慢性砷暴露誘導(dǎo)小鼠肺結(jié)構(gòu)損傷和免疫失衡

李秀娟,儀慧蘭,曾群

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院,山西 太原 030006; 3.山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山西 太原 030024)

砷是環(huán)境中廣泛存在的一種類金屬元素。自然過程或人為因素(如采礦、金屬冶煉等)導(dǎo)致砷在一些地區(qū)的空氣、水或土壤中含量較高[1-2]。砷可通過呼吸吸入、食物和飲水?dāng)z入、皮膚吸收進(jìn)入人體,其中飲用含砷水是人群砷攝入的主要途徑[3-4]。據(jù)不完全統(tǒng)計,地下水砷含量超出世界衛(wèi)生組織(WHO)飲用水標(biāo)準(zhǔn)(10 μg/L)的國家有105個,暴露人群達(dá)2億人[5]。我國約有1960萬人面臨著飲用高砷水的健康風(fēng)險[6]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,長期飲用高砷水可引起呼吸急促、支氣管擴(kuò)張、肺功能下降等癥狀,誘發(fā)慢性咳嗽、肺炎、慢阻肺等呼吸道疾病[7-9],增加肺癌的發(fā)生率和死亡率[5,10-11]。研究表明,大鼠飲用含砷水4周后,肺組織發(fā)生炎性病理損傷[12]。小鼠灌胃含砷水或飲用含砷水后,肺促炎細(xì)胞因子及CD4+T細(xì)胞亞群分化相關(guān)基因表達(dá)改變[13]。小鼠孕期飲水砷暴露會影響子鼠肺臟發(fā)育,使肺容積、肺泡數(shù)量及表面積均明顯減小,肺黏液分泌(Clca3, Muc5b, Scgb3a1)、先天免疫(Reg3γ, Tff2, Dynlrb2, Lplunc1)及形態(tài)發(fā)生(Sox2)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)[14]。體外實驗證明,砷可改變?nèi)嗽夤苌掀ぜ?xì)胞(HBE)免疫球蛋白的表達(dá),降低肺上皮抵抗細(xì)菌感染的能力[15];砷還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化,促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。經(jīng)口攝入砷可對肺臟產(chǎn)生毒效應(yīng),但慢性暴露對肺結(jié)構(gòu)及功能的影響目前還少見報道。

現(xiàn)有研究認(rèn)為,砷攝入會破壞機(jī)體原有的氧化還原平衡,砷誘發(fā)的炎癥、疾病及機(jī)體功能紊亂大多與其誘導(dǎo)的活性氧(ROS)水平增高相關(guān)[17-18]。本實驗以小鼠為研究對象,檢測了長期飲水?dāng)z入砷后小鼠肺的氧化應(yīng)激、組織結(jié)構(gòu)及免疫相關(guān)基因表達(dá)水平,探討砷對肺臟的損傷效應(yīng),為揭示慢性飲水砷暴露對呼吸道的毒性作用機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物染毒及取材

模擬居民飲水砷污染,實驗動物采用自由飲用三價砷化物亞砷酸鈉(NaAsO2)水溶液的方式攝入砷。考慮到大部分實驗動物比人更耐受砷[19-20],同時結(jié)合課題組的前期研究,確定實驗組的染毒劑量(以砷計)為5 mg/L(略高于目前我國高砷暴露地區(qū)飲用水砷含量)或50 mg/L,對照組小鼠飲用蒸餾水。24只4周齡C57BL/6雄性小鼠(15±2 g,購于中國食品藥品檢定研究院),按體重隨機(jī)分為3組(n=8),標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)一周后開始染毒。實驗期間小鼠自由飲水,喂食山西醫(yī)科大學(xué)提供的全價營養(yǎng)顆粒飼料,連續(xù)染毒180 d。染毒結(jié)束禁食12 h后,1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠,稱重、解剖,迅速取出肺組織,預(yù)冷的PBS(pH 7.4)漂洗后,左大葉肺于4%中性甲醛中固定,其余的肺組織液氮冷凍后-80℃保存。

1.2 石蠟切片的制備

固定好的肺組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片,蘇木素-伊紅(H&E)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 組織氧化指標(biāo)測定

取100 mg左右凍存的肺組織,冰浴勻漿后3 500 r/min低溫離心15 min,取上清用于氧化指標(biāo)的測定。丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)測定均嚴(yán)格按試劑盒(南京建成)說明進(jìn)行,蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[21]。

1.4 總RNA提取及定量PCR(qPCR)

Trizol法提取肺組織總RNA,去除基因組DNA后,以oligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照qPCR試劑說明建立20 μL的反應(yīng)體系,每個樣本設(shè)兩個重復(fù)進(jìn)行基因擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法[22]計算基因的相對表達(dá)量。IFN-γ基因(NM_008337)引物序列為F-P:5′AGCAACAGCAAGGCGAAAA-3′;R-P:5′CTGGACCTGTGGGTTGTTGA-3′,其余基因引物序列參照文獻(xiàn)[23]。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),結(jié)果以Mean± SE表示。One-way ANOVA 法檢驗各組之間的差異顯著性。*P<0.05,**P<0.01表示處理組與對照組間的差異顯著;#P<0.05,##P<0.01表示50 mg/L As組與5 mg/L As組間的差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 染毒小鼠一般情況

根據(jù)飲水量和體重計算5 mg/L As組和50 mg/L As組小鼠的砷攝入量分別為0.82 mg/(kg·d)和4.82 mg/(kg·d)。整個實驗期間小鼠生長狀況良好,未出現(xiàn)死亡。與對照組相比,砷染毒后小鼠肺臟重量與體重的比值(臟體比)未發(fā)生顯著性變化。

圖1 砷暴露對小鼠肺組織T-SOD活性(A)、T-AOC(B)和MDA含量(C)的影響Fig.1 Effects of arsenic on T-SOD activity (A) T-AOC (B),and MDA content (C) in mouse lungs

注:A：對照組; B：5 mg/L As組; C：50 mg/L As組圖2 小鼠肺組織切片(×200,標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 Characteristics of the mouse lungs

2.2 砷對小鼠肺組織的氧化損傷效應(yīng)

小鼠飲用含砷水180 d后,肺組織T-SOD活性和T-AOC均顯著降低,50 mg/L As組小鼠肺MDA含量顯著增高(圖1),表明砷暴露抑制了活性氧清除酶T-SOD活性及組織總抗氧化能力,打破了肺組織細(xì)胞的氧化還原平衡,造成肺組織氧化損傷。

2.3 砷對小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

觀察肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡空間大,肺泡壁較薄(圖2A);5 mg/L As組小鼠的肺泡囊縮小,肺泡隔增厚,肺組織有炎性細(xì)胞浸潤(圖2B);50 mg/L As組小鼠肺泡囊普遍較小,肺泡隔明顯增厚,并伴有肺泡隔的斷裂和融合,炎性細(xì)胞明顯增多(圖2C)。結(jié)果表明,飲水砷暴露誘發(fā)了小鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)的損傷,且損傷具有劑量依賴性。

2.4 砷對小鼠肺IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響

IFN-γ是輔助性T細(xì)胞1(Th1)的標(biāo)志性細(xì)胞因子,作為強(qiáng)有力的巨噬細(xì)胞活化因子,可促進(jìn)炎癥的發(fā)生。與對照組相比,5 mg/L As組小鼠肺IFN-γ mRNA水平有增高趨勢,但未出現(xiàn)顯著差異,50 mg/L As組IFN-γ mRNA水平呈極顯著增高(圖3),表明一定水平的砷攝入可誘導(dǎo)肺組織中促炎細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)。此結(jié)果與肺組織結(jié)構(gòu)炎性損傷結(jié)果(圖2)一致。

圖3 砷暴露對小鼠肺組織IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Effects of arsenic on IFN-γ mRNA level in mouse lungs

2.5 砷對小鼠肺Th2細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄的影響

Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5及IL-13等細(xì)胞因子,其中IL-4是決定Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-4、IL-5和IL-13基因在5 mg/L As組表達(dá)水平無明顯改變,在50 mg/L As組均顯著降低(圖4A-C),說明高劑量砷能抑制肺組織中Th2細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。同期,IL-4/IFN-γ mRNA比值顯著下降(圖4D),提示砷暴露組小鼠肺組織出現(xiàn)了免疫失衡,表現(xiàn)為Th1反應(yīng)增強(qiáng),Th2反應(yīng)抑制。

圖4 砷暴露對小鼠肺組織IL-4,IL-5和IL-13基因轉(zhuǎn)錄及IL-4/IFN-γ值的影響Fig.4 Effects of arsenic on the mRNA levels ofTh2 cytokines and the ratio of IL-4/IFN-γ mRNA in mouse lungs

3 討論

高砷地下水廣泛存在于世界各地,通過飲水慢性攝入砷可誘導(dǎo)機(jī)體多個器官或組織損傷[5,18]。本研究表明,通過飲水?dāng)z入砷會造成小鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷及免疫失衡,砷對肺臟的毒效應(yīng)可能與砷暴露引發(fā)的細(xì)胞氧化損傷相關(guān)。

無機(jī)砷在細(xì)胞內(nèi)的甲基化代謝過程會產(chǎn)生大量ROS[18]。此外,砷對巰基(-SH)有很高的親和力,可以與含-SH的功能蛋白、酶及小分子化合物發(fā)生反應(yīng),干擾細(xì)胞的正常代謝,抑制多種抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)水平,最終導(dǎo)致ROS水平的增加[5]。ROS可攻擊細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂類和DNA等生物大分子,破壞分子結(jié)構(gòu),引起細(xì)胞生理功能紊亂,誘導(dǎo)疾病的發(fā)生。本研究砷組小鼠肺T-SOD活性及總抗氧化能力下降,說明砷攝入抑制了內(nèi)源性抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的活性,機(jī)體清除自由基的能力下降,使同期體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基不能及時清除,引發(fā)肺臟組織氧化損傷,MDA升高。已有研究表明,白藜蘆醇可通過提高機(jī)體抗氧化能力緩解砷攝入對大鼠肺組織的損傷[24]。因此,我們推測本研究砷暴露引起肺組織結(jié)構(gòu)的改變可能與其誘導(dǎo)的氧化損傷相關(guān)。

已有研究表明,高水平的ROS可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá),誘發(fā)炎癥[25]。本研究在小鼠飲用含砷水180 d后檢測到IFN-γ表達(dá)水平的升高,并觀察到肺組織中炎性細(xì)胞浸潤,表明砷攝入引發(fā)了小鼠肺臟的炎癥反應(yīng)。炎癥發(fā)生時往往會伴隨中性粒細(xì)胞的增多,而壞死的中性粒細(xì)胞會釋放蛋白溶解酶,破壞肺泡彈性纖維,導(dǎo)致肺泡彈性減弱,影響正常呼吸。砷染毒組小鼠肺臟組織中增厚的肺泡隔和縮小的肺泡囊會影響肺部氣體交換,導(dǎo)致肺功能下降。本實驗動物肺臟炎癥和病理性損傷與砷暴露人群中出現(xiàn)的呼吸急促、肺功能下降、慢性咳嗽、肺炎等癥狀一致。

輔助性T細(xì)胞亞群Th1和Th2的平衡在炎癥和免疫過程中發(fā)揮重要作用。Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫,介導(dǎo)細(xì)胞毒和局部炎癥相關(guān)的免疫應(yīng)答;Th2細(xì)胞可促進(jìn)IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)和體液免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制抑制Th1免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用,而Th2免疫反應(yīng)的減弱也會促進(jìn)Th1驅(qū)動的炎癥發(fā)生[26]。本研究小鼠飲水砷暴露180 d后,5 mg/L As組肺IL-4/IFN-γ mRNA比值顯著降低,50 mg/L As組IFN-γ mRNA水平極顯著增高,Th2細(xì)胞因子基因表達(dá)均顯著下調(diào),IL-4/IFN-γ mRNA比值極顯著降低,表明長期飲水?dāng)z入砷可引起小鼠肺組織Th1/Th2免疫失衡,表現(xiàn)為Th1炎癥反應(yīng)增加,Th2抗炎反應(yīng)減弱。已有文獻(xiàn)報道,昆明小鼠單次灌胃2.5-10 mg/kg NaAsO2水溶液,24 h后肺組織Th2優(yōu)勢應(yīng)答,抗炎反應(yīng)增強(qiáng);C57BL/6小鼠連續(xù)飲用100 mg/L NaAsO2水溶液90 d后,肺Th1和Th2細(xì)胞因子均被誘導(dǎo)表達(dá)[13]。上述文獻(xiàn)中急性和亞慢性砷暴露的肺免疫反應(yīng)與本研究結(jié)果不同,可能與所選小鼠的品系、染毒劑量及染毒時間不同有關(guān)[27]。

4 結(jié)論

長期經(jīng)口攝入一定劑量的砷可誘導(dǎo)小鼠肺氧化損傷,引起肺組織結(jié)構(gòu)改變和免疫失衡。低劑量砷攝入造成了輕微的肺組織病理損傷;攝入高劑量砷誘導(dǎo)了肺組織脂質(zhì)過氧化損傷和免疫失衡,Th1炎癥反應(yīng)加強(qiáng),小鼠肺組織損傷加重。