《日本血吸蟲抗體檢測(cè) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)》(WS/T 630-2018)標(biāo)準(zhǔn)解讀

張世清, 章樂生, 汪峰峰, 汪天平

血吸蟲病是世界衛(wèi)生組織確定的六大重點(diǎn)熱帶病之一，也是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民身體健康和阻礙經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的重大傳染病。 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(以下簡(jiǎn)稱“IHA”)作為一種經(jīng)典的血吸蟲病免疫學(xué)診斷方法，較早應(yīng)用于我國(guó)血吸蟲病流行區(qū)人群查病工作[1，2]。 憑借其較高的敏感性以及技術(shù)成熟、操作便捷、價(jià)格低廉等特點(diǎn)[3-5]，在安徽、湖南、湖北、江西、云南、浙江等血吸蟲病流行省份，IHA 方法普遍應(yīng)用于疫區(qū)人群血吸蟲病篩查，目前已占全國(guó)篩查人群的70%以上，為當(dāng)前我國(guó)血吸蟲病現(xiàn)場(chǎng)人群查病的主要方法[6]。 但是，IHA 方法在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用時(shí)也存在一定的不足之處。 因其方法為半定量，且對(duì)結(jié)果判斷需肉眼觀察，存在一定的主觀性[6]。原衛(wèi)生部于2006 年曾發(fā)布《血吸蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS261-2006)，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血吸蟲病的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷標(biāo)準(zhǔn)和鑒別診斷，但目前尚無日本血吸蟲抗體檢測(cè)(間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn))技術(shù)規(guī)范文獻(xiàn)。 作為目前我國(guó)血吸蟲病主要診斷方法，缺乏統(tǒng)一規(guī)范的操作規(guī)程和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，不同地區(qū)、不同技術(shù)人員開展血吸蟲病檢測(cè)時(shí)，結(jié)果存在一定差異，亦影響了檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量、可信度和可比性。 因此，迫切需要建立一套標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程和判斷方法，以確保結(jié)果的可比性和準(zhǔn)確性，同時(shí)對(duì)我國(guó)當(dāng)前血吸蟲病診斷網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)也具有指導(dǎo)作用。 本標(biāo)準(zhǔn)的制定旨在通過規(guī)范日本血吸蟲抗體檢測(cè)(間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn))操作方法、結(jié)果判定、應(yīng)用范圍以及注意事項(xiàng)等，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，減小漏判和誤判，以適應(yīng)臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)防治工作的需求。

1 標(biāo)準(zhǔn)編制過程與方法

本標(biāo)準(zhǔn)是受原國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)政策法規(guī)司委托，安徽省血吸蟲病防治研究所、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所、浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所、江蘇省血吸蟲病防治研究所、江西省寄生蟲病防治研究所等單位有關(guān)專家共同編制。 在編制過程中先后召開2 次專家研討會(huì)，并函請(qǐng)全國(guó)從事寄生蟲病預(yù)防控制、臨床、教學(xué)、科研等單位的21 位專家征求意見。 21 位專家來自安徽、江蘇、湖南、湖北、江西、云南、四川、上海、廣東等省份，涵括了目前我國(guó)血吸蟲病重點(diǎn)流行省份。 本標(biāo)準(zhǔn)從起草至形成標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿過程中，起草組對(duì)收到的102 條專家反饋意見進(jìn)行逐項(xiàng)研究討論，其中采納38 條，部分采納15 條，未采納49 條。 在征集整理函審專家的意見過程中，函審專家對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)中采集樣本的放置時(shí)間和血清分離相對(duì)離心力的確定、試劑盒從冷藏儲(chǔ)存環(huán)境取出后平衡時(shí)間、致敏紅細(xì)胞懸液配制后放置不同時(shí)間對(duì)于結(jié)果的影響、觀察結(jié)果的最佳控制時(shí)間等4 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)關(guān)注點(diǎn)比較集中，本標(biāo)準(zhǔn)編制專家工作組對(duì)4 個(gè)指標(biāo)分別進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證與評(píng)價(jià)，根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證結(jié)果，討論并修訂該指標(biāo)的相關(guān)參數(shù)。 標(biāo)準(zhǔn)編制過程中采用查詢文獻(xiàn)資料、現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研及驗(yàn)證等方式，并廣泛征求疾病預(yù)防控制中心、寄生蟲病防治研究所以及高等院校等各領(lǐng)域?qū)＜业囊庖姡_保標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)用性和科學(xué)性。 本標(biāo)準(zhǔn)的編制參考了《血吸蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 261-2006)、《血吸蟲病控制和消除》(GB 15976-2015)、《血吸蟲病防治手冊(cè)》(第三版)等文獻(xiàn)，遵循《衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》相關(guān)規(guī)定并按照《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則》(GBT 1.1-2009)的體例和寫作方式進(jìn)行編制，最終形成了《日本血吸蟲抗體檢測(cè) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)》(WS/T 630-2018)衛(wèi)生行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)，并由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)于2018 年9 月26 日發(fā)布，2019 年4 月1 日實(shí)施。

2 標(biāo)準(zhǔn)的正文內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)。 正文由六個(gè)部分組成，包括標(biāo)準(zhǔn)適用范圍、術(shù)語和定義、所需儀器設(shè)備、試劑材料、檢測(cè)步驟和結(jié)果判定依據(jù)。 另外，標(biāo)準(zhǔn)附有三個(gè)資料性附錄，詳細(xì)介紹了標(biāo)準(zhǔn)中涉及到的主要試劑材料的制備方法、操作程序以及結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)。 本標(biāo)準(zhǔn)的制定，充分考慮了我國(guó)各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施設(shè)備，適合我國(guó)日本血吸蟲抗體檢測(cè)工作的實(shí)際需要，為我國(guó)血吸蟲病防治和臨床輔助診斷提供可靠的技術(shù)保障。 其主要內(nèi)容包括:

2.1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)日本血吸蟲抗體的技術(shù)規(guī)范，適用于各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)日本血吸蟲抗體的檢測(cè)。

2.2 術(shù)語和定義 本標(biāo)準(zhǔn)明確了血吸蟲病、間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、可溶性蟲卵抗原的定義，并進(jìn)行了科學(xué)解釋。

2.2.1 血吸蟲病 由血吸蟲寄生于人和其他哺乳動(dòng)物所引起的疾病，在我國(guó)特指日本血吸蟲病。

2.2.2 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 將抗原包被于紅細(xì)胞表面，成為致敏的載體，然后與相應(yīng)的抗體結(jié)合，通過抗體橋聯(lián)，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，以檢測(cè)樣本中的相應(yīng)抗體。 最常用的紅細(xì)胞為健康人“O”型紅細(xì)胞。

2.2.3 可溶性蟲卵抗原 血吸蟲蟲卵經(jīng)勻漿和超聲破碎等處理后離心收集的上清液，含蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖等多種成分復(fù)合物。

2.3 儀器設(shè)備 本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)采用間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)日本血吸蟲抗體必要的儀器設(shè)備及技術(shù)參數(shù)提出了要求，其必要的儀器設(shè)備應(yīng)包括臺(tái)式低速離心機(jī)、平板微量振蕩器、電熱恒溫水浴箱、微量移液器等，也為進(jìn)一步規(guī)范血吸蟲病診斷網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)提供了參考依據(jù)。 其中臺(tái)式低速離心機(jī)技術(shù)參數(shù)要求最高轉(zhuǎn)速≥2 500 r/min，或最大相對(duì)離心力≥800 g；平板微量振蕩器技術(shù)參數(shù)要求最高振動(dòng)頻率2 800 r/min，最大振幅6 mm；電熱恒溫水浴箱技術(shù)參數(shù)要求控溫范圍室溫+5 ℃～99.9 ℃，溫度分辨率/波動(dòng)度0.1 ℃/±0.5 ℃；微量移液器技術(shù)參數(shù)要求量程范圍10～100 μL，增量1 μL；量程范圍100 ～1 000 μL，增量5 μL。

2.4 試劑材料 本標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了“日本血吸蟲抗體檢測(cè) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)”主要試劑材料及技術(shù)參數(shù)。 試劑材料中除凍干致敏紅細(xì)胞以外，強(qiáng)調(diào)應(yīng)同時(shí)配置陽性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清，以確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 其中凍干致敏紅細(xì)胞的主要組成成分為日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原、健康人“O”型紅細(xì)胞和蔗糖，陽性對(duì)照血清的來源為感染日本血吸蟲的兔混合血清，陰性對(duì)照血清的來源為正常兔混合血清。 此外，也是首次明確要求將pH7.2 磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋液。 為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用“V”型微孔有機(jī)玻璃血凝板作為血凝反應(yīng)板。

2.5 檢測(cè)步驟 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了“日本血吸蟲抗體檢測(cè) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)”的操作規(guī)程及技術(shù)規(guī)范要求。 此外，本標(biāo)準(zhǔn)通過現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證，進(jìn)一步明確了檢測(cè)過程中涉及的采集樣本的放置時(shí)間、試劑盒從冷藏儲(chǔ)存環(huán)境取出后平衡時(shí)間、致敏紅細(xì)胞懸液配制后放置時(shí)間、觀察結(jié)果的最佳控制時(shí)間等關(guān)鍵指標(biāo)要求。

2.5.1 樣本準(zhǔn)備 明確檢測(cè)樣本為血清，可通過采集末梢血或靜脈血的方式，室溫下放置至血塊收縮后或離心分離出血清。

2.5.2 樣本檢測(cè) 在廣泛征集血防區(qū)相關(guān)省、市、縣等各級(jí)血防機(jī)構(gòu)專家意見的基礎(chǔ)上，對(duì)“日本血吸蟲抗體檢測(cè) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)”操作步驟進(jìn)行了明確規(guī)定，統(tǒng)一了操作規(guī)程。 在待檢樣本準(zhǔn)備好之后，樣本檢測(cè)過程依次按照樣本編號(hào)、溶解陽性對(duì)照及陰性對(duì)照血清、滴加稀釋液、倍比稀釋待檢血清以及陽性和陰性對(duì)照血清、稀釋凍干致敏紅細(xì)胞、血清稀釋孔滴加致敏紅細(xì)胞懸液、觀察結(jié)果等操作步驟。 本標(biāo)準(zhǔn)在征集專家意見的基礎(chǔ)上，對(duì)血清樣本稀釋、致敏紅細(xì)胞懸液加入方法以及觀察結(jié)果的條件進(jìn)行了統(tǒng)一。

2.6 結(jié)果判定 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，以效價(jià)≥1 ∶10 作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定只有在陰性對(duì)照血清不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，陽性對(duì)照血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，檢測(cè)結(jié)果才視為有效。

3 標(biāo)準(zhǔn)的附錄內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)有3 個(gè)資料性附錄，分別對(duì)主要試劑材料的制備方法、各個(gè)操作流程的注意事項(xiàng)以及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了詳盡的描述。

附錄A 為主要試劑材料制備方法。 本附錄對(duì)凍干致敏紅細(xì)胞、陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清以及稀釋液等主要試劑材料的制備方法進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述。 為保證主要試劑材料的質(zhì)量，本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了明確規(guī)定，其中凍干致敏紅細(xì)胞要求外觀為褐色或淡紅色疏松體，陽性對(duì)照血清檢測(cè)效價(jià)不低于1 ∶640；陰性對(duì)照血清檢測(cè)效價(jià)不高于1 ∶5；稀釋液為pH 7.2 磷酸鹽緩沖液。

附錄B 為操作程序。 本附錄對(duì)“日本血吸蟲抗體檢測(cè) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)”操作各個(gè)流程的注意事項(xiàng)進(jìn)行了詳盡的說明，包括采樣及樣本保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、反應(yīng)條件、觀察結(jié)果等。 如血樣采集后要求在4 h 內(nèi)進(jìn)行血清分離，待檢血清量不少于25 μL，如果采集樣本不能及時(shí)檢測(cè)應(yīng)置于-20℃以下冷凍條件下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間保存；檢測(cè)試劑應(yīng)放在室溫條件下平衡30 min 以上再行使用；紅細(xì)胞懸液使用前需充分混勻；結(jié)果觀察應(yīng)在10 min 內(nèi)完成等，否則將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 尤其是本附錄中依據(jù)操作流程首次制作了標(biāo)準(zhǔn)操作流程示意圖，便于本標(biāo)準(zhǔn)的宣貫及現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用。

附錄C 為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。 本附錄對(duì)“日本血吸蟲抗體檢測(cè) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)”陽性和陰性結(jié)果的判定方法和依據(jù)進(jìn)行規(guī)定，對(duì)凝集反應(yīng)的特征進(jìn)行了描述，并根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度的特點(diǎn)制作了不同反應(yīng)強(qiáng)度模式圖。

4 標(biāo)準(zhǔn)施行和宣貫重點(diǎn)

IHA 是迄今為止在我國(guó)血吸蟲病流行區(qū)應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)、使用范圍最廣、檢測(cè)人數(shù)最多的免疫學(xué)診斷方法。 但各基層血吸蟲病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在實(shí)際應(yīng)用過程中，依然存在諸多問題。 為了充分發(fā)揮該方法在我國(guó)消除血吸蟲病過程中的作用，加快推進(jìn)我國(guó)消除血吸蟲病進(jìn)程，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)宣傳貫徹的力度，進(jìn)一步規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施。 為此，在本標(biāo)準(zhǔn)的施行及宣貫工作中應(yīng)重點(diǎn)把握以下幾點(diǎn):① 樣本采集過程中，有的地區(qū)采用聚乙烯塑料管采集末梢(耳垂或手指)血，待血液凝固后離心分離血清，后用剪刀將凝固的血塊部分剪去保留血清部分。 在此過程中，需注意剪刀在剪去凝固血塊后，需用酒精棉球?qū)⒓舻稓堄嘌獫n擦除并進(jìn)行消毒，再用干棉球擦干后方可繼續(xù)使用，避免出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象。 ② 本標(biāo)準(zhǔn)“試劑材料”中推薦使用96 孔“V”型有機(jī)玻璃板，并在附錄部分特別強(qiáng)調(diào)有機(jī)玻璃板在使用后需及時(shí)清洗。 在操作過程中，使用96 孔“V”型有機(jī)玻璃板觀察結(jié)果后，如不及時(shí)進(jìn)行清洗，紅細(xì)胞和血清中蛋白等物質(zhì)易在孔底沉淀并牢固附著于孔底表面，再次使用有機(jī)板時(shí)，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。 ③在實(shí)際操作過程中，應(yīng)嚴(yán)格按照操作步驟示意圖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，不宜改動(dòng)相關(guān)步驟。 為便于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)人員操作，本標(biāo)準(zhǔn)在附錄B 中添加了操作步驟示意圖，使得間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單化、條理化。 但在現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證過程中，時(shí)常發(fā)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)人員仍按照以前操作流程，沒有完全按照本標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，如將“凍干致敏紅細(xì)胞稀釋”過程放在“待測(cè)樣本稀釋”過程之前。 血清樣本尚未稀釋，就將凍干致敏紅細(xì)胞進(jìn)行稀釋，會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞懸液在后期出現(xiàn)紅細(xì)胞沉淀于瓶底且不易混勻，在最后滴加紅細(xì)胞懸液時(shí)出現(xiàn)紅細(xì)胞濃度不均現(xiàn)象，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果及結(jié)果判斷。

本標(biāo)準(zhǔn)從儀器設(shè)備、試劑材料、檢測(cè)步驟、結(jié)果判斷以及操作注意事項(xiàng)等方面作了詳盡的介紹，以期指導(dǎo)檢驗(yàn)人員在操作過程中能夠做到操作的一致性，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，并克服或減少本方法所存在的主觀判斷所帶來的缺陷。 各地在實(shí)際工作過程中運(yùn)用間接血凝方法檢測(cè)血吸蟲抗體所存在的相關(guān)細(xì)節(jié)不同，為此，在做好本標(biāo)準(zhǔn)宣貫的同時(shí)，應(yīng)廣泛開展本標(biāo)準(zhǔn)操作的技能培訓(xùn)，使各使用部門以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員，能夠了解并掌握本標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)內(nèi)容和條款，熟練運(yùn)用間接血凝方法檢測(cè)血吸蟲抗體。各級(jí)血吸蟲病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)將本檢測(cè)方法作為血吸蟲病診斷網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室考核評(píng)估的重要內(nèi)容。