阿膠粗多糖脫蛋白方法比較及抑制酪氨酸酶活性研究

劉春媛 廖峰 汝文文

摘要 [目的]研究阿膠多糖的分離提純工藝及其抑制酪氨酸酶活性。[方法]針對(duì)阿膠多糖提取中蛋白質(zhì)的干擾，通過(guò)對(duì)幾種脫蛋白方法（TCA法、Sevage法、蛋白酶法）的比較，優(yōu)選出阿膠多糖提取液的脫蛋白方法，并探討阿膠多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。[結(jié)果]TCA法、Sevage法及蛋白酶法的脫蛋白率分別為78.94%、87.73%和29.97%，多糖保留率分別為73.96%、32.14%和72.57%。所得阿膠多糖對(duì)酪氨酸酶有一定的抑制作用，當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，抑制率為24.42%。[結(jié)論]TCA法脫蛋白率較高、多糖損失率較低，篩選方法可有效去除阿膠粗多糖中的蛋白，所得阿膠多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用。

關(guān)鍵詞 阿膠;多糖;脫蛋白方法;蛋白純化;酪氨酸酶

中圖分類(lèi)號(hào) R966 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0182-03

Abstract [Objective] The research aimed to study the separation and purification process of crude polysaccharide of donkeyhidegelatin and its inhibition of tyrosinase activity.[Method] Aiming at the interference of protein in the extraction of donkeyhidegelatin polysaccharides，the deproteinization method of donkeyhidegelatin polysaccharide extract was optimized by comparing several deproteinization methods（TCA method，Sevage method and protease method），the deproteinization method of donkeyhidegelatin polysaccharide extract was optimized，and the inhibitory effect of donkeyhidegelatin polysaccharide on tyrosinase was discussed.[Result]The deproteinization rates of TCA，Sevage and protease were 78.94%，87.73% and 29.97%，respectively，and the polysaccharide retention rates were 73.96%，32.14% and 72.57%，respectively.The obtained gelatin polysaccharide had a certain inhibitory effect on tyrosinase.When the concentration was 1 mg/mL，the inhibition rate was 24.42%.[Conclusion]The TCA method has higher deproteinization rate and lower polysaccharide loss rate.The screening method can effectively remove the protein from the crude polysaccharide of donkeyhidegelatin，and the obtained donkeyhidegelatin polysaccharide has a good inhibitory effect on tyrosinase.

Key words Donkeyhidegelatin;Polysaccharide;Deproteinization methods;Protein purification;Tyrosinase

多糖作為構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于自然界動(dòng)植物等有機(jī)體中[1]，其含有多羥基和羧基結(jié)構(gòu)，可與水分子形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)而鎖住水分，從而具有保濕作用[2]。多糖能夠抑制酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的生成，從而達(dá)到美白功效[3]。一些大分子多糖可激活并增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)SOD等抗氧化物酶活性，達(dá)到抗氧化功效[4]。此外，多糖還具有皮膚組織修復(fù)作用、抗衰老作用等[5]，因其有較高的安全性，被廣泛應(yīng)用于化妝品中。

阿膠作為補(bǔ)血補(bǔ)虛、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的良藥，自《神農(nóng)本草經(jīng)》以來(lái)一直沿用至今，在我國(guó)已有3 000多年的歷史，無(wú)論是單方使用，還是用于復(fù)方配伍，都有著豐富的記載[6]。阿膠味甘、性平，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血滋陰、潤(rùn)燥、止血之功效，被歷代醫(yī)家尊稱(chēng)為補(bǔ)血“圣藥”[7]。阿膠中的多糖雖然部分是外源性添加，且含量相對(duì)其他成分較低，但是其在加工過(guò)程中經(jīng)過(guò)高溫熬煮，可與蛋白質(zhì)等成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生不可預(yù)知的生物學(xué)修飾。近年來(lái)雖然對(duì)植物多糖的報(bào)道較多，但是阿膠多糖在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用少之甚少，仍處于研究階段。筆者對(duì)阿膠多糖的分離提純工藝及其抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行研究，為后期將阿膠多糖分子開(kāi)發(fā)為化妝品功效成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材

阿膠（批號(hào)1707038），東阿阿膠集團(tuán)提供;無(wú)水乙醇、三氯乙酸、濃硫酸、氯仿、正丁醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;苯酚，Macklin;葡萄糖，Sigma;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，天根;L-酪氨酸、酪氨酸酶、熊果苷，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

VO400真空干燥箱，Memmert公司;MX-S渦旋振蕩器，SCILOGEX公司;MS-H280-Pro磁力攪拌器，SCILOGEX公司;MULTISKAN GO多功能酶標(biāo)儀，Thermo公司;UV-1800紫外分光光度計(jì)，島津;ML303分析天平，梅特勒公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖含量測(cè)定。

采用苯酚-硫酸法[8]測(cè)定多糖含量，在490 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0002 3x+0.064 5（R2=0.999 24，n=3）。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

采用BCA法[9]測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，在595 nm處測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度在0～500 μg/mL與吸光度有較好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.555 63x+0.066 40（R2=0.999 66，n=3）。

1.3.3 阿膠粗多糖成分提取。

取一定量的阿膠樣品，以料液比1∶10加入蒸餾水，80 ℃水浴浸提2 h，離心取上清液，加入無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，乙醇終濃度至90%，攪拌均勻，于4 ℃靜置過(guò)夜后，離心取沉淀，于真空干燥箱中進(jìn)行干燥，稱(chēng)重。取0.4 g粗多糖溶于40 mL蒸餾水，測(cè)定多糖含量。

1.3.4 不同脫蛋白方法。

1.3.4.1 TCA法。

取“1.3.3”提取的粗多糖溶解于蒸餾水中，離心取上清液，分別加入60%三氯乙酸溶液，至終濃度為5%、15%、30%，混勻后于4 ℃靜置過(guò)夜，離心棄去沉淀，測(cè)定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.4.2 Sevage法。

取“1.3.3”中的粗多糖溶于蒸餾水中，離心取上清，粗多糖溶液和Sevage（氯仿∶正丁醇=4∶1）以4∶1比例混勻，劇烈振蕩20 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，反復(fù)多次至兩相界無(wú)變性蛋白出現(xiàn)。

1.3.4.3 蛋白酶法。

取一定量粗多糖溶于蒸餾水中，離心取上清，分別加入不同酶活力單位的木瓜蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH為6.0，混勻后于60 ℃酶解2.5 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min，冷卻至室溫，3 000 r/min離心10 min，離心棄去沉淀，測(cè)定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.5 酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)。

分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的阿膠多糖溶液（以磷酸緩沖液為空白，對(duì)照品為熊果苷），與1.66 mmoL的L-酪氨酸混合，37 ℃下孵育5 min，加入酪氨酸酶（900 U）250 μL，37 ℃下孵育10 min，475 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算酪氨酸酶活性抑制率。

1.3.6 計(jì)算公式。

蛋白清除率=脫蛋白前A562-脫蛋白后A562脫蛋白前A562×100%（1）

多糖保留率=脫蛋白后多糖A490脫蛋白前多糖A490×100%（2）

綜合評(píng)分=0.5×（多糖保留率多糖保留率最大值+蛋白質(zhì)清除率蛋白質(zhì)清除率最大值）×100（3）

酪氨酸酶抑制率=（A-B）-（C-D）A-B×100%（4）

其中，A為未加樣品而加酪氨酸酶的混合液;B為未加樣品、酪氨酸酶的混合液;C為加樣品、酪氨酸酶的混合液;D為加樣品而未加酪氨酸酶的混合液。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠樣品多糖、蛋白質(zhì)測(cè)定

采用硫酸-苯酚法測(cè)得阿膠樣品中多糖含量為26 mg/g，BCA 法測(cè)得蛋白質(zhì)含量為435 mg/g;阿膠粗多糖樣品的多糖含量為35 mg/g，蛋白質(zhì)含量為324 mg/g。

2.2 不同脫蛋白方法比較

以蛋白清除率和多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用TCA法、Sevage法和蛋白酶法對(duì)阿膠粗多糖溶液進(jìn)行脫蛋白處理。

2.2.1 TCA法。

TCA作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團(tuán)，使之聚集沉淀。由圖1可知，隨著TCA終濃度的增加，蛋白質(zhì)清除率逐漸增大后達(dá)到基本平衡。TCA濃度為5%時(shí)，因其只能結(jié)合多糖中的一部分蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)清除率低，僅為27.94%;隨著TCA濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，多糖保留率也隨之降低，這可能是低濃度TCA脫蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀過(guò)程中會(huì)吸附或夾帶部分多糖而造成多糖損失[10];當(dāng)高濃度TCA沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，不僅使游離蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，而且會(huì)沉淀多糖溶液中的部分糖蛋白，并引起部分多糖的降解，導(dǎo)致多糖保留率降低[11]。亦或者是TCA對(duì)阿膠多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作用，使多糖降解，結(jié)構(gòu)受到影響，經(jīng)TCA法脫蛋白的多糖復(fù)溶性變差，而且這種破壞作用隨著TCA濃度增大而增強(qiáng)[12]。綜合考慮，當(dāng)TCA濃度為25%為佳，此時(shí)，蛋白質(zhì)清除率為78.94%，多糖保留率為7396%，此時(shí)綜合評(píng)分達(dá)到最大值。

2.2.2 Sevage法。

由圖2可得，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，阿膠粗多糖蛋白去除率升高，多糖保留率逐漸減小。當(dāng)利用Sevage法對(duì)阿膠多糖脫蛋白5次脫蛋白處理后，蛋白質(zhì)去除率僅為37.83%。經(jīng)過(guò)15次脫蛋白處理后脫蛋白率可增至79.38%，但是隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白去除率較之前增長(zhǎng)不大，但多糖保留率卻逐漸下降。經(jīng)20次脫蛋白仍有蛋白質(zhì)殘留并且多糖保留率不高?？赡苁怯捎诎⒛z在熬制過(guò)程中，部分蛋白質(zhì)與阿膠多糖結(jié)合過(guò)于緊密或糖蛋白的存在[13]，或者多糖吸附在蛋白表面，重復(fù)操作造成多糖流失所致[14]。綜合考慮，處理15次時(shí)評(píng)分達(dá)到最大值，用Sevage試劑處理多次后，蛋白質(zhì)脫除率明顯提高，但多糖損失較多，影響多糖保留率。

2.2.3 蛋白酶法。

在底物濃度一定的情況下，酶解反應(yīng)速度與木瓜蛋白酶濃度成正比。因此隨著酶濃度的增大，酶解反應(yīng)速率提高。由圖3可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，阿膠多糖溶液的脫蛋白率逐漸增大，這可能是因?yàn)榘⒛z粗多糖溶液中的蛋白質(zhì)作為木瓜蛋白酶的作用底物，隨著酶濃度的增加，酶反應(yīng)速率加快，蛋白質(zhì)脫除效果不斷上升[15]。當(dāng)酶濃度大于500 U/mL時(shí)，酶用量的增加對(duì)脫蛋白率影響不大，多糖保留率隨著酶用量的增加呈緩慢降低趨勢(shì)?？赡苁怯捎诿敢堰_(dá)到飽和狀態(tài)，過(guò)量的酶聚集在有限的底物上，反而降低了酶的利用率[16]。從綜合評(píng)價(jià)來(lái)看，木瓜蛋白酶濃度為 500 U/mL時(shí)評(píng)分值達(dá)到最大，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為29.97%，多糖保留率為72.57%。在阿膠粗多糖量一定的條件下，增大酶用量，酶解效率提高使得脫蛋白率增大。但考慮阿膠本身為水解蛋白，因此木瓜酶法脫蛋白亦不適用于阿膠粗多糖提取。

2.2.4 脫蛋白方法的比較。經(jīng)水提純沉法得到阿膠粗多糖，得率為43.3%。阿膠粗多糖經(jīng)3種不同純化方式脫蛋白（圖4），Sevage法蛋白脫除率為87.73%，多糖保留率為3214%，純化多糖蛋白質(zhì)去除率較高，多糖較純，但是其過(guò)程繁瑣;酶解法蛋白質(zhì)清除率為29.97%，多糖保留率為7257%，蛋白質(zhì)去除率不理想?？紤]阿膠本身為水解蛋白，再次水解效果也不理想，相比較TCA蛋白質(zhì)清除率為7894%，多糖保留率為73.96%，此法簡(jiǎn)單有效，可作為工業(yè)化生產(chǎn)方案。

2.3 酪氨酸酶活性抑制分析

通過(guò)阿膠多糖對(duì)酪氨酸酶的活性抑制能力來(lái)評(píng)價(jià)阿膠多糖的美白功效，阿膠多糖對(duì)酪氨酸酶活性抑制率如圖5所示。阿膠多糖對(duì)酪氨酸酶活性具有抑制作用，并呈一定的濃度依賴(lài)性。當(dāng)阿膠多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率達(dá)24.42%。因此，阿膠多糖具有抑制酪氨酸酶的活性、阻斷黑色素生成的能力。

3 結(jié)論

通過(guò)采用TCA法、Sevage法、木瓜蛋白酶法3種方法，對(duì)阿膠多糖脫蛋白方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，TCA法的脫蛋白效果較好，蛋白質(zhì)清除率為78.94%，多糖保留率為73.96%;Sevage法次之，蛋白脫除率為87.73%，多糖保留率為3214%;蛋白酶法較差，蛋白質(zhì)清除率為29.97%，多糖保留率為72.57%。Sevage法純化多糖蛋白質(zhì)去除率較高，多糖較純且條件溫和，雖不會(huì)引起多糖的變性，但其采用的有機(jī)溶劑毒性較大，過(guò)程繁瑣，耗時(shí)耗能，考慮安全性和工業(yè)化生產(chǎn)程序不推薦該方法。酶解法除蛋白效率不高，考慮阿膠本身為水解蛋白，再次水解效果不理想，亦不推薦。TCA法能夠?qū)⒋蟛糠值鞍兹コ?，?jiǎn)單可行。經(jīng)初步純化制得的阿膠多糖對(duì)酪氨酸酶有一定的抑制作用，在濃度為1 mg/mL時(shí)，酪氨酸酶抑制率為24.42%。由此可見(jiàn)，經(jīng)該研究篩選的脫蛋白方法切實(shí)可行，制得的阿膠多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用，為阿膠多糖投入到食品、保健品以及化妝品生產(chǎn)提供理論參考。

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