復(fù)方柴歸方抗抑郁作用劑量篩選及藥效驗(yàn)證

許騰,劉歡,高耀,令狐婷,高曉霞,周玉枝,田俊生,秦雪梅*

(1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,山西 太原 030006;2.地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006;3.中國(guó)輻射防護(hù)研究院 藥物安全評(píng)價(jià)研究中心,山西 太原 030006)

0 引言

抑郁癥是以顯著且持久的情緒低落為基本臨床特征,呈無(wú)趣、無(wú)欲、無(wú)助、無(wú)望、無(wú)快感的狀態(tài),嚴(yán)重者甚至自殺,是目前最常見(jiàn)的精神障礙之一,也是致殘的主要原因之一,嚴(yán)重影響患者的生活、工作和學(xué)習(xí)[1-4]。

目前臨床上治療抑郁癥多以選擇性5-HT及去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑(SNPIs)(文拉法辛)為主,克服了第一代抗抑郁劑MAOI(單胺氧化酶抑制劑)和TCAs(三環(huán)類)的心臟毒性和抗膽堿能毒性,但是該類藥物整體有效率不超過(guò) 70%,起效時(shí)間需 2～4 周[5],且存在胃腸功能紊亂、認(rèn)知功能減退、性欲降低等不良反應(yīng)[6]。而中藥復(fù)方在抑郁癥治療中具有多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、毒副作用小、協(xié)同作用強(qiáng)和整體調(diào)節(jié)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[7],目前已上市的具有抗抑郁作用的中藥復(fù)方主要有逍遙丸、解郁丸、解郁安神顆粒、烏靈膠囊、安樂(lè)膠囊和柴胡舒肝丸等。

本課題組經(jīng)過(guò)前期對(duì)逍遙散的最佳抗抑郁組分進(jìn)行藥效學(xué)篩選和抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,在逍遙散組方的基礎(chǔ)上去掉生姜和茯苓得到復(fù)方柴歸方,并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[8-12]。本文在前期對(duì)FFCGF進(jìn)行單次給藥毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)和最大耐受量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選其抗抑郁有效劑量、驗(yàn)證FFCGF抗抑郁藥效,并確定其最佳劑量,為確定臨床劑量提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

主要儀器:透明圓筒玻璃缸(高30 cm,直徑15 cm);小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)箱;自制大鼠曠場(chǎng)測(cè)試箱(長(zhǎng)100 cm、寬100 cm、高80 cm)底部平均分為25格[13]等。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方柴歸方(柴胡20 g、當(dāng)歸20 g、白芍20 g、麩炒白術(shù)20 g、炙甘草10 g、薄荷6.7 g,以上藥材均購(gòu)于山西省華陽(yáng)藥業(yè)有限公司)。經(jīng)本課題組前期提取工藝研究和藥效學(xué)篩選,最終確定以乙醇提取合并藥渣水提醇沉部分的工藝來(lái)制備FFCGF[14]。鹽酸文拉法辛膠裹(博樂(lè)欣,25 mg/粒,成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批號(hào)140805)。逍遙丸(濃縮)(200丸/瓶,九芝堂股份有限公司,批號(hào)201412074);苦味酸酒精溶液、蒸餾水、蔗糖、水合氯醛等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)ICR雄性小鼠,雄性,體重18～22 g;SPF級(jí)SD雄性大鼠體重180～220 g,均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2014-0001。自然晝夜節(jié)律(12 h白天,12 h黑夜),室溫20～25℃,濕度40%～60%,自由飲食飲水(自來(lái)水、普通飼料),適應(yīng)1周。

2 方法

2.1 抗抑郁有效劑量篩選實(shí)驗(yàn)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

根據(jù)本課題組前期單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)、最大耐受量實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)設(shè)劑量篩選實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)期結(jié)束后,根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分為:空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(鹽酸文拉法辛膠囊0.05 g/kg)、劑量1組(FFCGF 28 g生藥/kg)、劑量2組(FFCGF 14 g生藥/kg)、劑量3組(FFCGF 7 g 生藥/kg)、劑量4組(FFCGF 3.5 g生藥/kg)、劑量5組(FFCGF 1.75 g生藥/kg),每組12只小鼠,其中劑量5組相當(dāng)于逍遙丸的人日服劑量?？瞻讓?duì)照組灌胃(ig)給予蒸餾水20 mL/(kg·d),各給藥組藥物溶于蒸餾水至相應(yīng)濃度ig給藥,連續(xù)14 d,末次給藥后1 h。

2.1.2 行為絕望模型

2.1.2.1 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)

在末次給藥后1 h,在距小鼠尾尖1 cm處使用用醫(yī)用膠帶粘住將其懸掛在小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)箱內(nèi),使每只小鼠均處于安靜且互不干擾的空間內(nèi),適應(yīng)2 min,觀察后4 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間(四肢停止掙扎)[15]。

“古玩的價(jià)值并不在于器物本身，凝聚在器物上的時(shí)間和歷史才是真正價(jià)值所在?！比~總看王祥一臉不信，繼續(xù)說(shuō)道?！皠偛盼铱催^(guò)你手里的玉墜，從樣式上看起來(lái)，這個(gè)是唐宋時(shí)期的款式，上面的紋飾看起來(lái)也是那個(gè)年代做工，要是我沒(méi)有看走眼，你的這批玉器來(lái)頭可不小啊?！?/p>

2.1.2.2 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)

在末次給藥1 h 后,每只小鼠單獨(dú)置于一個(gè)裝有清潔水的透明圓柱形有機(jī)玻璃缸內(nèi),適應(yīng)2 min,觀察后4 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間(四肢停止掙扎)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫保持在(25±1)℃,每只小鼠測(cè)試完畢后應(yīng)及時(shí)換水,保證每組水質(zhì)無(wú)差異。測(cè)試完成后立即用毛巾擦干并將小鼠歸籠[15]。

2.2 抗抑郁藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.2.1 行為絕望模型

根據(jù)2.1部分有效劑量篩選結(jié)果進(jìn)行抗抑郁藥效行為絕望模型驗(yàn)證,設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(鹽酸文拉法辛膠囊0.05 g/kg)、FFCGF高劑量(28 g生藥/kg)、FFCGF中劑量(14 g生藥/kg)、FFCGF低劑量(7 g生藥/kg)、逍遙丸組(14 g生藥/kg),其中設(shè)置逍遙丸組的劑量相當(dāng)于FFCGF的中劑量,用于對(duì)比基于逍遙散裁化而得的復(fù)方柴歸方與逍遙丸的抗抑郁作用。具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及操作同2.1.2.1、2.1.2.2.

2.2.2 慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激模型(CUMS)

2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

大鼠適應(yīng)1周后,根據(jù)第0周測(cè)定的糖水偏愛(ài)率基線、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基線、體重基線劑量篩選的結(jié)果,將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(鹽酸文拉法辛膠囊,0.035 g/kg)、中西聯(lián)合用藥組(FFCGF中劑量+鹽酸文拉法辛膠囊,9.7 g/kg+0.035 g/kg)、FFCGF高劑量(19.4 g生藥/kg)、FFCGF中劑量(9.7 g生藥/kg)、FFCGF低劑量(4.8 g生藥/kg)7個(gè)組,每組10只,并用苦味酸酒精溶液進(jìn)行標(biāo)號(hào)?？瞻讓?duì)照組群養(yǎng)(5只/籠),其余各組均孤養(yǎng)。造模同時(shí)ig給藥,空白和模型對(duì)照組ig給予蒸餾水10 mL/(kg·d),各給藥組ig給予相應(yīng)劑量的藥物,給藥1 h后給予刺激,持續(xù)28 d。

參照Willner等[16]方法并進(jìn)行改進(jìn),刺激因子包括束縛,禁食,熱應(yīng)激,禁水,超聲刺激,冰水浴,晝夜顛倒,夾尾,足底電擊等9種。每日1種,且每種刺激隨機(jī)3～4次,保證每種刺激不連續(xù)出現(xiàn)持續(xù) 28 d。在實(shí)驗(yàn)第0,7,14,21,28 d分別測(cè)定各組大鼠的體重、糖水偏愛(ài)率(糖水偏愛(ài)率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)),以及曠場(chǎng)試驗(yàn)中的穿越格數(shù)和直立次數(shù)。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 有效劑量篩選結(jié)果

小鼠FST、TST劑量篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明,與空白對(duì)照組對(duì)比,陽(yáng)性對(duì)照藥文拉法辛組小鼠不動(dòng)時(shí)間極顯著降低(P<0.01);FFCGF劑量1組和劑量2組不動(dòng)時(shí)間具有極顯著差異(P<0.01),劑量3組具有顯著差異(P<0.05),劑量4組～劑量5組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明FFCGF劑量在組3(7 g生藥/kg)～組1(28 g生藥/kg)時(shí),可以顯著降低小鼠FST、TST不動(dòng)時(shí)間,緩解小鼠“絕望”狀態(tài)。

3.2 抗抑郁藥效驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 行為絕望模型結(jié)果

小鼠TST、FST藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明,與空白對(duì)照組對(duì)比,各給藥組小鼠不動(dòng)時(shí)間均顯著降低,其中陽(yáng)性藥文拉法辛、逍遙丸、FFCGF高劑量、中劑量組組有極顯著差異(P<0.01)。這說(shuō)明FFCGF劑量在7 g生藥/kg～28 g生藥/kg時(shí)能夠緩解小鼠的“絕望”狀態(tài),其中14 g生藥/kg和28 g生藥/kg效果更好。

3.2.2 慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.2.1 外觀及體重

在實(shí)驗(yàn)前期的適應(yīng)階段,大鼠體態(tài)外觀和行為活動(dòng)均表現(xiàn)正常,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白組大鼠也一直維持正常狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)初期,各給藥組和模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的易激惹、敏感等癥狀；在實(shí)驗(yàn)后期,模型組大鼠出現(xiàn)明顯的行為活動(dòng)減少、毛色枯槁、糞便粒數(shù)小且數(shù)量多等癥狀。

由圖3可知,各組在實(shí)驗(yàn)期間體重均呈明顯上升趨勢(shì)。其中,與空白對(duì)照組相比,模型組在第7天開(kāi)始體重出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01);與模型組相比,FFCGF各組在第7天開(kāi)始體重出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01),陽(yáng)性藥文拉法辛在第21天大鼠體重出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05),在第21天之后,各給藥組大鼠體重均高于模型組且具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01),說(shuō)明文拉法辛和FFCGF能夠改善由于CUMS模型引起的體重增長(zhǎng)緩慢的狀態(tài)。FFCGF各組從第7天開(kāi)始就能夠顯著調(diào)節(jié)CUMS引起的體重增長(zhǎng)緩慢的狀態(tài)可以推測(cè),FFCGF對(duì)緩解應(yīng)激狀態(tài)下的食欲不振、消化系統(tǒng)功能減弱引起的體重增長(zhǎng)緩慢狀態(tài)起效較快。由此可見(jiàn),FFCGF在改善由于應(yīng)激引起的食欲不振、消化功能減弱而導(dǎo)致的體重增長(zhǎng)緩慢的狀態(tài)速度較快,效果較好。

圖1 FFCGF在TST、FST下劑量篩選與空白組比較:*P<0.05,**P<0.01Fig.1 FFCGF dose screening under TST, FST vs the control group

圖2 FFCGF對(duì)TST、FST的影響與空白組比較:*P<0.05,**P<0.01.Fig.2 Effect of FFCGF on TST and FST vs. the control group

圖3 FFCGF對(duì)CUMS模型體重的影響與空白組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01.Fig.3 Effect of FFCGF on body weight of CUMS model##P<0.01 vs the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

3.2.2.2 糖水消耗實(shí)驗(yàn)

由圖4可知,與空白對(duì)照組相比,從第14天開(kāi)始,模型組糖水偏愛(ài)率顯著降低(P<0.05);與模型組相比,在造模第21天開(kāi)始,所有給藥組的糖水偏愛(ài)率均顯著回調(diào)(P<0.01)。這說(shuō)明CUMS應(yīng)激模型能顯著降低大鼠糖水偏愛(ài)率,模擬快感缺失的癥狀,文拉法辛和FFCGF各劑量組均能回調(diào)糖水偏愛(ài)率,較好的改善這一癥狀。

圖4 FFCGF對(duì)CUMS模型糖水偏愛(ài)率實(shí)驗(yàn)的影響與空白組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01Fig.4 Effect of FFCGF on CUMS model sucrose preference rate experiment #P<0.05,##P<0.01 vs. the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

3.2.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

由圖5可知,與空白對(duì)照組相比,模型組在第14天開(kāi)始大鼠的穿越格數(shù)和直立次數(shù)顯著降低(P<0.0.1);與模型組相比,在第21天時(shí),文拉法辛組、聯(lián)合用藥組和FFCGF高劑量、中劑量組在回調(diào)大鼠曠場(chǎng)中穿越格數(shù)和直立次數(shù)指標(biāo)中均出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01),而FFCGF低劑量組在大鼠穿越格數(shù)出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),在直立次數(shù)中并未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。但低劑量組可延緩大鼠在曠場(chǎng)中穿越格數(shù)、直立次數(shù)降低的趨勢(shì)。在CUMS應(yīng)激下,大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)穿越格數(shù)、直立次數(shù)減少,說(shuō)明CUMS模型能降低大鼠自主活動(dòng)能力。在給藥組中,文拉法辛組、聯(lián)合用藥組、FFCGF高劑量、中劑量組均能回調(diào)穿越格數(shù)、直立次數(shù),說(shuō)明FFCGF高劑量、中劑量組均能顯著緩解大鼠由于CUMS 應(yīng)激引起的活動(dòng)能力下降的狀態(tài)。

圖5 FFCGF對(duì)CUMS模型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響與空白組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01.Fig.5 Effect of FFCGF on the CUMS model#P<0.05,##P<0.01vs the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

4 討論

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》,具有疏肝解郁、調(diào)和脾胃之功效,主治肝郁血虛脾弱之癥[17]。本研究所用復(fù)方柴歸方是在逍遙散的基礎(chǔ)上進(jìn)行拆方而來(lái),本課題組前期通過(guò)對(duì)逍遙散抗抑郁活性部位進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其低極性部位抗抑郁作用顯著,通過(guò)成分歸屬并結(jié)合原湯劑在臨床上的加減方式用法,裁去生姜、茯苓而得復(fù)方柴歸方,采用前期篩選的復(fù)方柴歸方最佳提取工藝給藥,篩選抗抑郁有效劑量,驗(yàn)證其抗抑郁藥效,并確定最佳抗抑郁劑量[18-21]。

本研究采用行為絕望模型和CUMS模型來(lái)進(jìn)行抗抑郁劑量篩選和初步藥效學(xué)驗(yàn)證。其中行為絕望模型包括TST、FST動(dòng)物模型,利用動(dòng)物不能逃出惡劣環(huán)境以致行為絕望的模型[22],是經(jīng)典的抗抑郁劑量篩選、藥效評(píng)價(jià)模型。CUMS抑郁模型主要模擬了快感缺乏這種人類抑郁的核心癥狀,同時(shí)模擬了輕、中度抑郁癥的臨床癥狀[23],是目前公認(rèn)的經(jīng)典抑郁模型之一,常用于抗抑郁藥物篩選、抗抑郁藥物藥效評(píng)價(jià)、抗抑郁藥物作用機(jī)制及抑郁癥病理生理機(jī)制的研究。

劑量篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FFCGF劑量在7 g生藥/kg時(shí)開(kāi)始起效,且14 g生藥/kg和28 g生藥/kg抗抑郁效果較好。在有效劑量篩選時(shí)所選用的劑量5(1.75 g生藥/kg)相當(dāng)于逍遙丸臨床人日服劑量,結(jié)果顯示,在該劑量下,FFCGF并沒(méi)有發(fā)揮抗抑郁作用。逍遙丸主要用于治療疏肝健脾,養(yǎng)血調(diào)經(jīng),并未提及治療肝郁脾虛型抑郁癥所需劑量,本實(shí)驗(yàn)從側(cè)面驗(yàn)證在該劑量(1.75 g生藥/kg)下逍遙丸無(wú)抗抑郁作用,故本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行藥效驗(yàn)證時(shí)加入逍遙丸對(duì)照組來(lái)探討逍遙丸發(fā)揮抗抑郁作用所需劑量及其與FFCGF發(fā)揮抗抑郁作用關(guān)系。因此在進(jìn)行行為絕望模型來(lái)驗(yàn)證FFCGF抗抑郁藥效時(shí),加入了逍遙丸、文拉法辛作為空白對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)中逍遙丸組所用劑量相當(dāng)于FFCGF中劑量,逍遙丸表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用,且抗抑郁療效與FFCGF中劑量相似,說(shuō)明FFCGF在逍遙散的基礎(chǔ)上化裁去掉生姜、茯苓后的抗抑郁作用并未發(fā)生明顯改變,證明了基于逍遙散化裁和提取工藝的優(yōu)化而來(lái)的FFCGF具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)中FFCGF中劑量與逍遙丸給藥組劑量相當(dāng),相當(dāng)于人日服逍遙丸248粒,說(shuō)明逍遙丸發(fā)揮抗抑郁作用的劑量較大,FFCGF可以從服用劑量上發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。

根據(jù)TST、FST實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,文拉法辛相較于逍遙丸和FFCGF在調(diào)節(jié)懸尾和強(qiáng)迫游泳引起的不動(dòng)時(shí)間起效快,效果好等特點(diǎn),但已上市藥物文拉法辛有胃腸道不適、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、視覺(jué)異常、打哈欠、出汗和性功能異常等不良反應(yīng)[24],后期應(yīng)對(duì)FFCGF是否具有副作用,且與西藥聯(lián)合用藥的“減毒增效”特點(diǎn)進(jìn)行探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,聯(lián)合用藥組起效時(shí)間快于文拉法辛組,大鼠的穿越格數(shù)和直立次數(shù)在實(shí)驗(yàn)的第14天顯著增加,且在糖水偏愛(ài)率的動(dòng)態(tài)測(cè)定中平均值均高于文拉法辛,說(shuō)明FFCGF與文拉法辛聯(lián)合使用抗抑郁療效優(yōu)于文拉法辛,符合中西藥聯(lián)合用藥“增效”的目的。聯(lián)合用藥組相較于陽(yáng)性對(duì)照組文拉法辛在緩解CUMS應(yīng)激狀態(tài)下食欲不振、消化功能減弱引起的體重增長(zhǎng)緩慢有較好的效果,文拉法辛有胃腸道不適等不良反應(yīng),側(cè)面驗(yàn)證聯(lián)合用藥組在保證藥效的前提下能夠降低文拉法辛的副作用,在一定程度上符合中西藥聯(lián)合用藥“減毒”的目的。

5 結(jié)論

本文對(duì)FFCGF進(jìn)行抗抑郁有效劑量篩選,結(jié)果顯示7 g生藥/kg～28 g生藥/kg具有良好的抗抑郁 效果。通過(guò)對(duì)抗抑郁藥效驗(yàn)證,顯示所篩得劑量下FFCGF具有良好的抗抑郁作用。根據(jù)本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合前期單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)及最大耐受量實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇14 g生藥/kg為最佳抗抑郁劑量。