黃連素通過靶向GRP78增強結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性

剌曉琴,金曉弟,張立超,李卓玉,,*

(1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006; 3.山西大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院,山西 太原 030006)

0 引言

黃連素,又稱為小檗堿,是一種異喹啉類的植物性生物堿，作為黃連的主要活性成分,長期以來被用作非處方口服藥物治療腸道感染和腹瀉[1]，又因其抗菌、抗高血脂、抗糖尿病、抗炎和抗氧化等多種功效的顯現(xiàn)而被開發(fā)為臨床藥物[2-3]。隨著研究的深入,小檗堿的抗腫瘤作用也逐漸得到認可,尤其是作為臨床腫瘤治療的輔助藥物。Pandey等發(fā)現(xiàn)黃連素通過靶向胃癌細胞中的Survivin和STAT3增強了5-Fu的化療敏感性[4];Yu等發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制NF-κB的表達增強了腸癌細胞對伊立替康的敏感性[5];Palmieri等也證實了黃連素在增強喉癌細胞HEP2對5-Fu和順鉑敏感性方面具有一定作用[6]。腫瘤在化療過程中對藥物敏感性的減弱及其在治療過程中所產(chǎn)生的副作用是癌癥治療中急需解決的問題,而黃連素增強化療敏感性的分子機制一直沒有得到深入的研究,因此探討黃連素增強化療敏感性的機制將有助于其在腫瘤臨床的應(yīng)用。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的應(yīng)激蛋白,在腫瘤缺氧、缺糖以及酸性微環(huán)境的刺激下,結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食道癌、腦癌、前列腺癌和黑素瘤等多種類型的腫瘤中會發(fā)生GRP78的高表達[7-9]。不僅胞內(nèi)高水平的GRP78會促進腫瘤細胞抵抗凋亡,逃逸免疫,形成耐藥性[10-11],同時過表達的GRP78在逃過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收系統(tǒng)的監(jiān)視而被分泌到胞外后也能促進腫瘤生長進程[12]。研究表明,腫瘤分泌型GRP78能夠激活內(nèi)皮細胞中的ERK和Akt信號,幫助血管內(nèi)皮細胞抵御硼替佐米的凋亡誘導(dǎo)作用[13];還能夠通過骨髓間充質(zhì)干細胞表面的TGF-β1受體,激活細胞內(nèi)TGF-β/Smad信號,促使骨髓間充質(zhì)干細胞向腫瘤相關(guān)成纖維細胞分化[14];也能夠誘導(dǎo)巨噬細胞向具有M2型特征的腫瘤相關(guān)巨噬細胞方向極化[15]。由此可見,腫瘤分泌型GRP78對腫瘤微環(huán)境具有強大的改造功能。因此,如果能夠干預(yù)腫瘤細胞中GRP78的分泌,阻斷其對微環(huán)境的影響,將有助于增強化療藥物的抗腫瘤作用。

本文旨在闡明黃連素抑制GRP78分泌的分子機制,為以GRP78為靶向的腫瘤治療提供一定的理論基礎(chǔ),也為基于腫瘤微環(huán)境的藥物開發(fā)提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體

藥品:黃連素(純度質(zhì)量分數(shù)為98%)購于中國百靈威科技有限公司;5-氟脲嘧啶(5-Fu,純度質(zhì)量分數(shù)≥99%)和MTT購于美國Sigma公司;結(jié)晶紫和三磷酸腺苷溶液購于中國索萊寶公司。

培養(yǎng)基和血清:RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國GIBCO公司。

試劑盒:外泌體提取試劑盒購于美國Thermo Fisher公司;ATP酶活性測定試劑盒購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

抗體:Caspase-7(WB: 1∶1 000)抗體購于美國CST公司;GRP78(WB: 1∶1 000)抗體購于中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;GAPDH(WB: 1∶5 000)、CD63(WB: 1∶1 000)抗體購于英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細胞系DLD1、HCT-116培養(yǎng)于37℃,體積分數(shù)為5% CO2,濕度飽和的恒溫培養(yǎng)箱中。所用培養(yǎng)基中均含有體積分數(shù)為10%胎牛血清和體積分數(shù)為1%青鏈霉素。

1.3 rGRP78蛋白的誘導(dǎo)表達和純化

為了模擬分泌型GRP78,我們構(gòu)建了原核表達的重組GRP78(rGRP78),具體的蛋白體外表達與純化步驟詳見參考文獻[16]。

1.4 納米粒子示蹤技術(shù)(NTA)

使用德國ZetaView PMX 110納米顆粒跟蹤分析儀可實時直接通過光學(xué)顯微鏡收集觀測納米顆粒的散射光信號,然后對其在溶液中的布朗運動進行拍攝,最后對每個布朗運動的粒子進行追蹤及分析,快速準確地計算出外泌體的流體力學(xué)半徑及濃度。具體操作步驟為:收集無血清條件培養(yǎng)基,并在4℃下4 000 r/min離心30 min,然后將上清液在PBS中稀釋至250倍。設(shè)置儀器參數(shù)并將測試樣品加入比色杯中測量。每種樣品溶液的體積達到1.5～2 mL。樣品的測量時間為1 min。

1.5 分子對接

從中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(http:∥tcm.cmu.edu.tw)中檢索黃連素的化合物結(jié)構(gòu),應(yīng)用Chemdraw軟件畫出黃連素分子結(jié)構(gòu),并用Cherm3D進行能量優(yōu)化,最終利用AutoDockTools軟件將文件轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。從PDB數(shù)據(jù)庫中調(diào)取GRP78不同結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),并去除其配體分子、水分子及無關(guān)緊要的金屬離子等。在Linux終端下運行Autodock 4.2 軟件,依次加載GRP78蛋白的不同結(jié)構(gòu)域和能量優(yōu)化后的黃連素,用Autogrid計算格點能量,對接運算采用拉馬克遺傳算法,各化合物與蛋白之間的結(jié)合情況用半經(jīng)驗的自由能評價方法評價。參數(shù)設(shè)置過程中,將參數(shù)“能量最大評價次數(shù)”確定為2 500 000,運行次數(shù)確定為100,其他參數(shù)采用軟件的默認設(shè)置,最終獲得對接結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果中的數(shù)據(jù)均為3次獨立試驗所得結(jié)果的均值±標準差(Mean±SD),使用單因素方差分析(ANOVA)檢驗各組之間的差異,并使用Student’st比較兩組之間差異的顯著性,P<0.05,P<0.01被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分泌型GRP78阻斷了黃連素對5-Fu的化療增敏作用

5-Fu是臨床上常用的癌癥化療藥物[17]。我們利用MTT、克隆形成實驗評估了黃連素在5-Fu抗腫瘤中的作用。結(jié)果表明雖然黃連素在低濃度下對HCT-116和DLD1細胞沒有明顯的作用,但是在與5-Fu聯(lián)合用藥后,以濃度依賴的方式顯著抑制了結(jié)腸癌細胞的存活(圖1A和1B)。進一步的克隆形成及western blot結(jié)果表明,黃連素和5-Fu聯(lián)合用藥明顯抑制了結(jié)腸癌細胞的克隆形成能力,促進了凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7的激活(圖2A和2B)。這些數(shù)據(jù)表明黃連素可以增強5-Fu的抗腫瘤作用。但在培養(yǎng)基中添加rGRP78蛋白后,黃連素對5-Fu的增敏作用減弱(圖1A,1B,2A和2B),表明分泌型GRP78能夠阻斷黃連素的化療增敏作用。

2.2 黃連素抑制了HCT-116和DLD1細胞中GRP78外泌體的分泌

腸癌細胞經(jīng)不同濃度的黃連素處理24 h后,收集其培養(yǎng)基檢測了GRP78的分泌量。結(jié)果顯示,黃連素以濃度依賴的方式抑制了HCT-116和DLD1細胞中GRP78的分泌(圖3A和3B)。腸癌細胞中GRP78主要以外泌體的形式被分泌到胞外[12],因此為了檢測黃連素是否抑制了GRP78進入外泌體,我們將培養(yǎng)基中的外泌體分離,并通過Western blot檢測了外泌體中GRP78的變化情況。結(jié)果表明：黃連素處理后外泌體中GRP78的量明顯受到了抑制,但是作為外泌體中特異性標記物的CD63并沒有受到黃連素作用的影響,表明黃連素對GRP78的作用是特異的(圖3C和3D)。GRP78分泌量的減少可由外泌體數(shù)目的減少引起,也可能是由GRP78進入外泌體的數(shù)量減少而導(dǎo)致,進一步利用NTA即使檢測黃連素處理前后外泌體的粒徑和數(shù)目,結(jié)果顯示:黃連素的處理沒有影響外泌體的大小和濃度(圖3E)。這些結(jié)果表明黃連素很可能抑制了GRP78被分選入外泌體而阻斷其分泌。

(A、B) 利用MTT實驗檢測經(jīng)不同濃度的黃連素和5-Fu單獨處理、二者聯(lián)合處理或者40 nmol/L rGRP78同時處理24 h后，HCT-116和DLD1細胞的存活率，*P<0.05,**P<0.01。圖1 分泌型GRP78對黃連素與5-Fu協(xié)同效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用(A, B) MTT assays were used to detect the cell viability.HCT-116 and DLD1 cells were treated with different doses of berberine or 5-Fu alone,or in combination in the presence or abscence of rGRP78 (40 nmol/L) for 24 h, *P<0.05,**P<0.01Fig.1 Secreted GRP78 reversed the synergistic effect of berberine and 5-Fu

(A) 利用克隆形成實驗檢測經(jīng)黃連素、5-Fu單獨處理或者二者聯(lián)合處理以及40 nmol/L rGRP78同時處理7 d后，HCT-16和DLD1細胞的克隆形成能力。 (B) HCT-116和DLD1細胞如A所述處理24 h后，利用western blot檢測細胞中Caspase-7的變化。圖2 分泌型GRP78阻斷了黃連素對5-Fu的化療增敏作用(A) Colony forming experiments were performed for HCT-116 and DLD1 cells treated with5 μmol/L (10 μmol/L) berberine or 20 μmol/L (100 μmol/L) 5-Fu alone,or in combination in the presence or absence of 40 nmol/L rGRP78 for 7 days.(B) Western blot was used to detect the level of Caspase-7 in HCT-116 andDLD1 cells treated as described in A for 24 hFig.2 Secreted GRP78 blocked the chemotherapeutic sensitization of berberine on 5-Fu

2.3 黃連素分子和GRP78的ATP酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生了相互作用

基于上述結(jié)果推測:黃連素增強5-Fu的抗腫瘤效應(yīng)可能是通過與腫瘤細胞中GRP78發(fā)生了直接的相互作用,影響了其被分選進入外泌體。為了證明這一推測,利用分子對接技術(shù)進行虛擬對接分析,結(jié)果顯示黃連素能夠與GRP78相互結(jié)合(圖4A)。為了進一步確認這一現(xiàn)象,黃連素-Fe3O4磁珠與rGRP78和經(jīng)黃連素處理后的細胞裂解液孵育后進行pulldown實驗,隨后用GRP78抗體通過免疫印跡檢測。結(jié)果表明：黃連素不僅與體外純化的rGRP78結(jié)合,也能與內(nèi)源性的GRP78結(jié)合(圖4B和4C)。

已知GRP78的N端含有ATP酶結(jié)構(gòu)域,能夠?qū)TP水解成ADP,在C端有底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能夠特異性結(jié)合有七肽序列的多肽[18-19]。因此,針對GRP78的兩個特異性結(jié)構(gòu)域構(gòu)建GRP78的兩個截短體GFP-GRP78-N280和GFP-GRP78-C(400-654)(圖4D)后將其轉(zhuǎn)入細胞,利用黃連素-Fe3O4進行pulldown實驗來進一步檢測黃連素與GRP78結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明：含有ATP結(jié)合位點的GFP-GRP78-N280和完整的GRP78蛋白能夠與黃連素發(fā)生相互作用,而含有多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的GFP-GRP78-C(400-654)截短體不能與黃連素結(jié)合(圖4E)。

上述結(jié)果表明,黃連素與GRP78的結(jié)合位點位于GRP78的ATP酶結(jié)構(gòu)域,所以推測:黃連素可能與ATP競爭性地結(jié)合GRP78。再利用rGRP78與黃連素-Fe3O4去確定黃連素是否可以競爭性地抑制ATP結(jié)合到GRP78。結(jié)果表明隨著ATP濃度的增加,黃連素與GRP78的結(jié)合逐漸減少(圖4F)。由此可見，黃連素確實以競爭性結(jié)合的方式與GRP78存在相互作用,且該相互作用為非共價結(jié)合。這些結(jié)果進一步表明黃連素與GRP78的ATP酶催化結(jié)構(gòu)域存在相互作用。

(A、B) 利用western blot檢測經(jīng)黃連素處理后，HCT-116和DLD1細胞培養(yǎng)基中GRP78的變化。(C、D) 利用western blot檢測黃連素處理后，HCT-116和DLD1細胞外泌體中GRP78蛋白的變化。(E) NTA技術(shù)檢測5 μmol/L黃連素處理后HCT-116細胞外泌體中大小和數(shù)目的變化。圖3 黃連素抑制了GRP78以外泌體的形式分泌(A, B) Western blot of GRP78 levels in the culture supernatants of HCT-116 and DLD1 cells treated with berberine.(C, D) GRP78 protein levels were analyzed by western blot in exosomes of HCT-116 and DLD1 cells treated with berberine.(E) NTA was used to detect the size and number of exosomes in HCT-116 cells treated with 5 μmol/L berberine.Fig.3 Berberine inhibited the secretion of GRP78 via exosomes

2.4 黃連素抑制GRP78的ATP酶活性并通過構(gòu)象轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)GRP78的功能

由于ATP的結(jié)合和水解對于維持GRP78蛋白的活性是必需的[20],因此我們檢測了黃連素對rGRP78的ATP酶活性的影響。結(jié)果顯示隨著黃連素濃度的升高,GRP78的ATP酶活性隨之減弱(圖5A),表明黃連素與GRP78結(jié)合后可以抑制其ATP酶活性。研究表明,在哺乳動物細胞中,GRP78以可相互轉(zhuǎn)化的寡聚體和單體形式存在[21],單體形式是可以與未折疊蛋白質(zhì)結(jié)合的活性形式。以寡聚體形式存在的GRP78為失活狀態(tài),但與ATP結(jié)合后可轉(zhuǎn)化為有活性的單體形式[22]。我們的研究結(jié)果也顯示隨著ATP劑量的增加,可以有效地將HCT-116細胞內(nèi)二聚體GRP78轉(zhuǎn)化為單體(圖5B),而黃連素的加入則誘導(dǎo)了胞內(nèi)GRP78由活性的單體形式轉(zhuǎn)化為無活性的二聚體形式(圖5C和5D)。為了進一步驗證黃連素與ATP之間對于GRP78的競爭性作用,將ATP和黃連素與HCT-116細胞共同孵育,結(jié)果顯示：ATP可促進GRP78單體的形成,而黃連素的加入會消除ATP的作用,使得GRP78轉(zhuǎn)化為失活的二聚體形式(圖5E)。這些結(jié)果表明,黃連素可以通過與ATP競爭性的結(jié)合抑制GRP78的ATP酶活性,進而引起其構(gòu)象的改變。

3 討論

黃連素用于抗腫瘤主要是與各種抗癌藥物聯(lián)合使用起到增效減毒的作用。Pan等發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制AMPK-HIF-1α來逆轉(zhuǎn)乳腺癌對多柔比星的化療耐藥性[23];Zhang等發(fā)現(xiàn)黃連素通過增加ROS水平逆轉(zhuǎn)HER2陽性乳腺癌細胞對拉帕替尼的耐藥性[24];Wen等也發(fā)現(xiàn)黃連素能夠通過上調(diào)P21的表達來增強乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性[25]。從上述研究可以看出,黃連素在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面具有重要作用,但對于相應(yīng)機制的研究還停留在相對粗淺的階段，首先,對黃連素的具體作用靶點以及作用機制沒有明確的結(jié)論;其次,對黃連素逆轉(zhuǎn)耐藥的機制探討,主要聚焦在腫瘤細胞本身,而忽視了實體腫瘤的重要組成部分-腫瘤微環(huán)境的作用。本研究發(fā)現(xiàn)GRP78能夠作為黃連素的作用靶點，它與GRP78的ATP酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生直接的相互作用,而這種作用通過特異性抑制GRP78的ATP酶活性而實現(xiàn)。GRP78蛋白質(zhì)以多種形式存在,單體形式反映了GRP78的最大活性,而各種二聚體或低聚物顯示了較低活性或無活性的GRP78[20]。我們的結(jié)果顯示黃連素可以使GRP78從活性的單體形式轉(zhuǎn)化到無活性的二聚體或寡聚形式。這些結(jié)果表明黃連素可能是參與了細胞中GRP78功能的調(diào)節(jié)，而GRP78功能的喪失便使其無法進入分選途徑而分泌到胞外發(fā)揮促腫瘤作用。

(A) 黃連素與GRP78相互作用的分子對接結(jié)果。(B、C) 利用競爭性結(jié)合實驗檢測berberine與GRP78的相互作用。將rGRP78和HCT-116細胞裂解液分別與berberine-Fe3O4耦合磁珠在4℃下孵育過夜，使用GRP78抗體通過免疫印跡確認二者的相互作用。(D) GRP78全長及其截短體的示意圖。(E) 黃連素與GRP78相互作用結(jié)構(gòu)域的確認。GFP-GRP78、GFP-GRP78-N280和GFP-GRP78-C(400-654)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-116細胞48 h后，將細胞裂解液與berberine-Fe3O4耦合磁珠在4℃下孵育過夜，使用GFP抗體(上圖)和考馬斯藍染色(下圖)分析二者的相互作用。(F) rGRP78與berberine-Fe3O4耦合的磁珠在4℃孵育過夜，將ATP(0.5或1 μmol/L)加入到反應(yīng)體系中并在25℃下溫育30 min。使用GRP78抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析二者的相互作用。圖4 黃連素能夠與GRP78相互作用(A) Molecular docking results of the interaction between berberine and GRP78.(B, C) rGRP78 protein and the lysate of HCT-116 cells wereincubated with berberine-Fe3O4 beads overnight at 4℃, respectively.The interaction between GRP78 and berberine was confirmed by immunoblotting using GRP78 antibody.(D) Schematic representation of the full length of GRP78 and its truncation.(E) GFP-GRP78, GFP-GRP78-N280 and GFP-GRP78-C (400-654) plasmids were transfected into HCT-116 cells for 72 h,and the cell lysate was incubated with berberine-Fe3O4 beads overnight at 4℃.The interaction was analyzed using GFP antibody (top panel) and Coomassie blue staining (bottom panel).(F) rGRP78 and berberine-Fe3O4 beads were incubated overnight at 4℃. ATP (0.5 or 1 μmol/L) was added to thereaction solution and incubated for 30 min at 25℃. The interaction was analyzed by western blot using GRP78 antibody.Fig.4 Berberine interacted with GRP78

(A) 不同濃度的黃連素與rGRP78共孵育后，檢測黃連素對rGRP78的ATP酶活性的影響， *P<0.05，**P<0.01。(B) ATP對GRP78構(gòu)象的影響。將不同劑量的ATP (1,10或30 μmol/L)與HCT-116細胞于25℃下在25 μL反應(yīng)混合物中(20 mmol/L HEPES (pH 7.0))孵育30 min后，使用非變性凝膠電泳進行GRP78的構(gòu)象變化分析。(C、D) 黃連素對HCT-116和DLD1細胞中GRP78構(gòu)象的影響。(E) 將ATP(10 μmol/L)和不同劑量的黃連素(1，5或10 μmol/L)一起溫育。蛋白質(zhì)在非變性凝膠上分離，隨后通過免疫印跡進行檢測。M，單體；D，二聚體。圖5 黃連素對GRP78的ATP酶活性和構(gòu)象的影響(A) ATPase activity of rGRP78 was examined, *P<0.05, **P<0.01.(B) ATP concentrations on the conversion of the GRP78 dimer to a monomer in HCT-116 cells.Different doses of ATP (1, 10 or 30 μmol/L) with HCT-116cells were incubated for 30 min at 25℃ in a 25 μL reaction mixture [20 mmol/L HEPES (pH 7.0)].The analysis for conformational changes was performed using non-denaturing gel electrophoresis.(C, D) Effect of berberine on the conformation of GRP78 in HCT-116 and DLD1 cells.(E) ATP (10 μmol/L) was incubated with different doses of berberine (1, 5 or 10 μmol/L).Proteins were separated on non-denaturing gels and subsequently detected by immunoblotting. M, monomer; D, dimer.Fig.5 Effects of berberine on ATPase activity and conformation change of GRP78

GRP78在多種腫瘤中的過度表達使其在腫瘤中的定位發(fā)生了變化。研究表明在細胞膜、胞質(zhì)、腫瘤分泌物等都發(fā)現(xiàn)有GRP78的存在,而其定位的異常對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了明顯的促進作用[26-27]。因此,GRP78抑制劑的尋找可能是腫瘤治療的趨勢。目前臨床藥物主要是針對實體瘤發(fā)揮抗腫瘤作用,有一些報道已經(jīng)顯示Isthmin可作為細胞表面GRP78的抑制劑[28-29],HA15和HK40A可作為胞內(nèi)GRP78的抑制劑[30-31],但針對腫瘤分泌型GRP78的抑制劑卻鮮有報道。已有研究表明GRP78可作為胃癌的血清診斷指標[32],而且它有強大的改造腫瘤微環(huán)境的功能[33],所以分泌型GRP78抑制劑的篩選也就成為腫瘤治療中亟待解決的任務(wù)。本研究首次發(fā)現(xiàn)了黃連素可以作為分泌型GRP78的抑制劑,阻斷其被進入外泌體進而被分泌到胞外,從而達到改善腫瘤微環(huán)境的目的。因此,黃連素可以用作輔助藥物與靶向腫瘤的抗癌藥物相結(jié)合以治療腫瘤。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)使用外源純化的rGRP78蛋白模擬腫瘤分泌型GRP78可以逆轉(zhuǎn)黃連素在5-Fu抗腫瘤中的協(xié)同效應(yīng),表明黃連素可能是通過抑制GRP78分泌發(fā)揮化療增敏作用。進一步的機制研究證實了黃連素增強5-Fu的抗腫瘤效應(yīng)是通過與腫瘤細胞中GRP78發(fā)生了直接的相互作用,抑制了GRP78的ATP酶活性,導(dǎo)致了GRP78活性的喪失,進而影響了GRP78被分選進入外泌體,從而使腫瘤細胞失去了通過分泌型GRP78調(diào)控微環(huán)境的能力,增強了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。這表明GRP78是導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物不敏感的重要原因,而黃連素能夠通過直接靶向GRP78發(fā)揮逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用。