溶解氧變化對(duì)中華烏塘鱧酶活的影響及其低氧耐受力研究

馬粒雅 王聞 遲雯丹

摘要 將中華烏塘鱧置于密閉的玻璃容器中，在溶解氧濃度分別為3.5、1.0、0.5、0.3、0.05、0、0 mg/L（將魚憋2 h后）時(shí)分別進(jìn)行取樣，測(cè)定肝臟、腸和鰓中的酶活。結(jié)果表明，中華烏塘鱧肝臟組織中的抗氧化酶活性最高，腸組織中免疫酶活性最高，而外周組織（鰓）的酶活性遠(yuǎn)低于其他組織;當(dāng)溶解氧濃度降至約0.31 mg/L時(shí)，抗氧化酶和免疫酶活性均明顯下降，這可能是中華烏塘鱧進(jìn)入了一種類似休眠的狀態(tài)，整個(gè)新陳代謝降低僅能維持基本的生命狀態(tài);當(dāng)水中溶解氧幾乎消耗完全時(shí)，中華烏塘鱧為維持其基本生命特征而進(jìn)行自身調(diào)節(jié)，抗氧化酶和免疫酶的活性又出現(xiàn)明顯升高。

關(guān)鍵詞 中華烏塘鱧;溶解氧;堿性磷酸酶;超氧化歧化酶;過氧化氫酶

中圖分類號(hào) S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0091-04

Abstract Chinese black sleepers were cultured in closed glass vessels，and samples were collected when the concentration of dissolved oxygen was 3.5， 1.0， 0.5， 0.3， 0.05， 0 and 0 mg/L（dissolved oxygen disappeared for 2 hours）.The enzyme activities in the liver， intestine and gill were determined. The results showed that the activity of antioxidant enzymes was the highest in the liver and the activity of immune enzymes were most active in intestinal tissues， while both of them were much lower in the gill than that in the liver and intestinal tissues. When the dissolved oxygen concentration dropped to 0.31 mg/L，the activities of antioxidant enzymes and immune enzymes decreased significantly， this might be caused by the fact that Chinese black sleepers entered a state similar to dormancy， so that the entire metabolism was reduced only to maintain the basic state of life. However， when dissolved oxygen in water was almost consumed completely， the activities of antioxidant enzymes and immune enzymes increased again， which might be derived from the selfregulation of Chinese black sleepers to maintain its basic life characteristics.

Key words Chinese black sleeper;Dissolved oxygen;Alkaline phosphatase（AKP）;Superoxide dismutase（SOD）;Catalase（CAT）

中華烏塘鱧隸屬塘鱧科烏塘鱧屬，廣泛分布于我國(guó)黃海南部，東海，南海以及日本海域[1]。中華烏塘鱧是一種低氧耐受性很強(qiáng)的魚類，通過對(duì)其在不同溶解氧濃度下堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性的研究來揭示其耐低氧能力[2]。它的存活率很高，能很快將傷口愈合并維持健康的生命體征。另外，中華烏塘鱧的最大特點(diǎn)是對(duì)低氧和干露的耐受性很強(qiáng)，即使只在離水的陰濕環(huán)境中也能生存7 d左右[3]，是一種能夠適應(yīng)當(dāng)前海洋生態(tài)環(huán)境變化的優(yōu)良品種。目前對(duì)中華烏塘鱧的研究主要集中在繁殖、養(yǎng)殖方面，而對(duì)該種魚在低溶解氧條件下的存活機(jī)理迄今尚未見報(bào)道。

當(dāng)魚類受到外界環(huán)境因素的影響時(shí)，激發(fā)非特異性免疫系統(tǒng)是機(jī)體用來抵抗外界環(huán)境的主要方式。磷酸酶是一類非特異性免疫酶，其活力是衡量免疫功能和機(jī)體狀態(tài)的指標(biāo)，反映了機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的防御能力[4]。堿性磷酸酶（AKP）是其中重要的一種機(jī)體功能調(diào)節(jié)酶，通過促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收來加強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力[5]。當(dāng)魚類受到環(huán)境脅迫時(shí)，堿性磷酸酶活性被激發(fā)以抵抗外界條件對(duì)自身的影響。目前已有研究表明環(huán)境條件（如水溫[6-7]、鹽度[8-9]、溶解氧[10-11]、重金屬[12-13]、有機(jī)污染物[14-15]等）的變化能引起魚體內(nèi)堿性磷酸酶活性的變化，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。

魚類在水體中不同環(huán)境下的生命體征也可以用抗氧化酶活力來反映，從而判定魚類是否受到外界環(huán)境的脅迫。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，主要通過催化歧化作用將過氧化物自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2）和氧（O2），將生物體內(nèi)有害的活性氧清除[16]。過氧化氫酶（CAT）通過催化分解作用將過氧化氫歧化分解為水（H2O）和氧氣（O2），防止細(xì)胞受到過氧化氫的毒害作用，為機(jī)體提供抗氧化防御能力[7]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于魚體內(nèi)抗氧化酶活性受溫度[17-20]、鹽度[18-20]、溶解氧[21-22]等環(huán)境條件脅迫而發(fā)生變化的研究很多，但關(guān)于中華烏塘鱧的研究卻尚未報(bào)道。

筆者通過對(duì)低氧狀態(tài)下中華烏塘鱧不同組織內(nèi)免疫酶和抗氧化酶活性的測(cè)定，探究低氧脅迫下中華烏塘鱧不同組織酶活性的差異及低氧條件對(duì)酶活性的影響，旨在初步探究中華烏塘鱧的耐低氧機(jī)制，為中華烏塘鱧的人工養(yǎng)殖和運(yùn)輸提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)其他生物在低氧條件下的存活提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚來源和試驗(yàn)用水

試驗(yàn)用魚為廣西海域直接捕撈的樣品魚，選取生命體征良好、平均體重（74.45±13.95）g、平均體長(zhǎng)（17.55±1.25）cm的健康中華烏塘鱧進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)用水為經(jīng)沉淀和砂濾的天然海水，鹽度為25%～27%，pH為8.1～8.2[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

試驗(yàn)采用密封玻璃容器作為呼吸室進(jìn)行中華烏塘鱧的耗氧試驗(yàn)，基于非侵入式光學(xué)氧傳感器進(jìn)行溶解氧測(cè)定，將溶氧膜固定于玻璃容器內(nèi)壁中間位置，注滿海水放入試驗(yàn)魚進(jìn)行測(cè)定，以保持室溫25 ℃和密閉條件。

試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)組，Ⅰ組為對(duì)照組，只加滿海水不放入試驗(yàn)魚;Ⅱ～Ⅷ組加滿海水分別放入10條魚，Ⅱ～Ⅷ組溶解氧濃度在魚的呼吸作用下隨時(shí)間而明顯下降，使用溶解氧測(cè)定儀（非侵入式光學(xué)氧傳感器，規(guī)格為PreSens Microx 4）每隔1 min對(duì)試驗(yàn)容器內(nèi)海水的溶解氧進(jìn)行測(cè)定（海水的初始溶解氧濃度為6.0 mg/L），當(dāng)溶解氧濃度降至約3.5、1.0、0.5、0.3、0.05、0、0 mg/L（溶解氧濃度降至0 mg/L后2 h）時(shí)分別進(jìn)行取樣，在冰上進(jìn)行無菌解剖，取肝臟、腸、鰓3種組織裝入冷存管中并按順序編號(hào)用液氮冷凍保藏，分別對(duì)3種組織的堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.2 酶活性測(cè)定方法。

將冷凍的組織準(zhǔn)確稱重，按質(zhì)量體積比1∶9（g∶mL）加入定量生理鹽水在冰浴條件下配制成10%的組織勻漿，并保持4 ℃溫度，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液以供測(cè)定酶活性。酶活均使用南京建成生物有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定，按照說明書進(jìn)行操作。

堿性磷酸酶（AKP）的活力單位定義為1 g組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位，然后再將金氏單位換算成國(guó)標(biāo)。

超氧化物歧化酶（SOD）的活力單位定義為1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)酶活力單位[11]。

過氧化酶（CAT）的活力單位定義為1 mg組織蛋白1 s分解1 mol的過氧化氫（H2O2）的量為1個(gè)酶活力單位[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華烏塘鱧耗氧率測(cè)定

將中華烏塘鱧置于密閉的容器中，對(duì)其耗氧率進(jìn)行測(cè)定。從圖1可以看出，在2 h內(nèi)，中華烏塘鱧的耗氧率從最初的0.2 mg/（h·g）降低至002 mg/（h·g）。隨著溶解氧濃度的進(jìn)一步降低，中華烏塘鱧表現(xiàn)出明顯的活力降低，僅有鰓和鰭微動(dòng)，其耗氧率也緩慢下降，接近于零。持續(xù)4 h后，耗氧率降至零（容器內(nèi)海水溶解氧濃度為0 mg/L），中華烏塘鱧仍能在這種狀態(tài)下存活4 h左右。

2.2 低氧脅迫下不同組織AKP活性的變化

對(duì)中華烏塘鱧不同組織中的AKP活性進(jìn)行測(cè)定，觀察發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下肝臟組織中AKP活性為10～20 U/mg，腸組織中AKP活力為400～1 200 U/mg，鰓中AKP活性為9～12 U/mg。從圖2可以看出，腸組織中AKP活性遠(yuǎn)高于肝臟和鰓，而肝臟中AKP活性略高于鰓。這表明腸組織是中華烏塘鱧體內(nèi)AKP酶的主要分布區(qū)，在溶解氧較低的狀態(tài)下腸組織受到影響，會(huì)分泌更多的AKP以適應(yīng)環(huán)境的變化。

因?yàn)橹腥A烏塘鱧體內(nèi)不同組織所含AKP活性的差異較大，分別對(duì)肝臟、腸和鰓中溶解氧濃度對(duì)AKP活性的影響進(jìn)行分析。從圖2可以看出，隨著溶解氧濃度的逐漸降低，肝臟和腸中AKP活性基本不發(fā)生變化。當(dāng)溶解氧濃度進(jìn)一步降低時(shí)，AKP活性開始上升;溶解氧濃度達(dá)到0.31 mg/L時(shí)，AKP活性出現(xiàn)峰值隨后開始下降（P>005）;當(dāng)溶解氧濃度達(dá)到0.05 mg/L時(shí)，AKP活性再次升高（P>0.05）。鰓中AKP活性也隨著溶解氧濃度的降低呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但變化范圍并不大，且各試驗(yàn)組間無顯著差異（P>005）。

2.3 低氧脅迫下不同組織抗氧化酶活性的變化

對(duì)中華烏塘鱧不同組織中SOD和CAT活性分別進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下肝臟組織中SOD活性為550～750 U/mg，腸組織中SOD活性為170～200 U/mg，鰓中SOD活性為50～75 U/mg（圖3）。從圖3可以看出，SOD活性在肝臟、腸和鰓中從高到低依次為肝臟、腸、鰓，且肝臟中SOD活性遠(yuǎn)高于其他組織。CAT活性在中華烏塘鱧體內(nèi)各組織中的分布比例與SOD活性相似，其活性分別為肝臟35～55 U/mg，腸組織2～5 U/mg以及鰓組織0.4～0.8 U/mg（圖4）。這表明抗氧化酶分布在中華烏塘鱧體內(nèi)的不同組織中，但肝臟所占的比重較大，且SOD活性相較于CAT活性高得多。

圖3呈現(xiàn)出肝臟、腸和鰓組織中SOD活性隨著溶解氧濃度下降的變化趨勢(shì)。肝臟和腸組織中SOD活性的變化趨勢(shì)與AKP活性相似，SOD活性先不隨溶解氧濃度而變化，當(dāng)溶解氧濃度達(dá)到1.04 mg/L時(shí)SOD活性開始上升，達(dá)到峰值時(shí)開始呈下降趨勢(shì)，最終當(dāng)溶解氧濃度幾乎為0 mg/L時(shí)，SOD活性又逐漸增大（P>0.05）。鰓中的SOD活性隨溶解氧濃度的下降呈上升下降交替變化的趨勢(shì)，當(dāng)溶解氧濃度下降為005 mg/L時(shí)，SOD活性不再下降而呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)（P>0.05）。

圖4分別顯示出肝臟、腸和鰓組織中CAT活性隨著溶解氧濃度下降的變化趨勢(shì)。肝臟和腸中CAT活性隨著溶解氧濃度的降低而呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，且各試驗(yàn)組間無顯著差異（P>0.05），當(dāng)溶解氧完全耗盡時(shí)，試驗(yàn)魚體內(nèi)CAT活性開始上升（P>0.05）。鰓中CAT的活性始終保持在0.5 U/mg左右，幾乎不隨溶解氧濃度的變化而發(fā)生變化（P>0.05）。

3 討論

3.1 低氧脅迫對(duì)不同組織AKP活性的影響

魚類在整個(gè)生存過程中主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)抵抗外界條件的影響。AKP作為生物體內(nèi)第四道防線中非常重要的非特異性免疫酶之一，其活力是魚類自身免疫系統(tǒng)的重要指標(biāo)[23]。該研究發(fā)現(xiàn)在中華烏塘鱧肝臟、腸和鰓組織中腸組織的AKP活性較高，且受氧濃度的影響較大，而肝臟的AKP活性略高于鰓。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，腸組織與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有著密切關(guān)系[24-25]，這與AKP的作用相適配，因此在中華烏塘鱧腸內(nèi)AKP活性較高。肝臟是生物體內(nèi)主要的解毒器官，通過AKP的作用將有毒物質(zhì)分解，以維持穩(wěn)定狀態(tài)[26-28]，因此肝臟中也存在一定量的AKP。鰓主要具有呼吸、濾食和排泄等功能，并不是魚類的免疫器官，因此AKP的活性較小。

當(dāng)溶解氧濃度大于0.45 mg/L時(shí)，中華烏塘鱧的生命體征良好，體內(nèi)的免疫性酶不受溶解氧變化的影響而保持穩(wěn)定狀態(tài)。隨著溶解氧濃度的進(jìn)一步下降，中華烏塘鱧做出應(yīng)激反應(yīng)，通過提高AKP的活性來加強(qiáng)自身的非特異性免疫能力。當(dāng)溶解氧濃度達(dá)到0.31 mg/L時(shí)，中華烏塘鱧為了維持基本生命體征而降低自身新陳代謝水平，使機(jī)體進(jìn)入近似休眠狀態(tài)，AKP活性也隨之下降。當(dāng)溶解氧濃度下降至0.05 mg/L時(shí)，試驗(yàn)魚呼吸受阻，生命體征出現(xiàn)異常，抗氧化酶通過將體內(nèi)的自由基轉(zhuǎn)換，以得到更多的氧氣維持呼吸，而轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)可以被AKP降解，因此AKP的活性升高。

3.2 低氧脅迫對(duì)不同組織抗氧化酶活性的影響

與其他有氧生物一樣，魚體內(nèi)具有完善的抗氧化防御系統(tǒng)，以抵抗正常新陳代謝活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的對(duì)身體有害的活性氧物質(zhì)[29]。SOD和CAT是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)于維持體內(nèi)自由基平衡有重要的作用[30]。肝臟是生物體內(nèi)新陳代謝和氧氣消耗的主要組織，肝臟中SOD通過歧化作用將過氧化物自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）以在低氧狀態(tài)下維持生命，而CAT可將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物過氧化氫（H2O2）分解為水（H2O）和氧氣（O2），在得到生命所需氧氣的同時(shí)將過氧化氫分解，以提高自身抗氧化能力?？寡趸阜植荚谥腥A烏塘鱧體內(nèi)的不同組織中，但肝臟所占的比重較大，且SOD的活性相較于CAT活性高得多。

當(dāng)溶解氧濃度大于0.45 mg/L時(shí)，中華烏塘鱧體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)的SOD和CAT通過自身的活性調(diào)節(jié)來維持體內(nèi)自由基的平衡，并未隨著溶解氧的降低有明顯變化。當(dāng)溶解氧濃度進(jìn)一步下降時(shí)，中華烏塘鱧開始出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)通過提高抗氧化酶活性來加強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，維持生命體征的正常。當(dāng)溶解氧濃度降低至0.31 mg/L時(shí)，抗氧化酶活性降低，中華烏塘鱧表現(xiàn)出明顯的活力減少，僅有鰓和鰭微動(dòng)，整體新陳代謝水平下降。當(dāng)溶解氧濃度基本耗盡時(shí)，試驗(yàn)魚無法吸收水中的氧進(jìn)行呼吸，只能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來促進(jìn)氧化自由基的分解生成氧氣，以供自身呼吸。

該研究通過對(duì)中華烏塘鱧在低氧條件下耗氧率及不同組織中免疫酶和抗氧化酶活性變化進(jìn)行分析，觀察發(fā)現(xiàn)中華烏塘鱧在溶解氧濃度開始下降的過程中耗氧率快速下降，免疫酶和抗氧化酶的活性有明顯的上升趨勢(shì);然而，當(dāng)溶解氧濃度降至0.31 mg/L時(shí)，中華烏塘鱧活力明顯降低。為了維持其生命特征，整個(gè)機(jī)體的新陳代謝水平開始下降，導(dǎo)致免疫酶和抗氧化酶下降。隨著氧氣的進(jìn)一步消耗，中華烏塘鱧的耗氧率降為0 mg/（h·g），免疫活性酶和抗氧化活性酶的活性明顯升高，使其仍能在這種狀態(tài)下維持4 h左右。初步認(rèn)為中華烏塘鱧的耐氧機(jī)制大約在溶解氧濃度為0.31 mg/L時(shí)開始啟動(dòng)，通過降低自身的新陳代謝水平維持生命特征，使機(jī)體處于近似于休眠狀態(tài)。當(dāng)水中溶解氧幾乎為零時(shí)，為了維持機(jī)體基本的生命特征，體內(nèi)的酶又重新被激活，肝臟中抗氧化酶通過分解體內(nèi)氧化自由基來維持生命，同時(shí)免疫酶將產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，并在腸組織中通過免疫酶的作用將其降解吸收。

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