藍(lán)氏賈第鞭毛蟲末端結(jié)合蛋白1基因的克隆與原核表達(dá)

李汶霖,王鴻斌,李淑凝,王洋?,李志敏,沈海娥,劉紅寧,李幽美,趙旭安

1995年，Kohler S等通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到一個(gè)與結(jié)腸腺瘤狀息肉蛋白(Aleriournatious polysis coli，APC)相互作用的蛋白質(zhì)，由于該蛋白質(zhì)是與APC的羧基端相互作用，因此被命名為末端結(jié)合蛋白1(End-binding protein 1，EB1)[1，2]。EB1在進(jìn)化上非常保守，目前為止，在細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物中都鑒定出EB1的同源蛋白。EB1蛋白是一種重要的微管結(jié)合蛋白，其N端具有CH結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)介導(dǎo)與微管的相互作用；C端是包含有EBH結(jié)構(gòu)域的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)介導(dǎo)EB1的二聚化，并介導(dǎo)EB1與其他蛋白的相互作用；中間無定型結(jié)構(gòu)的連接區(qū)將EB1的N端和C端連接起來。EB1對(duì)于微管的動(dòng)態(tài)性調(diào)節(jié)具有重要的作用，并進(jìn)而參與微管介導(dǎo)的多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞極化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞有絲分裂等[3-6]。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardialambia，簡(jiǎn)稱賈第蟲)是一種世界性分布的條件致病性原生動(dòng)物，能夠寄生于人和多種哺乳動(dòng)物的小腸和膽囊引起以腹瀉、腹痛和吸收不良為主要表現(xiàn)的賈第蟲病[7]。賈第蟲被認(rèn)為是最原始的真核生物之一，具有簡(jiǎn)單的遺傳背景，非常適合用于保守基因的功能研究[8]。在前期實(shí)驗(yàn)中[9，10]，我們通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)賈第蟲EB1(gEB1)蛋白能與賈第蟲的特有骨架蛋白成分-α賈第素成員發(fā)生相互作用。為了更好的研究其相互作用機(jī)制，本研究擬從賈第蟲基因組中克隆geb1基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物將為gEB1抗體的制備和功能研究提供材料[11]。

材料與方法

1材料

C2株賈第蟲、大腸桿菌菌株E.coliRosetta(DE3)、E.coliTOP10、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28α(+)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、Pyrobest DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物公司；DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、T4 DNA連接酶和DAB顯色試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；兔源抗His單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物合成及測(cè)序工作由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

2方法

2.1 C2 株賈第蟲滋養(yǎng)體的培養(yǎng)將液氮內(nèi)凍存的C2 株賈第蟲復(fù)蘇，轉(zhuǎn)移到含改良TY-S-33培養(yǎng)基玻璃試管中，于37℃恒溫箱培養(yǎng)。3 d后待蟲體長(zhǎng)滿管壁，用冰浴法傳代。將一支管壁長(zhǎng)滿滋養(yǎng)體的試管冰浴10 min取出，在雙手掌間多次滾搓培養(yǎng)管，使貼壁生長(zhǎng)的蟲體完全自管壁脫落，吸取蟲體培養(yǎng)液無菌條件下平均分裝成三管，37℃培養(yǎng)，2 ～3 d可長(zhǎng)滿管壁。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。選取傳代兩次、生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)期蟲體，離心收集蟲體團(tuán)塊。

2.2 PCR 擴(kuò)增geb1基因片段使用DNA Kit試劑盒，按說明書提取C2型藍(lán)氏賈第蟲全基因組DNA。

根據(jù)GenBank上WB型賈第蟲eb1基因(XM_

001706021.1)序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，P1(上游引物):5’-CATGCCATGG GCATGGCGCCGGTAAAAGCAC-3’和P2(下游引物):5’-CCGCTCGAGCTGATGATACTCCGCATACAGAATATC-3’，上下游引物分別含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。以賈第蟲DNA為模板，P1、P2為引物，PCR 擴(kuò)增目的序列，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，DNA膠回收試劑盒回收目的片段，回收產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳估濃度。

2.3 gEB1原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建膠回收產(chǎn)物和pET-28α(+)載體分別經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，37℃4 h，酶切產(chǎn)物膠回收后瓊脂糖電泳估濃度。酶切回收后的目的基因和pET-28α(+)載體按摩爾比4∶1混合，16℃連接反應(yīng)4 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性單克隆菌落搖菌提質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

2.4 gEB1賈第素重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)，涂卡那霉素和氯霉素雙抗平板，挑取陽(yáng)性單菌落于含雙抗的液體LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)過夜按1%的接種量轉(zhuǎn)接于3 mL 新鮮雙抗LB培養(yǎng)基中，剩余菌液提取質(zhì)粒并送檢測(cè)序，測(cè)序正確者進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，確保構(gòu)建的質(zhì)粒無堿基突變。當(dāng)OD600達(dá)到0.4 ～0.6時(shí)加入0.1 mM終濃度的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于30℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。收集菌液離心，用200μL 無菌水和等體積2×SDS上樣緩沖液重懸，煮沸5 min后離心，取20μL 上清行SDS-PAGE。電泳后一部分條帶用考馬斯亮藍(lán)染色觀察，一部分經(jīng)濕轉(zhuǎn)法l50 mA 1.5 h電轉(zhuǎn)移至NC膜用于Western blot 鑒定。轉(zhuǎn)完后的NC膜脫脂奶室溫封閉2 h，以抗His-Tag 兔源多克隆抗體(1∶1 000)為一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌3次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫反應(yīng)l h，TBST 洗滌后經(jīng)DAB顯色，觀察結(jié)果。

結(jié)果

1 geb1基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

提取C2株賈第蟲全基因組DNA進(jìn)行濃度的測(cè)定。微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)可見一單峰，OD260/OD280為1.822 8，說明樣本純度較高，濃度為414.266 1 ng/μL。以賈第蟲基因組DNA 為模版克隆geb1基因編碼區(qū)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見760 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符(圖1)。

圖1 geb1基因PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

目的基因經(jīng)雙酶切后與pET-28α(+)相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiTOP10，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切鑒定，電泳分別可見約760 bp的geb1基因目的片段、約5 300 bp的載體pET-28α(+)兩條電泳條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，將進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pET-28α(+)-gEB1。

圖2 pET-28α(+)-gEB1表達(dá)載體的雙酶切鑒定

3 geb1基因的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

重組質(zhì)粒pET-28α(+)-gEB1轉(zhuǎn)化E. coliRosetta(DE3)，0.1 mM IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)5 h，并將所得產(chǎn)物煮沸裂解進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，以未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為對(duì)照，SDS-PAGE驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)結(jié)果(圖3)。結(jié)果顯示誘導(dǎo)菌在分子量29 kDa 處有出現(xiàn)一條明顯的條帶，而未誘導(dǎo)菌沒有此條帶，與預(yù)期相符合(圖4)。Western blot 確認(rèn)此條帶確為gEB1-His Tag 融合蛋白。

圖3 SDS-PAGE電泳鑒定IPTG 誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)情況

圖4 geb1基因融合蛋白Western blot 分析

討論

EB1蛋白是一種微管正極示蹤蛋白(plus-end tracking proteins，+TIPs)，能夠結(jié)合在微管正在生成的正末端，促進(jìn)微管持續(xù)性生長(zhǎng)。EB1蛋白家族與其它+TIPs的主要區(qū)別在于EB1能夠自發(fā)的追蹤生長(zhǎng)微管的正末端而不依賴于任何其它蛋白質(zhì)和分子，并且EB1可以通過與+TIPs的相互作用，發(fā)揮平臺(tái)作用，將其它+TIPs募集到微管的正末端使其發(fā)揮各自的功能[12-14]。因此EB1蛋白在形成微管正末端復(fù)合物中具有核心作用，影響微管動(dòng)態(tài)性。

賈第蟲具有高度發(fā)達(dá)的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，由微管、微絲和細(xì)胞骨架蛋白所構(gòu)成，近年來的研究證實(shí)，賈第蟲的細(xì)胞骨架蛋白與其感染和致病有著密切關(guān)系[15]。賈第素是一類特異性細(xì)胞骨架蛋白[16，17]，目前已將其分成α-賈第素、β-賈第素、γ-賈第素和δ-賈第素4 大家族，每一個(gè)成員的具體功能目前未知[18-20]。以往的研究顯示，gEB1能夠與γ-賈第素直接發(fā)生相互作用。我們通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，gEB1與α-賈第素家族的成員也存在相互作用。通過鑒定gEB1蛋白與賈第素蛋白相互作用的機(jī)制和生物學(xué)意義去反推兩種賈第素的具體功能或許是個(gè)有效的方法，為此我們克隆了geb1基因并進(jìn)行了原核表達(dá)。

由于賈第蟲沒有內(nèi)含子的原始特性，我們直接從賈第蟲的基因組上克隆了gEB1的編碼區(qū)，測(cè)序結(jié)果顯示C2株賈第蟲eb1基因序列與WB株相同，編碼的gEB1蛋白由238個(gè)氨基酸殘基組成，分子量大約是29kDa，略小于人類的EB1蛋白，具有明確分區(qū)的CH結(jié)構(gòu)域和EBH結(jié)構(gòu)域[21]。但gEB1蛋白序列與高等動(dòng)物的同源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在較大的差異，因此市售的小鼠或者人類EB1蛋白抗體均不能和gEB1結(jié)合。為了進(jìn)一步證明gEB1與α-賈第素成員的相互作用，制備gEB1特異性抗體成為當(dāng)務(wù)之急，gEB1的原核表達(dá)為其抗體的制備提供了基礎(chǔ)，賈第蟲也可作為EB1蛋白功能研究的良好模式生物。