不同蛋白微射流噴霧干燥制備魚油微膠囊性能研究

李 楊 徐靜雯 于靜雯 郭增旺 滕 飛 王中江

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

0 引言

魚油是ω-3多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的良好來源，對(duì)各種疾病的預(yù)防和治療具有積極作用[1-4]。但是，由于魚油中不飽和脂肪酸的含量極高，易發(fā)生氧化，產(chǎn)生酸、醛、酮類以及各種氧化物等，并產(chǎn)生異味，降低了脂質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量[5]。微膠囊技術(shù)可使魚油與外界環(huán)境隔絕，進(jìn)而有效地保護(hù)不飽和脂肪酸不被氧化，并改善食品中ω-3脂肪酸的穩(wěn)定性和釋放性[6]。微膠囊特性易受乳液制備條件影響，因此對(duì)乳液穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用，魚油乳液粒徑越小，乳液均一性和穩(wěn)定性越好，微膠囊產(chǎn)品的包埋率越高[7]。與傳統(tǒng)高壓均質(zhì)技術(shù)相比，微射流技術(shù)壓力更高、碰撞能力更大、流體速度更快，乳化劑或表面活性物質(zhì)對(duì)油滴暴露出更多的疏水基團(tuán)或結(jié)合位點(diǎn)，制備出的乳液更穩(wěn)定、更均勻[8]。已有學(xué)者應(yīng)用微射流技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究[9-10]。

在微膠囊制備過程中，壁材的選擇對(duì)噴霧干燥生產(chǎn)微膠囊產(chǎn)品至關(guān)重要[11]。近年來，乳清蛋白(WPI)和大豆蛋白(SPI)被廣泛用作包埋油脂的壁材，這些蛋白具有良好的乳化特性和成膜性能，能在乳化過程中展開結(jié)構(gòu)、吸附到油水界面，形成阻止油滴合并的包裹層，以斥力作用穩(wěn)定所形成的乳液[12]。豌豆分離蛋白(PPI)與大豆蛋白相似，可作為微膠囊化的新型壁材[13]。文獻(xiàn)[14]用WPI和卵磷脂制備的微膠囊表現(xiàn)出良好的包埋率和再分散性。文獻(xiàn)[15]用大豆蛋白成功地包埋了魚油，研究了乳化過程和蛋白質(zhì)與油比率對(duì)微膠囊性質(zhì)和油脂穩(wěn)定性的影響。文獻(xiàn)[16]使用PPI作為乳化劑，與麥芽糊精一起包埋Miglyol 812N(一種中鏈甘油三酯)進(jìn)行了研究。單一壁材大多數(shù)很難制備出高包埋率的魚油微膠囊，因此實(shí)際應(yīng)用中往往根據(jù)壁材各自的物理化學(xué)特性，將兩種或兩種以上壁材進(jìn)行復(fù)配。麥芽糊精乳化性差，但因具有補(bǔ)充包埋、增強(qiáng)油脂抗氧化性等功能而常作為壁材填充劑[17]。卵磷脂作為一種天然的表面活性劑，具有兩親分子結(jié)構(gòu)，常被用作功能性乳化劑來改善食品乳狀液的乳化效果[18]。

本文用乳清分離蛋白、大豆分離蛋白、豌豆分離蛋白分別與麥芽糊精作為復(fù)合壁材，卵磷脂作為乳化劑包埋魚油，經(jīng)微射流處理后進(jìn)行噴霧干燥，以制備魚油微膠囊，對(duì)不同蛋白制備的微膠囊性能進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.6%)、魚油(含二十碳五烯酸8.48%、二十二碳六烯酸15.85%)，均購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；豌豆分離蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)82.1%)，西安維珍生物科技有限公司；乳清分離蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.1%)，鄭州明瑞化工產(chǎn)品有限公司；麥芽糊精，廣州成碩生化試劑有限公司；卵磷脂，上海源葉生物科技有限公司；SDS(十二烷基硫酸鈉)、石油醚、乙醇、無水乙醚、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra-Turrax T25型高速分散器，德國(guó)IKA公司；M-110EH30型高壓微射流均質(zhì)機(jī)，上海鯉躍精密機(jī)械貿(mào)易有限公司；BL-6000Y型噴霧干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)BRUKER公司；Pyris 1 TGA型熱重分析儀，美國(guó)PERKINELMER公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Bettersize2000型激光粒度分布儀，丹東市百特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1乳液和微膠囊的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改。將蛋白與麥芽糊精以質(zhì)量比3∶1溶于600 mL溫水中，固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.6%。同時(shí)使3 g卵磷脂完全溶于魚油中，蛋白與魚油料液比為3 g/mL，再將加入乳化劑的魚油倒入壁材溶液中進(jìn)行乳化處理。先經(jīng)高速分散機(jī)在12 000 r/min條件下高速乳化10 min后再用微射流40 MPa處理10 min，將乳化后的乳狀液用噴霧干燥法制成魚油微膠囊，進(jìn)口溫度為180℃，出口溫度為80℃，流速為6 mL/min。

1.3.2乳液粒徑

乳液顆粒大小分布采用激光粒度儀測(cè)定，以去離子水作為分散介質(zhì)，結(jié)果基于顆粒折射率1.450、顆粒吸收率0.001計(jì)算。

1.3.3乳化活性與乳化穩(wěn)定性測(cè)定

將復(fù)合壁材配制成0.02 g/mL溶液，取9 mL樣品與3 mL魚油混合，用高速分散機(jī)在10 000 r/min的條件下乳化1 min，然后從底部取50 μL乳狀液，立即加入5 mL 0.1% SDS溶液，混勻后在500 nm處測(cè)定其吸光度A0，以SDS溶液作空白對(duì)照[20]。從0 min開始每隔10 min測(cè)定一次吸光度At，共測(cè)6次。乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計(jì)算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，%

c——蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

V——稀釋倍數(shù)

θ——乳狀液中油相體積分?jǐn)?shù)，取25%

1.3.4微膠囊包埋率測(cè)定

微膠囊表面油含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]的方法。稱取1.5 g微膠囊粉末(質(zhì)量m)，加入30 mL沸程30～60℃石油醚輕微振蕩5 min，浸提后過濾。濾渣用15 mL石油醚洗滌后過濾。將濾液全部轉(zhuǎn)移至質(zhì)量恒定的圓底燒瓶(質(zhì)量m1)中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)石油醚，105℃干燥至質(zhì)量恒定(質(zhì)量m2)。表面油質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為

(3)

微膠囊總油含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]的方法。稱取1 g微膠囊粉末(質(zhì)量m3)，充分溶解于10 mL 60℃熱水中，冷卻至室溫(20℃)，加入1.25 mL氨水，65℃水浴5 min，冷卻后加入10 mL無水乙醇，振蕩1 min，再加入無水乙醚和石油醚各25 mL，振蕩1 min，4 800 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至質(zhì)量恒定的圓底燒瓶(質(zhì)量m4)中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)萃取液，105℃干燥至質(zhì)量恒定，置于干燥器中冷卻至室溫后稱量(質(zhì)量m5)。總油質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為

(4)

微膠囊包埋率計(jì)算公式為

(5)

1.3.5微觀結(jié)構(gòu)

將不同壁材的微膠囊粉末粘在有雙面膠的操作臺(tái)上，離子濺射鍍金，然后用掃描電子顯微鏡(SEM)在5 kV電壓下觀察微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.6紅外光譜

將樣品與KBr經(jīng)干燥處理后,稱取約5 mg樣品與200 mg KBr研磨均勻,然后壓片,測(cè)定傅里葉變換紅外光譜。掃描范圍4 000～500 cm-1,分辨率4 cm-1, 掃描次數(shù)32次。采用Peakfit 4.12軟件對(duì)譜圖酰胺Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)特征峰進(jìn)行分析。

1.3.7氧化穩(wěn)定性

將魚油微膠囊粉末放在棕色試劑瓶中，在60℃的密閉容器內(nèi)進(jìn)行加速氧化試驗(yàn)，每隔5 d測(cè)定樣品的過氧化值。

參照文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行過氧化值的測(cè)定。稱取樣品2～3 g(精確至0.001 g)置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液(體積比2∶3)，輕輕振搖使試樣完全溶解。加入1 mL飽和KI溶液，塞進(jìn)瓶塞，并輕輕振搖0.5 min，放置在暗處3 min。取出后加100 mL水，搖勻后立即用0.01 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色時(shí)，加1 mL 0.01 g/mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定并快速攪拌至溶液藍(lán)色消失為終點(diǎn)。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，并以SDS溶液作空白實(shí)驗(yàn)。過氧化值計(jì)算公式為

P=1 000(V2-V1)N/W

(6)

式中P——過氧化值，mmol/kg

V1——空白消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL

V2——樣品消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL

N——Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L

W——樣品質(zhì)量，g

1.3.8熱穩(wěn)定性

用Pyris 1 TGA型熱重分析儀分析不同壁材制備的魚油微膠囊間熱穩(wěn)定性差異。在氮?dú)饬?30 mL/min)下將樣品(5 mg)從30℃ 加熱至500℃(10℃/min)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 9.0軟件進(jìn)行制圖，采用軟件SPSS 22.0對(duì)3次平行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液粒徑

平均粒徑直接地反映出乳液中液滴的大小，液滴大小對(duì)乳液性質(zhì)有很大影響，PDI(聚合物分散性指數(shù))表征液滴分散情況，PDI越小，液滴分散性越好，體系越穩(wěn)定[23]。粒徑分布曲線中具有單峰分布以及峰較窄或峰下面積較小的乳液表示均勻且穩(wěn)定的乳液[24]。由圖1(圖中不同小寫字母表示差異顯著)可知，WPI制備的乳液平均粒徑和PDI顯著小于SPI和PPI乳液(P<0.05)。從圖1可以看出所有乳液粒徑分布曲線基本都呈單峰，說明3種蛋白均顯示出良好的乳化能力以形成細(xì)乳液。同時(shí)，乳液中液滴的尺寸越小，蛋白質(zhì)的乳化能力越高，說明WPI和PPI的乳化能力較好，而SPI的乳化能力較差。根據(jù)粒徑分布曲線可以看出，SPI和PPI乳液的平均粒徑較高主要是由于存在高度絮凝的油滴，其粒徑大于5 μm，文獻(xiàn)[25]也得出相同的結(jié)果，SPI乳液比其它菜豆分離蛋白穩(wěn)定的乳液具有更高的絮凝傾向。文獻(xiàn)[26]指出，WPI比SPI制備的乳狀液平均粒徑更小，體系穩(wěn)定性更優(yōu)。而在相似濃度下，PPI制備的乳液液滴比用SPI制備的乳液液滴更小，使得SPI成為較差的乳化劑[27]。

圖1 蛋白種類對(duì)魚油乳液平均粒徑、PDI和粒徑分布的影響

2.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性

在親脂性成分作為微膠囊芯材的情況下，包封材料具有良好的乳化性能是基本要求。乳化活性是蛋白質(zhì)吸附到界面能力的量度，而乳化穩(wěn)定性是測(cè)量在限定時(shí)間段內(nèi)吸附層的穩(wěn)定性。3種壁材的乳化活性和乳化穩(wěn)定性如圖2所示。3種壁材的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都隨著時(shí)間的增加而下降。從圖2中可以看出，WPI的乳化活性最好，PPI的乳化活性較SPI強(qiáng)一些(P<0.05)，與粒徑結(jié)果一致。在測(cè)定的50 min內(nèi)，WPI的乳化穩(wěn)定性顯著高于SPI和PPI(P<0.05)，對(duì)于SPI和PPI，20 min前PPI的乳化穩(wěn)定性下降趨勢(shì)較緩，30～40 min時(shí)SPI的表現(xiàn)更好(P<0.05)，50 min時(shí)兩者的乳化穩(wěn)定性無顯著差異(P>0.05)。蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)影響它們?cè)诮缑嫣幉煌瑯?gòu)象變化的吸附和適應(yīng)，乳清蛋白無序結(jié)構(gòu)含量高，分子柔性好，可在油水界面產(chǎn)生更好的構(gòu)象變化，表現(xiàn)出更高的乳化活性和穩(wěn)定性[20]。在低離子強(qiáng)度條件下，來自菜豆的7S球蛋白在pH值4.2～7.0下表現(xiàn)出比大豆更好的溶解性、乳化能力和乳化穩(wěn)定性[28]。文獻(xiàn)[29]也指出在較低的油濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10%)下，PPI通過提供更小的液滴，表現(xiàn)出比SPI更好的乳化能力。

圖2 不同壁材的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

2.3 包埋率

表面油含量和包埋率是判斷微膠囊質(zhì)量的重要指標(biāo)，有較高包埋率的微膠囊對(duì)魚油的保護(hù)作用較好，而表面油含量與包埋率呈負(fù)相關(guān)。不同蛋白制備的魚油微膠囊包埋率如表1所示。結(jié)果表明，WPI制備的魚油微膠囊包埋率最高(95.34%)，較SPI和PPI分別高出4.11、7.63個(gè)百分點(diǎn)(P<0.05)，且表面含油率最低(1.68%)，較SPI和PPI分別低1.11、1.87個(gè)百分點(diǎn)(P<0.05)。所以，以WPI為壁材的微膠囊包埋效果最好，SPI次之，PPI最差。結(jié)合圖3分析可能是因?yàn)镾PI和PPI顆粒表面有凹陷增大了表面積且存在少量孔洞導(dǎo)致對(duì)魚油的包埋效果不好。乳清蛋白的包埋率最高，可能與乳液粒徑有關(guān)。具有更小粒徑的原始乳液經(jīng)噴霧干燥后得到的粉末能包裹住更多的油，且粉末表面的游離油更少[30]。文獻(xiàn)[31]的研究結(jié)果表明，以豌豆分離蛋白和改性淀粉復(fù)合物比以合成乳化劑Tween 20和SDS制備的DHA微膠囊液滴尺寸小，顯示出更少的微膠囊表面油、更高的包埋率和更少的氧化。

表1 不同蛋白制備的魚油微膠囊性質(zhì)比較

注：同一列不同字母表示數(shù)值間有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 掃描電子顯微鏡

用3種蛋白制備的魚油微膠囊表面形態(tài)可以通過掃描電子顯微鏡觀察。從圖3中可以看出相同處理下，不同蛋白制成的魚油微膠囊在表面結(jié)構(gòu)和大小上存在一定的差異。圖3a和圖3c中顆粒表面都有明顯的凹陷，圖3b中大部分顆粒均呈球形，大小均一且表面凹陷較少。同時(shí)，用SPI和WPI制備的膠囊表面無孔洞，而用PPI制備的膠囊表面有少量孔洞。微膠囊表面的凹痕可能是由噴霧干燥過程中高溫使膠囊內(nèi)部的空氣膨脹引起內(nèi)外氣壓的不同，當(dāng)冷卻時(shí)壁材收縮所致[32]，是噴霧干燥法制備微膠囊的普遍特征。在高噴霧干燥速率下，干燥顆粒內(nèi)部空氣或蒸汽的熱膨脹可以平整凹痕，但也可能使囊膜破裂，導(dǎo)致孔洞的形成[33]。穩(wěn)定的乳液可以避免熱膨脹或機(jī)械力引起的破裂，乳液的穩(wěn)定性與粒徑直接相關(guān)，所以平均粒徑較小、粒徑分布較窄的WPI乳液穩(wěn)定性更好，形成的微膠囊顆粒更完整。但是，同一樣品中微膠囊顆粒大小也存在一定差異，這與乳液從高壓噴槍中噴出時(shí)的霧滴大小有直接關(guān)系[34]。文獻(xiàn)[24]的研究發(fā)現(xiàn)來自蕓豆、紅豆和綠豆3種分離蛋白的微膠囊化性質(zhì)比大豆分離蛋白差，盡管它們的乳化能力更優(yōu)，原因在于微膠囊化性質(zhì)主要與界面性質(zhì)有關(guān)，尤其是界面蛋白質(zhì)濃度。SPI在界面處有更好的吸附與較高量的吸附蛋白質(zhì)相關(guān)，并形成相對(duì)較好的粘彈性界面膜。

圖3 不同蛋白制備的魚油微膠囊表面形態(tài)

2.5 紅外光譜分析

圖5 酰胺Ⅰ帶的FTIR曲線和高斯曲線擬合圖譜

圖4 魚油微膠囊紅外光譜圖

表2 酰胺Ⅰ帶曲線擬合結(jié)果及譜帶指認(rèn)

注：同一行不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.6 氧化穩(wěn)定性

過氧化值是評(píng)價(jià)魚油氧化程度的重要指標(biāo)，在儲(chǔ)存期內(nèi)過氧化值的變化小說明壁材能夠有效地將魚油包埋，降低魚油被氧化的幾率。從圖6中可以看出，3種蛋白制備的魚油微膠囊過氧化值都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中以乳清蛋白為壁材的微膠囊表現(xiàn)出較好的氧化穩(wěn)定性，過氧化值的變化最小。WPI的主要成分是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，它們含有半胱氨酰殘基、二硫鍵和巰基官能團(tuán)，可以清除自由基以抑制脂質(zhì)氧化[41]。另外，顆粒表面的孔洞會(huì)增加微膠囊對(duì)環(huán)境氣體的通透性，降低芯材的抗氧化性，同時(shí)高含量表面油與空氣直接接觸也會(huì)加速氧化，所以SPI和PPI制成的微膠囊表面有凹陷或孔洞，表面油含量高，導(dǎo)致它們?cè)谘趸€(wěn)定性上的表現(xiàn)較WPI稍差。

圖6 魚油微膠囊氧化穩(wěn)定性

2.7 熱穩(wěn)定性

圖7 魚油微膠囊熱重曲線

通過熱重分析比較魚油微膠囊之間的熱穩(wěn)定性差異(圖7)。根據(jù)熱重曲線，膠囊的熱解過程大致可分為4個(gè)階段，首先是30～105℃，3類微膠囊的質(zhì)量損失率大約都為4%，這部分損失主要由微膠囊中自由水的蒸發(fā)導(dǎo)致；第2階段為105～200℃，該階段主要是結(jié)合水和揮發(fā)性分解物的損失，質(zhì)量損失率約為9%；第3階段為200～350℃，該階段失重明顯。溫度高于200℃時(shí)，壁材和魚油都開始分解失重[42]，化學(xué)鍵斷裂，產(chǎn)生CO2、H2O和CH4等中間產(chǎn)物，壁材被破壞，芯材加速釋放。由圖7可以看出，溫度達(dá)到320℃前，SPI和PPI為壁材的微膠囊質(zhì)量損失都小于WPI為壁材的微膠囊，繼續(xù)升溫，PPI制備的微膠囊質(zhì)量損失加快，超過WPI制備的微膠囊。在350℃時(shí)，3種微膠囊的質(zhì)量損失率分別為52%、58%和65%，其中SPI制備的微膠囊質(zhì)量損失最少，熱穩(wěn)定性最高。原因可能在于SPI在界面處有更好的吸附，形成的膜粘彈性更高，經(jīng)噴霧干燥后形成的膠囊結(jié)構(gòu)致密，高溫下水分蒸發(fā)后表面硬化，壁材的分解更難，所以熱穩(wěn)定性更好[43]。第4階段為350～500℃，隨著溫度的升高，中間產(chǎn)物進(jìn)一步完全裂解并碳化。在200℃以下，魚油微膠囊的質(zhì)量損失很少，說明具有良好的熱穩(wěn)定性，能滿足一般食品的加工條件。

3 結(jié)束語(yǔ)

以乳清分離蛋白、大豆分離蛋白和豌豆分離蛋白分別與麥芽糊精作為復(fù)合壁材，卵磷脂作為乳化劑，將微射流處理后的水包油乳液進(jìn)行噴霧干燥以制備魚油微膠囊。對(duì)3種微膠囊的性能進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：乳液粒徑從大到小依次為SPI、PPI、WPI，乳化性質(zhì)從優(yōu)到劣依次為WPI、PPI、SPI；在3種微膠囊中，WPI為壁材的微膠囊包埋率最高、氧化穩(wěn)定性最好；WPI制備的微膠囊微觀結(jié)構(gòu)呈球形，表面較為完整，SPI和PPI制備的微膠囊表面存在凹陷和少量孔洞，導(dǎo)致包埋效果不好；WPI的α-螺旋和無序結(jié)構(gòu)含量高，更有利于包埋；溫度在200℃以下，3種魚油微膠囊都具有良好的熱穩(wěn)定性，能滿足一般食品的加工條件，其中SPI制備的微膠囊熱穩(wěn)定性最高。因此，除熱穩(wěn)定性外，用乳清分離蛋白制備魚油微膠囊性質(zhì)要優(yōu)于其他兩種蛋白。