著提高了苯乙基類化合物的含量,對刺葡萄酒香氣質(zhì)量的改善具有重要的促進作用。綜合考慮刺葡萄酒的品種和發(fā)酵香氣,相比于CK,CF和SF2處理對果香和花香類氣味成分具有良好的促進作用。

    總體上,刺葡萄酒中品種香氣成分的總體質(zhì)量濃度較低,而優(yōu)選Hu和Sc混合發(fā)酵通過促進發(fā)酵香氣成分的生成有利于刺葡萄酒香氣質(zhì)量的提升,且CF處理對果香類氣味成分具有較好的促進作用,間隔48 h的順序接種處理對花香類成分的促進效果更好。

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