西藏山南紅皮馬鈴薯脫毒快繁技術(shù)研究

范繼紅 巴桑次仁 邊巴次仁

摘要 以采自西藏山南地區(qū)隆子縣加玉鄉(xiāng)卡布溝的紅皮馬鈴薯為試驗材料，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行莖尖剝離，獲得脫毒苗，并建立快繁再生體系。結(jié)果表明，紅皮馬鈴薯組織培養(yǎng)不同培養(yǎng)階段的適宜培養(yǎng)基分別為分化培養(yǎng)基：MS + 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.02 mg/L;繼代培養(yǎng)基：MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.05 mg/L;生根培養(yǎng)基：MS + IBA 0.2 mg/L。

關(guān)鍵詞 紅皮馬鈴薯;脫毒;培養(yǎng)基;再生體系

中圖分類號 S532 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0050-04

Abstract Redskinned potatoes collected from Kabugou， Jiayu Township， Longzi County of southern Tibet， were used as experimental materials to obtain virusfree seedlings by stripping the stem tips with plant tissue culture technology， and a rapid reproduction and regeneration system was established. The results showed that the suitable differentiation medium subculture medium and rooting medium was MS+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L， MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L，and MS+IBA 0.2 mg/L， respectively.

Key words Redskinned potato;Virusfree; Medium;Regeneration system

西藏山南地處青藏高原岡底斯山——念青唐古拉山脈以南的雅魯藏布江中下游，屬于典型的藏南谷地，隆子縣位于山南地區(qū)中偏北、喜馬拉雅山東段北麓，境內(nèi)屬高原溫帶半干旱季風氣候區(qū)，太陽輻射強烈，日照時間長，氣溫較低，晝夜溫差大，干濕分明[1]。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）為茄科茄屬一年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)的秘魯和智利一帶。17世紀時馬鈴薯傳播到我國，和玉米、番薯等從美洲傳入的高產(chǎn)作物成為老百姓的主要食品，對維持我國人口的迅速增加起到了重要作用。紅皮馬鈴薯富含原花青素和大量微量元素，具有補血護心、防病抗病、延緩衰老、美容護膚等功效，營養(yǎng)價值非常突出，食療效果非常明顯。經(jīng)檢測，100 g馬鈴薯含花青素3.15 mg，粗淀粉10.07 g，蛋白質(zhì)2.11 g，脂肪0.10 g，及豐富的碘、硒、錳、鉀、鋅等微量元素和維生素類[2-3]。西藏地區(qū)馬鈴薯的品質(zhì)較好，很粉很甜，自古就有以馬鈴薯為主食的傳統(tǒng)，其中煮食為主要方式，以土豆泥為皮，牛肉為餡的土豆包子是西藏特色美食之一[4-6]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是目前植物生物工程中研究最為完善、應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域，這一技術(shù)已經(jīng)在果樹、花卉、蔬菜等經(jīng)濟作物的快速繁殖和脫病毒等方面得到了普遍應(yīng)用，并進入了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)階段[7]。馬鈴薯莖尖培養(yǎng)研究經(jīng)常與獲得無病毒苗結(jié)合進行，目前無病毒馬鈴薯苗在美國、意大利等國已應(yīng)用于生產(chǎn)，我國從1979年開展了一系列加快優(yōu)良品種繁殖的植物組織培養(yǎng)研究，馬鈴薯莖尖、莖段、葉片、葉柄再生系統(tǒng)也已經(jīng)建立[8-10]。

筆者選用的紅皮馬鈴薯產(chǎn)于西藏山南地區(qū)隆子縣加玉鄉(xiāng)卡布村，隆子卡布紅皮馬鈴薯個頭小但數(shù)量多，外皮為深紅色，果肉為白色，煮后食用口感好，香味獨特濃郁，薯塊扎實耐貯藏，皮薄，鈣和維生素C含量高，一直受到周邊地縣群眾的喜愛。筆者利用組織培養(yǎng)的方法培育脫毒組培苗，為優(yōu)良馬鈴薯品種繁育及在西藏地區(qū)的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料。紅皮馬鈴薯采于西藏山南地區(qū)隆子縣加玉鄉(xiāng)卡布村。

1.1.2 外植體采集。

收集西藏山南地區(qū)隆子縣加玉鄉(xiāng)卡布溝的紅皮馬鈴薯，選擇大小適中、表面光滑、完好無傷的薯塊常溫保存，待芽萌發(fā)后取芽，經(jīng)表面消毒后，剝離莖尖，進行培養(yǎng)。

1.1.3 培養(yǎng)基及激素種類。

6-BA：6-芐氨基嘌呤，NAA：萘乙酸，IBA：吲哚丁酸。

MS基本培養(yǎng)基：大量元素，微量元素，有機成分，2%蔗糖，1%瓊脂，pH 5～6。

1/2MS培養(yǎng)基：大量元素用量在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上減半，其他同MS培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理。

接種前首先要進行外植體表面消毒，選取飽滿的芽體，從薯塊上掰下，首先用肥皂水沖洗3～5次，再用自來水沖洗15 min。然后用70%乙醇消毒，無菌水沖洗3次。將乙醇清洗后的外植體在超凈工作臺中再用1%升汞消毒處理，無菌水沖洗3～5次。然后馬上剝莖尖。

1.2.2 試驗用培養(yǎng)基。

紅皮馬鈴薯的組織培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，再根據(jù)不同時期的具體需要添加適宜的激素。不同培養(yǎng)時期試驗用培養(yǎng)基類型見表1和表2。

各種培養(yǎng)基配制時除添加表中所列基本培養(yǎng)基和激素成分外，還要添加蔗糖2%，瓊脂粉1%;pH調(diào)整為5.8，分裝后在121 ℃、1.1 kg/cm2的壓力下滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)過程及培養(yǎng)條件。

莖尖剝離：在剝?nèi)∏o尖時，把芽體置于8～40倍解剖鏡下，將消毒的芽體置于無菌培養(yǎng)皿，一只手用鑷子將其按住，另一只手用解剖針將芽鱗和葉原基分層剝離，解剖針要常蘸入90%乙醇，并用火焰灼燒進行消毒。當一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來后，用解剖刀片將分生組織切下來，然后將其接到培養(yǎng)基上（圖1）。接種過程中要借助解剖鏡觀察，必須嚴格進行無菌操作，以免培養(yǎng)材料被污染。

分化培養(yǎng)：將剝離的莖尖，接種到分化培養(yǎng)基中，接種后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在25 ℃左右，每天照光10 h，光強大于3 000 lx（圖2）。

繼代培養(yǎng)：分化的莖尖28 d繼代一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，即可以形成多叢分化苗。

生根培養(yǎng)：當繼代苗高度大于3 cm時，由莖基部剪斷接入生根培養(yǎng)基，7 d左右即可看到幼根，再經(jīng)過14 d左右的培養(yǎng)，試管苗已具有發(fā)達健壯的根系，即可進行移栽。

煉苗移栽：在試管生根苗培養(yǎng)21 d，有3條以上的新根形成后，即可進行煉苗移栽。移栽時首先將培養(yǎng)瓶瓶蓋去掉，煉苗3 d左右，然后進行移栽。煉苗溫度為20～30 ℃。移栽時用鑷子將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，用自來水將其根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，移入苗盤，澆足水，噴施多菌靈，轉(zhuǎn)入馴化室培養(yǎng)，馴化室溫度控制在20～25 ℃，光照3 000～5 000 lx，相對濕度90%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒

首先用肥皂水沖洗3～5次，再用流水沖洗15 min。然后用75%乙醇和1%升汞以不同消毒時間組合處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），處理①和②污染率較高，外植體萌發(fā)率較低，處理③、④、⑤污染率均非常低，達到了徹底消毒的目的，但比較外植體萌發(fā)率看，處理③萌發(fā)率為80%。綜合來看，以75%乙醇消毒30 s和1%升汞消毒5 min的處理③為最佳消毒方案。

2.2 不同激素種類及濃度對外植體分化的影響

將剝離的莖尖接種到含有不同激素種類及濃度的初代培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明，接種在A2、A3 2個培養(yǎng)基上的外植體分化率均較高，但通過培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，A2和A3處理雖然分化率高，生長快，但分化苗細弱，A6培養(yǎng)基雖然分化率略低于前者，但分化的新芽生長健壯（圖3、4）。在外植體分化階段雖然希望以最快的分化速度來進行增殖，但在生產(chǎn)中，不能只要求有高的分化率，同時還要保證分化苗生長健壯。所以綜合分析以MS + 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.02 mg/L 的A6培養(yǎng)基為最適分化培養(yǎng)基（表4）。

2.3 不同激素種類及濃度對繼代增殖的影響

選取健康、生長良好的分化苗進行繼代增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用6-BA和NAA組合的培養(yǎng)基增殖倍數(shù)高，但激素高的組合增殖苗生長較弱。接種在A4培養(yǎng)基上的苗增殖率最高，增值倍數(shù)為405，接種在A5培養(yǎng)基的苗增殖率次之，增殖倍數(shù)為355，而其他培養(yǎng)基上的增殖苗生長均明顯較弱。繼代培養(yǎng)階段不能只要求有高的分化率，同時還要保證分化苗生長健壯，綜合增殖倍數(shù)與增殖苗生長狀況分析，A8培養(yǎng)基既可以保證較高的增殖倍數(shù)，苗的生長又比較健壯，因此繼代增殖培養(yǎng)基以MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.05 mg/L較好（表5）。

2.4 不同激素種類及濃度對試管苗生根的影響

將健壯的增殖繼代苗接種到含有不同激素種類及濃度的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化苗生根。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加NAA后，愈傷產(chǎn)生的數(shù)量較多，新根數(shù)量雖多，但不能形成健康良好的根系，移栽不易成活;而添加IBA的處理產(chǎn)生愈傷較少，但IBA濃度較大時根系粗大脆弱;綜合分析認為以MS為基本培養(yǎng)基，添加IBA 0.2 mg/L的B3培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根的效果最好（表6、圖5～6）。

3 結(jié)論

自2015年我國馬鈴薯主糧化以來，馬鈴薯栽培面積不斷擴大，市場潛力巨大。在昌果紅皮馬鈴薯成功銷往全國的帶動下，山南地區(qū)開始大力推廣紅皮馬鈴薯種植，由于種植面積迅速增加，紅皮馬鈴薯種苗需求量也急劇增加，培育馬鈴薯脫毒苗已成為解決種苗問題的關(guān)鍵[6]。

該研究以采自西藏山南地區(qū)隆子縣加玉鄉(xiāng)卡布溝的紅皮馬鈴薯為試驗材料，利用莖尖脫毒技術(shù)，獲得莖尖脫毒苗，建立快繁再生系統(tǒng)，結(jié)果表明，適宜紅皮馬鈴薯脫毒苗不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基分別為分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L;繼代培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 005 mg/L;生根培養(yǎng)基：MS+IBA 0.2 mg/L。而1976年中國科學(xué)院遺傳研究所成功培養(yǎng)2個馬鈴薯品種的莖尖脫毒苗，初代培養(yǎng)基采用MS附加0.8 mg/L GA3[9]，張玲[8]在馬鈴薯組織培養(yǎng)技術(shù)研究中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS+6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.2 mg/L[8]，與該試驗有所不同，屬于不同品種的培養(yǎng)差異。不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基，激素濃度都不是很高，但脫毒苗生長良好，如果用于生產(chǎn)則可以降低生產(chǎn)成本，提高收益。

參考文獻

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