復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠慢性潰瘍的藥效學(xué)篩選研究*

★ 朱思洵 黃子慧* 何玲 程兆炎 錢佳燕 夏慶鵬 胡鈺慧（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 南京 004；.中國(guó)藥科大學(xué) 南京 0009）

復(fù)方五鳳草液［1］為外用中藥，系我院名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，主要用于結(jié)核性潰瘍的治療，療效確切，前期研究表明其能有效促進(jìn)結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面表皮生長(zhǎng)因子VEGF、FGF-2 的表達(dá)［2］。同時(shí)臨床發(fā)現(xiàn)，復(fù)方五鳳草液對(duì)其他慢性創(chuàng)面也有一定的療效。本次實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建幾種常見的慢性創(chuàng)面大鼠模型，對(duì)復(fù)方五鳳草液的干預(yù)作用進(jìn)行藥效學(xué)初篩，為進(jìn)一步的藥效與機(jī)制研究打下基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠，180～200g，雌雄各半，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001。飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)，（22±1）℃室溫下通風(fēng)單籠飼養(yǎng)，晝夜自然照明，自由飲水?dāng)z食。

1.1.2 試藥 復(fù)方五鳳草液（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供，屬院內(nèi)制劑）；復(fù)方黃柏液（山東漢方制藥）；康復(fù)新（湖南科倫制藥）；凍瘡膏（湖北科田制藥）。

復(fù)方五鳳草液處方：五鳳草2kg，白芨240g，貓爪草400g 等。制備工藝：將以上諸藥，加水浸過藥面，煎煮3 次，每次1h，合并煎液，濾過，濾液濃縮分裝，生藥含量為2.64g/mL。以上藥液由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室提供，4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組

1.2.1.1 下肢靜脈性潰瘍動(dòng)物模型［3］大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉后，剪去左側(cè)大腿根部毛發(fā)，仰臥位固定。常規(guī)無菌消毒，鋪好無菌孔巾。在左側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)做長(zhǎng)約2cm 切口，分離皮下組織和淺筋膜等，分離并暴露髂-股靜脈約1.0cm。在其近、遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉此靜脈，然后用自制無齒的12 號(hào)蚊式鉗夾閉血管，于動(dòng)脈夾位置相鄰，力量為血管鉗緊1 扣，時(shí)間持續(xù)2～3s。松開蚊式鉗并進(jìn)行縫合，局部皮膚常規(guī)消毒。手術(shù)后24 h，將放置血管夾取出。下肢深靜脈血栓模型制備成功3d 后，在無菌操作臺(tái)上，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，剪去左側(cè)大腿外側(cè)毛發(fā)，保證皮膚完整無破損，然后取適量脫毛膏脫毛，直徑約為3cm。大鼠俯臥位固定，局部皮膚常規(guī)無菌消毒，鋪好無菌孔巾，用直徑1.5cm 打孔器標(biāo)記造模位置，剪取標(biāo)記位置全層皮膚，造成直徑1.5cm 圓形皮膚缺損，深度達(dá)皮下深筋膜。

造模成功后，24 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、復(fù)方五鳳草液組、陽性藥組（復(fù)方黃柏液），共3 組，每組8 只。

1.2.1.2 燒傷性潰瘍動(dòng)物模型［4］大鼠用10% 水合氯醛腹腔注射進(jìn)行全身麻醉后，背部用電動(dòng)剃刀剃毛暴露，將銅圓柱體模具（直徑為1.8cm）置于100.0℃電熱恒溫水浴鍋中10min，取出后立即置于大鼠背部8s，造成直徑1.8cm 的深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面。

選取造模成功的大鼠24 只，分為模型組、復(fù)方五鳳草液組、陽性藥組（康復(fù)新液），共3 組，每組8 只。

1.2.1.3 壓力性潰瘍動(dòng)物模型［5］將SD 大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉， 然后在其背部剃出4cm×3cm 長(zhǎng)方形皮膚區(qū)，使背部形成一個(gè)皮島區(qū)域。然后用清水清洗，再用0.5 %碘伏溶液消毒。麻醉狀態(tài)下于左肩下0.5cm 作一3.0cm 長(zhǎng)的貫穿皮膚全層橫切口，鈍性分離后將經(jīng)過高壓蒸汽處理的環(huán)形鐵片置于切口皮膚的尾端，鐵片通過周圍筋膜固定。然后縫合切口。將大鼠放回籠內(nèi)。術(shù)后24 h 將1 塊體外永久磁鐵作用于大鼠背部植入?yún)^(qū)2h引起缺血，然后移開磁鐵引起該區(qū)皮膚的血流再灌注0.5h，如此反復(fù)，每天5 個(gè)缺血-再灌注循環(huán)，連續(xù)3d。缺血-再灌注15 次，缺血時(shí)間總計(jì)30h。缺血-再灌注循環(huán)期間，大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)及喂水，單獨(dú)飼養(yǎng)以盡可能減小交叉反應(yīng)或磁鐵移位，在控制環(huán)境中允許自由活動(dòng)。造模3d 后觀察大鼠創(chuàng)面，以大鼠施壓皮膚糜爛，針刺不出血作為判斷Ⅲ期及以上壓瘡成模標(biāo)準(zhǔn)。

選取造模成功的大鼠24 只，分為模型組、復(fù)方五鳳草液組、陽性藥組（康復(fù)新液），共3 組，每組8 只。

1.2.1.4 糖尿病潰瘍動(dòng)物模型［6］大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，給予高脂高糖飼料，飼養(yǎng)4 周后，大鼠均禁食12h 后給予30mg/kg、1%STZ 溶液（臨用前用0.1mol/L、pH4.5 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制）單次腹腔注射。注射后第3d 采用斷尾取血法測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.67mmol/L 為糖尿病造模成功；造模不成功者再次空腹12h后注射10mg/kg、1% STZ 溶液。4 周后，大鼠以水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，背部脫毛，常規(guī)消毒，在背部制作直徑約為2.5cm 的圓形創(chuàng)面，深至皮下。

選取造模成功的大鼠24 只，分為模型組、復(fù)方五鳳草液組、陽性藥組（康復(fù)新液），共3 組，每組8 只。

1.2.2 給藥方法 模型建立成功后，大鼠單籠飼養(yǎng)，保證大鼠日常自由飲水、攝食。自然暴露1d，第2d 即為實(shí)驗(yàn)開始日，記作實(shí)驗(yàn)第1d，開始進(jìn)行藥物干預(yù)，實(shí)驗(yàn)周期為14d，每日換藥2 次。模型組：只用生理鹽水清洗創(chuàng)面。治療組：復(fù)方五鳳草液2mL 外用換藥，剪取適當(dāng)棉片，以該液體2mL 浸濕（注意以輕擠不滴水為宜）外敷，無菌紗布包裹固定。陽性藥組：根據(jù)不同動(dòng)物模型，分別以復(fù)方黃柏液2mL、康復(fù)新液2mL 外用換藥，剪取適當(dāng)棉片，以該液體2mL 浸濕外敷，無菌紗布包裹固定。

1.2.3 檢測(cè)方法 治療第3d、第7d、第10d、第14d 每天早上對(duì)大鼠潰瘍創(chuàng)面進(jìn)行相機(jī)拍照，采用Adobe Photoshop CS5 軟件圖像處理創(chuàng)面，得創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合率按如下公式計(jì)算：

創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%

1.2.4 實(shí)驗(yàn)誤差 實(shí)驗(yàn)過程中因大鼠的體質(zhì)條件、健康狀態(tài)和飼養(yǎng)環(huán)境等不可抗的客觀因素存在，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中會(huì)出現(xiàn)偏離正常值較大的數(shù)據(jù)，為了使分析結(jié)果更符合客觀實(shí)際，一般選擇偏離較大的最大值或最小值將其剔除。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPASS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，各組數(shù)據(jù)以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下肢靜脈性潰瘍動(dòng)物模型 本研究中，與模型組相比，復(fù)方五鳳草液給藥第3、7d 顯著促進(jìn)了大鼠創(chuàng)面的愈合（t值=3.049，P=0.016＜0.05；t值=3.273，P=0.011＜0.05）。與陽性藥相比，效果優(yōu)于復(fù)方黃柏液，但無顯著差異。給藥第10、14d 時(shí)，各組大鼠的創(chuàng)面已基本趨于痊愈，組間沒有顯著性差異。見表1。

表1 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

表1 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 45.10±2.90 87.02±2.24 93.56±3.31 98.36±1.06復(fù)方五鳳草液 61.98±4.71* 94.76±0.75* 98.92±0.68 100.00±0.00復(fù)方黃柏液 56.76±4.46 91.54±1.14 98.14±0.79 100.00±0.00

2.2 燒傷性潰瘍動(dòng)物模型 本研究中，給藥前期（第3、7d）各組間無顯著性差異。但是給藥第10、14d 時(shí)，與模型組相比，復(fù)方五鳳草液能顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)面的愈合（t值=2.319，P=0.49＜0.05；t值=3.429，P=0.09＜0.01）。與陽性藥相比，效果略優(yōu)于康復(fù)新，但無顯著性差異。見表2。

表2 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠燒傷性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

表2 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠燒傷性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 19.73±5.16 37.97±4.11 46.84±4.92 72.09±4.66復(fù)方五鳳草液 22.06±1.59 37.63±3.92 58.67±1.36* 89.64±2.10**康復(fù)新 22.18±3.90 43.79±4.35 58.87±3.34 83.96±3.93

2.3 壓力性潰瘍動(dòng)物模型 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠壓力性潰瘍創(chuàng)面愈合的影響與模型組相比并無顯著性差異。而陽性藥康復(fù)新在給藥第10、14d 顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)面的愈合（t值=4.197，P=0.002＜0.01；t值=2.635，P=0.025＜0.05）。見表3。

表3 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠壓力性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

表3 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠壓力性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 26.10±2.68 56.53±1.69 79.30±0.94 89.80±1.31復(fù)方五鳳草液 22.55±2.03 58.28±3.52 80.88±1.51 89.08±0.78康復(fù)新 27.20±2.10 63.18±3.88 86.30±1.38** 94.23±1.05*

2.4 糖尿病潰瘍動(dòng)物模型 本研究中，復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的影響與模型組相比并無顯著性差異，而陽性藥復(fù)方黃柏液能促進(jìn)大鼠創(chuàng)面的愈合，并在給藥第14d 出現(xiàn)顯著性差異（t值=2.322，P=0.49＜0.05）。見表4。

表4 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

表4 復(fù)方五鳳草液對(duì)大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 34.38±4.18 49.86±4.78 60.68±5.60 84.24±1.37復(fù)方五鳳草液 29.58±2.75 48.20±4.33 69.20±4.70 80.96±2.99復(fù)方黃柏液 40.90±2.24 62.36±3.82 73.10±3.70 88.54±1.24*

3 討論

復(fù)方五鳳草液為我院院內(nèi)協(xié)定方，由五鳳草、白芨、貓爪草等組方而成，方中五鳳草行水殺蟲、祛腐解毒［7］，白芨斂瘡消腫、止血生肌［8］，貓爪草拔膿解毒，活血消腫［9］。諸藥合用，共湊提膿祛腐，活血生肌之效，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。臨床主要用于結(jié)核性潰瘍等慢性創(chuàng)面的外用治療，療效確切，且安全可靠。在此基礎(chǔ)上，我們通過結(jié)核性潰瘍家兔模型從巨噬細(xì)胞活化角度［10］對(duì)復(fù)方五鳳草液的作用機(jī)制做了初步探索，對(duì)M1、M2 型巨噬細(xì)胞［11］的表型指標(biāo)iNOS、Arg-1 進(jìn)行觀察，前期研究結(jié)果表明復(fù)方五鳳草液可能通過有效降低iNOS 的表達(dá)，促進(jìn)Arg-1 的表達(dá)［12］，來平衡慢性難愈性創(chuàng)面中M1型募集、M2 型損耗的混合極化狀態(tài)［13］促進(jìn)創(chuàng)面愈合。這一點(diǎn)為我們開展復(fù)方五鳳草液對(duì)多種慢性創(chuàng)面的藥效學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

為了觀察復(fù)方五鳳草液對(duì)不同慢性創(chuàng)面的療效，本次實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建幾種常見慢性難愈性潰瘍的動(dòng)物模型，設(shè)組比較觀察該復(fù)方外用中藥的療效，對(duì)其藥效進(jìn)行初篩。

藥效初篩實(shí)驗(yàn)表明：在下肢靜脈性潰瘍實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方五鳳草液給藥前期能顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)面的愈合，而且效果優(yōu)于復(fù)方黃柏液，但無顯著性差異。給藥后期，由于造模創(chuàng)口較小，各組大鼠的創(chuàng)面已基本趨于痊愈，組間沒有顯著性差異。整體來說，復(fù)方五鳳草液能有效治療大鼠下肢靜脈性潰瘍，促進(jìn)其創(chuàng)面愈合。在燒傷實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方五鳳草液在給藥后期能顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)面的愈合，效果略優(yōu)于康復(fù)新，但無顯著性差異。總的來說，復(fù)方五鳳草液能促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合，具有治療效果。而在壓力性潰瘍及糖尿病潰瘍實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方五鳳草液的表現(xiàn)不如陽性藥物組，并不能更有效地促進(jìn)潰瘍愈合。這一點(diǎn)和我們的臨床觀察有出入，我們考慮下一步放大樣本量，調(diào)整藥物濃度后再做實(shí)驗(yàn)觀察?？傊敬螌?shí)驗(yàn)結(jié)果表明：復(fù)方五鳳草液能有效促進(jìn)大鼠下肢靜脈性潰瘍、燒傷創(chuàng)面的愈合，可開展這兩種潰瘍模型的藥效機(jī)制研究。

眾所周知，慢性難愈性潰瘍的起病原因多種多樣，既能由某種特定細(xì)菌引發(fā)（結(jié)核性潰瘍），也可由原有基礎(chǔ)疾病并發(fā)而來（糖尿病潰瘍，靜脈性潰瘍），使得臨床上西醫(yī)的治療手段相對(duì)局限。加上其易纏滿反復(fù)的特點(diǎn)，且創(chuàng)傷機(jī)理研究尚不完善，慢性難愈性潰瘍已經(jīng)成為臨床上困擾患者和醫(yī)療工作者的巨大難題。而祖國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)藥外治在創(chuàng)面修復(fù)中扮演了極為重要的角色。復(fù)方五鳳草液是我院治療結(jié)核性潰瘍的院內(nèi)制劑，前期已有大量數(shù)據(jù)表明其在治療結(jié)核性潰瘍方面的臨床效果顯著，并且其機(jī)理研究也有了很大的發(fā)現(xiàn)。通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為復(fù)方五鳳草液的治療并不局限于結(jié)核性潰瘍，對(duì)其他如下肢靜脈潰瘍、燒傷性潰瘍等創(chuàng)面也有十分明顯的治療效果，這一結(jié)論為其進(jìn)一步的藥效機(jī)制研究提供了依據(jù)，也為其以后拓寬臨床應(yīng)用范圍打下了基礎(chǔ)。