鎘脅迫下菊苣葉片原位高光譜響應(yīng)特征與定量監(jiān)測(cè)研究

李嵐?jié)?申鳳敏 馬文連 樊 婕 李亞蓉 柳海濤

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450002)

0 引言

鎘(Cadmium，Cd)是作物非必需、但毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，具有很高的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)和較強(qiáng)的水溶性，極易通過(guò)作物吸收而進(jìn)入人體，不僅影響環(huán)境安全，同時(shí)也會(huì)危害人類健康[1-3]。因此，快速和精準(zhǔn)識(shí)別作物鎘脅迫程度及范圍，對(duì)于降低和控制鎘污染、制定安全有效防控措施具有重要意義[4]。目前，傳統(tǒng)的作物鎘脅迫監(jiān)測(cè)主要以田間樣品采集、實(shí)驗(yàn)室測(cè)試化驗(yàn)為主，該方法雖然可以獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果，但在分析過(guò)程中存在工作量大、操作繁瑣、周期長(zhǎng)和成本高等問(wèn)題，監(jiān)測(cè)結(jié)果具有一定的滯后性，限制了其發(fā)展應(yīng)用[5-6]。近年來(lái)，隨著高光譜遙感技術(shù)的發(fā)展，利用鎘脅迫作物與正常生長(zhǎng)作物在光譜維上的差異性開展無(wú)損、高效和原位監(jiān)測(cè)成為一種可能，并得以快速應(yīng)用和發(fā)展。

當(dāng)作物受到鎘脅迫時(shí)，宏觀上易造成植物葉片枯萎變黃，新生葉生長(zhǎng)緩慢，植株長(zhǎng)勢(shì)瘦弱，生物量、葉面積與光合色素等指標(biāo)顯著降低；微觀上則表現(xiàn)出葉片變薄，細(xì)胞滲透壓降低，生理代謝紊亂，葉肉海綿組織和柵欄組織排列緊密，胞間隙減小等[5,7-8]。上述癥狀均會(huì)明顯影響葉片對(duì)光的吸收與反射性能，改變光在植物體內(nèi)反射與折射路徑，繼而產(chǎn)生不同的光譜反射率，形成反射率不同的光譜曲線，并且上述特征波長(zhǎng)光譜反射率變化對(duì)鎘脅迫程度的響應(yīng)十分敏感，這也是利用葉片原位高光譜開展作物鎘脅迫定量監(jiān)測(cè)的營(yíng)養(yǎng)及生理生化基礎(chǔ)[9]。

目前，高光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物重金屬脅迫監(jiān)測(cè)方面。關(guān)麗等[10]通過(guò)分析鎘脅迫水稻生理生化參數(shù)(色素、水分、LAI、鎘濃度等)與高光譜響應(yīng)特征間定量關(guān)系，確立了鎘脅迫診斷的植被指數(shù)和定量監(jiān)測(cè)模型。RATHOD等[11]研究認(rèn)為，不同鎘脅迫下大麥葉片高光譜反射率具有明顯的差異性，利用葉片原位高光譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)作物鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)的精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)。ABDEL-RAHMAN等[12]利用偏最小二乘回歸模型(PLS)定量監(jiān)測(cè)了瑞士甜菜葉片鎘含量，獲得了較好的預(yù)測(cè)效果。另有一些研究通過(guò)分析鎘脅迫下作物葉綠素、水分等生理生化指標(biāo)變化，并量化其與高光譜間關(guān)系，從側(cè)面驗(yàn)證高光譜技術(shù)在作物鎘脅迫監(jiān)測(cè)上的適宜性及可行性[3, 13-14]。分析發(fā)現(xiàn)，已有利用高光譜技術(shù)開展作物鎘脅迫的監(jiān)測(cè)研究大都集中于構(gòu)建植被指數(shù)、生化指標(biāo)反演和明晰光譜響應(yīng)關(guān)系等，且主要以糧食和經(jīng)濟(jì)作物為主，而系統(tǒng)探究不同鎘脅迫下菊苣葉片原位高光譜變化規(guī)律，篩選能穩(wěn)定指示葉片鎘質(zhì)量比變化有效波段，并構(gòu)建定量監(jiān)測(cè)模型的研究仍相對(duì)較少?；诖耍疚囊跃湛凭哲膶僖荒昊蚨嗄晟荼局参?、具有多種用途(可作為高檔蔬菜、新型優(yōu)質(zhì)牧草、香料和藥材等)并對(duì)重金屬具有較強(qiáng)吸收特性的菊苣為供試材料，通過(guò)設(shè)置不同品種及鎘濃度脅迫水培實(shí)驗(yàn)，探究其與葉片原位高光譜間定量關(guān)系，篩選能穩(wěn)定指示鎘濃度變化的有效波段，并構(gòu)建高魯棒性的監(jiān)測(cè)模型，以期為作物鎘脅迫的早期快速、無(wú)損和原位監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)參考和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菊苣(CichoriumintybusL.)品種分別為“歐洲菊苣”、“美洲菊苣”和“黔育一號(hào)”，其中，“歐洲菊苣”與“美洲菊苣”購(gòu)自北京百綠種業(yè)有限公司，“黔育一號(hào)”由貴州省草業(yè)研究所提供，均為市場(chǎng)上常見和廣泛種植的代表品種。菊苣培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)液采用Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液[15]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

水培實(shí)驗(yàn)于2018年12月至2019年3月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院水培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選取籽粒飽滿、大小均一的上述3個(gè)品種菊苣種子，先后分別用15% H2O2浸泡15 min，再用蒸餾水完全洗凈后放入30℃左右的溫水中浸泡20 min，而后均勻放入裝有少量水的專用育苗盤內(nèi)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)72 h后轉(zhuǎn)入人工氣候室。待菊苣長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的菊苣幼苗移到1/8 Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液的黑色塑料盒中(25 cm×17 cm×8 cm)進(jìn)行培養(yǎng)。塑料盒上蓋有帶均勻小圓孔的黑色泡沫塑料板，將菊苣幼苗用海綿固定于小圓孔內(nèi)。每間隔3 d，隨菊苣幼苗長(zhǎng)勢(shì)增大，逐步將營(yíng)養(yǎng)液濃度調(diào)整為1/4、1/2和全量Hoagland’s濃度。水培試驗(yàn)均在人工氣候室進(jìn)行，晝夜時(shí)間16 h/8 h，晝夜溫度為25℃/20℃，相對(duì)濕度為60%～70%。

菊苣幼苗在營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)12 d后，開始澆灌添加不同濃度鎘(0、5、10、25、50、100、200 μmol/L，鎘以CdCl2形式添加)的Hoagland’s完全培養(yǎng)液，使鎘脅迫程度為低(5、10 μmol/L)、中(25、50 μmol/L)、高(100 μmol/L)和嚴(yán)重(200 μmol/L)4個(gè)等級(jí)。每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)控制營(yíng)養(yǎng)液的pH值在6.0左右(圖1)。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，共計(jì)105盆。此外，于菊苣生長(zhǎng)期間每2 d隨機(jī)調(diào)整水培盒的位置，降低實(shí)驗(yàn)誤差。

圖1 不同鎘脅迫下菊苣生長(zhǎng)照片

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1菊苣葉片原位高光譜

分別于菊苣六葉期(2019年1月20日)和十葉期(2019年2月3日)，采用美國(guó)ASD(Analytical spectral devices)公司生產(chǎn)的FieldSpec Pro FR型便攜式高光譜儀，沿菊苣主莖自上而下，測(cè)定不同鎘濃度脅迫下第4片完全展開葉中部葉片光譜反射率。該儀器測(cè)量波段范圍為350～2 500 nm，350～1 000 nm光譜分辨率與采樣間隔分別為3 nm和1.4 nm，1 000～2 500 nm分別為10 nm和2 nm。測(cè)試時(shí)，利用光譜儀自帶葉片夾將葉片夾持固定，采用光譜探頭測(cè)定葉片光譜反射率。每個(gè)重復(fù)測(cè)試4株葉片光譜，每株采集10條光譜曲線，將4株葉片光譜數(shù)據(jù)取平均后作為該重復(fù)的葉片光譜反射率。為提高光譜監(jiān)測(cè)精度，增強(qiáng)光譜信噪比，綜合兩次光譜測(cè)試結(jié)果，刪除350～400 nm和2 400～2 500 nm受噪聲影響較大的波段，剔除后共有2 001個(gè)有效波段數(shù)據(jù)。

1.3.2菊苣葉片鎘質(zhì)量比

上述葉片光譜測(cè)試結(jié)束后，將菊苣葉片從水培盒中取出并依次用自來(lái)水和高純水洗滌、擦凈，剪除根部。而后將葉片置于105℃干燥箱中殺青30 min，70℃干燥至質(zhì)量恒定。用剪刀將樣品剪碎，稱取0.20 g置于消煮管中，采用HNO3-HClO4(體積比3∶1)消化法制備待測(cè)液，原子吸收分光光度計(jì)(AAS，ZEEnit70d0，Analytikjena，德國(guó))測(cè)定葉片鎘質(zhì)量比(mg/kg)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1建模集與驗(yàn)證集劃分

綜合分析菊苣品種的代表性及穩(wěn)定性，同時(shí)考慮到數(shù)據(jù)變化范圍與模型構(gòu)建的穩(wěn)定性和普適性，將本實(shí)驗(yàn)所獲取210個(gè)樣本數(shù)(3個(gè)菊苣品種、7個(gè)鎘脅迫處理、5次重復(fù)和2次生育期數(shù)據(jù)采集)按2∶1劃分為建模集和驗(yàn)證集兩部分，計(jì)算分析兩數(shù)集平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV，%)。其中，“歐洲菊苣”和“黔育一號(hào)”兩品種實(shí)驗(yàn)所采集數(shù)據(jù)用于構(gòu)建光譜監(jiān)測(cè)模型(n=140)，“美洲菊苣”實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)則為驗(yàn)證集(n=70)。

此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證上述所構(gòu)建模型的魯棒性，明確鎘脅迫下菊苣葉片光譜響應(yīng)特征及建立精準(zhǔn)度較高的光譜監(jiān)測(cè)模型。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用同樣水培裝置及方法，于2019年3月再次布置9個(gè)菊苣品種獨(dú)立驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(普那、歐洲、美洲、黔育一號(hào)、將軍、香檳、益豐、闊葉和奧利維亞菊苣)，鎘脅迫濃度設(shè)為50 μmol/L，5次重復(fù)，分別于六葉期和十葉期沿菊苣主莖自上而下測(cè)試第4片完全展開葉片光譜反射率和鎘質(zhì)量比，以檢驗(yàn)前期所構(gòu)建模型的準(zhǔn)確性能(n=90)。

1.4.2一階微分光譜變換

對(duì)原始光譜(R)進(jìn)行變換是降低環(huán)境噪聲干擾，提高光譜信噪比和光譜監(jiān)測(cè)精度的有效措施。一階微分(First derivative reflectance, FDR)光譜是目前應(yīng)用十分廣泛且行之有效的光譜變換方法。研究表明，作物葉片原始光譜(R)經(jīng)FDR變換后可有效降低基線或其它環(huán)境背景干擾，弱化混合重疊峰，增強(qiáng)特征波段信息強(qiáng)度與分辨率，提高光譜診斷靈敏度[16]。此外，F(xiàn)DR光譜還可有效消除部分線性或接近線性的噪聲光譜對(duì)目標(biāo)光譜的影響，提高光譜監(jiān)測(cè)識(shí)別度，其反射率計(jì)算公式為[17]

(1)

式中λi——波段i波長(zhǎng)，nm

R′(λi)——一階微分光譜反射率

Δλ——波長(zhǎng)λi+3到λi-2的間隔

本實(shí)驗(yàn)利用Matlab R2012a軟件對(duì)所獲取菊苣葉片原始光譜(R)進(jìn)行FDR變換，光譜間隔設(shè)置為5。

1.4.3模型構(gòu)建與應(yīng)用

為有效分析菊苣葉片鎘質(zhì)量比與其原位高光譜反射率間定量關(guān)系，明確不同鎘濃度脅迫下光譜響應(yīng)特征并構(gòu)建定量監(jiān)測(cè)模型，本研究首先以菊苣葉片原始光譜(R)和FDR光譜為自變量，以鎘質(zhì)量比為因變量，分別采用逐步回歸(Stepwise regression，SWR)、主成分回歸(Principal component regression，PCR)和偏最小二乘回歸(Partial least square，PLS)統(tǒng)計(jì)方法研究?jī)烧唛g關(guān)系，確定最佳監(jiān)測(cè)模型。

SWR分析目前應(yīng)用較多并可有效解決自變量間存在的多重共線性問(wèn)題，其公式為

Yi=β1+β2X2i+β3X3i+…+βnXni

(2)

式中β1，β2，…，βn為回歸系數(shù)；X2i，X3i，…，Xni為回歸分析自變量。SWR主要思想是對(duì)每個(gè)逐步引入的自變量進(jìn)行F檢驗(yàn)，并對(duì)已引入自變量進(jìn)行t檢驗(yàn)，當(dāng)已引入自變量由于新變量的引入而變得不顯著時(shí)，則將引入變量剔除。

PCR分析則從海量高光譜數(shù)據(jù)中尋求對(duì)應(yīng)變量影響較大的主控因子并構(gòu)建定量回歸方程，回歸方程公式同SWR。主成分分析中，首先將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣；其后求取相關(guān)矩陣的特征根、特征向量和方差貢獻(xiàn)率，確定主成分?jǐn)?shù)；而后使用主成分替代原始變量再次進(jìn)行多元回歸，公式為Yk=α1+α2X2k+α3X3k+…+αnXnk；最后將原始變量代入建立主成分回歸模型并進(jìn)行系統(tǒng)分析。

PLS分析是一種新型的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，可以有效處理自變量個(gè)數(shù)(波段數(shù))遠(yuǎn)大于因變量(如鎘質(zhì)量比)且自變量間具有高度多重共線性的高光譜數(shù)據(jù)。PLS集典型相關(guān)分析、主成分分析和多元線性回歸分析為一體，不僅可以降低光譜分析維數(shù)，同時(shí)又可從高維光譜數(shù)據(jù)中找到影響因變量(鎘質(zhì)量比)的主控因子，使所構(gòu)建模型具有更高的魯棒性。

模型預(yù)測(cè)精準(zhǔn)性采用實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和相對(duì)分析誤差(RPD)來(lái)表征。其中，R2表示模型擬合度，其值越高模型越穩(wěn)定；RMSE表示模型精確度，值越小則模型預(yù)測(cè)能力越高；RPD則是表征光譜監(jiān)測(cè)模型通用性高低的關(guān)鍵指標(biāo)，RPD小于1.4表示模型不可用，RPD為1.4～2.0可用，RPD大于2.0則表示模型精準(zhǔn)度較高，通用性能好[18]。

1.4.4有效波段選取與應(yīng)用

在確定最佳光譜監(jiān)測(cè)模型基礎(chǔ)上，從海量高維高光譜數(shù)據(jù)中篩選出能有效表征菊苣葉片鎘質(zhì)量比時(shí)空變化特征的有效波段或重要波段，對(duì)降低光譜分析維度，增強(qiáng)光譜監(jiān)測(cè)時(shí)效性和準(zhǔn)確度均具有重要意義。本文利用PLS分析模型中的無(wú)量綱評(píng)估指標(biāo)：變量重要性投影值(Variable important in projection，VIP)從全波段(400～2 400 nm)光譜范圍內(nèi)優(yōu)選出菊苣葉片鎘質(zhì)量比的有效波段。VIP值可定量、快速和直觀地反映出各個(gè)波段在預(yù)測(cè)因變量時(shí)的重要程度，其臨界值為1.0，VIP越高，表示該波段預(yù)測(cè)性能越強(qiáng)。此外，在確定有效波段時(shí)還應(yīng)遵循以下2個(gè)原則：所篩選有效波段應(yīng)符合作物光譜營(yíng)養(yǎng)學(xué)監(jiān)測(cè)基本原理，即鎘脅迫影響菊苣葉片物質(zhì)和結(jié)構(gòu)等生理生化指標(biāo)變化，繼而影響光譜吸收與反射性能；基于有效波段構(gòu)建的監(jiān)測(cè)模型與全波段反演模型相比其精準(zhǔn)度不應(yīng)差別過(guò)大。

同時(shí)，為深入評(píng)估所確定有效波段的魯棒性及普適性，首先利用驗(yàn)證集數(shù)據(jù)對(duì)基于有效波段構(gòu)建的模型進(jìn)行精準(zhǔn)度檢驗(yàn)，同時(shí)采用9個(gè)品種獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行再驗(yàn)證，并繪制1∶1比例圖。

利用Excel 2007進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)輸入和分析；Matlab R2012a軟件將所測(cè)葉片光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理并進(jìn)行模型的定量評(píng)估與有效波段選擇(SWR、PCR和PLS)；采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對(duì)苗期菊苣葉片鎘質(zhì)量比的影響

不同生育期菊苣葉片鎘質(zhì)量比隨鎘脅迫程度增加而迅速提高，該結(jié)果在3個(gè)品種間變化趨勢(shì)相一致，表明外源鎘的添加可顯著影響菊苣對(duì)鎘的吸收與積累特性(圖2，圖中同一生長(zhǎng)期的不同字母表示各質(zhì)量比間差異顯著)。對(duì)于建模集數(shù)據(jù)，其葉片鎘質(zhì)量比變化范圍為15.6～1 802.7 mg/kg，平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分別為437.2 mg/kg、460.7 mg/kg和105.4%，驗(yàn)證集數(shù)據(jù)上述4個(gè)指標(biāo)分別為18.4～1 702.5 mg/kg、476.9 mg/kg、536.1 mg/kg和112.4%。該結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證集菊苣葉片鎘質(zhì)量比數(shù)據(jù)變幅均位于建模集內(nèi)，且無(wú)論建模集亦或驗(yàn)證集，其變異系數(shù)均大于100%，表明兩數(shù)集均具有較高的離散度和變異性，其所表征的菊苣鎘質(zhì)量比具有較高的指示范圍，可反映目前條件下菊苣葉片鎘質(zhì)量比的整體變幅。因此，本實(shí)驗(yàn)將“歐洲菊苣”和“黔育一號(hào)”數(shù)據(jù)用于模型構(gòu)建“美洲菊苣”作為獨(dú)立實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證集具有較高的可行性和普適性，為構(gòu)建高穩(wěn)定性的光譜監(jiān)測(cè)模型奠定了良好基礎(chǔ)。此外，變異系數(shù)高于100%則說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所采集數(shù)據(jù)具有強(qiáng)烈的變異性、數(shù)據(jù)代表性和覆蓋能力，同時(shí)也顯示菊苣對(duì)鎘具有很高的吸收與富集能力，為篩選對(duì)鎘響應(yīng)敏感并具有高吸收與高積累特性的“新物種”和基于葉片原位高光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速、無(wú)損監(jiān)測(cè)提供了參考。

圖2 不同鎘脅迫下苗期菊苣葉片鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)變化

2.2 鎘脅迫對(duì)苗期菊苣葉片高光譜變化的影響及其與鎘質(zhì)量比相關(guān)性分析

以建模集數(shù)據(jù)分析為例，闡釋鎘脅迫對(duì)菊苣葉片原位高光譜反射率變化特性的影響(圖3a、3b)及其與葉片鎘質(zhì)量比間定量相關(guān)關(guān)系(圖3c、3d)。結(jié)果表明，不同鎘濃度脅迫下菊苣葉片光譜反射率具有明顯的綠色植被光譜特征，即400～600 nm具有中等反射值，反射率在0.05～0.15之間；550 nm附近呈現(xiàn)葉綠素強(qiáng)吸收峰，680 nm附近具有一個(gè)較低的反射谷；800～1 300 nm進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期，反射率高達(dá)0.50～0.60；1 300～2 500 nm則是水分的強(qiáng)吸收區(qū)，反射率變幅較大，為0.05～0.25(圖3a、3b)?？梢姽鈪^(qū)(400～715 nm)，隨鎘脅迫程度增加，葉片光譜反射率呈下降趨勢(shì)；近紅外區(qū)(715～1 300 nm)低鎘濃度脅迫時(shí)(0～5 μmol/L)葉片反射率相對(duì)較高，中高脅迫(10～100 μmol/l)反射率雖有差異但相對(duì)集中，嚴(yán)重脅迫時(shí)(200 μmol/L)葉片反射率則最低；中紅外區(qū)(1 300～2 400 nm)不同鎘濃度脅迫間葉片光譜反射率未表現(xiàn)出較為一致性變化規(guī)律。

此后，采用相關(guān)性分析的方法將建模集全波段(400～2 400 nm)原始光譜(R)和FDR光譜反射率與葉片鎘質(zhì)量比進(jìn)行定量相關(guān)分析(n=140)并繪制決定系數(shù)曲線(R2)(圖3c、3d)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于原始光譜(R)，不同波段范圍間其決定系數(shù)變異較大，可見光區(qū)平均決定系數(shù)為0.286，達(dá)99%顯著性水平，最大值為0.347，位于670 nm紅光附近。此外，紅(640～715 nm)、橙(640～610 nm)、黃(610～530 nm)、綠(505～525 nm)、藍(lán)(505～470 nm)和紫(470～400 nm)光區(qū)平均決定系數(shù)分別為0.293、0.301、0.229、0.308、0.335和0.307。近紅外區(qū)決定系數(shù)則進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期，平均決定系數(shù)為0.548，波段間差異不大；中紅外區(qū)決定系數(shù)則呈現(xiàn)跳躍式變化特征，平均值為0.137，相對(duì)較低。相比于原始光譜(R)，F(xiàn)DR光譜與葉片鎘質(zhì)量比間相關(guān)性整體具有較大的提高，但不同波段范圍間差異較大，跳躍性則更為顯著，分別在717、954、1 026、1 091、1 291、1 629、1 750 nm處出現(xiàn)峰值。該結(jié)果為后續(xù)篩選能穩(wěn)定反映葉片鎘質(zhì)量比變化特征的有效波段提供了較好的數(shù)據(jù)支撐。

圖3 不同鎘脅迫下菊苣葉片原位高光譜反射率變化特征及其與鎘質(zhì)量比相關(guān)性分析

2.3 基于葉片原位高光譜的鎘質(zhì)量比光譜監(jiān)測(cè)模型構(gòu)建

為進(jìn)一步探究菊苣葉片高光譜與其鎘濃度間定量回歸關(guān)系，構(gòu)建定量反演模型，實(shí)現(xiàn)光譜監(jiān)測(cè)的定量化。在相關(guān)性分析基礎(chǔ)上，以葉片原始光譜(R)和FDR光譜為自變量，鎘濃度為因變量，分別采用逐步回歸(SWR)、主成分回歸(PCR)和偏最小二乘回歸(PLS)的整體光譜分析技術(shù)定量表征兩者間關(guān)系(表1)。結(jié)果表明，與葉片原始光譜(R)光譜相比，對(duì)光譜進(jìn)行一階微分變換后(FDR)對(duì)葉片鎘質(zhì)量比預(yù)測(cè)性能明顯提高。對(duì)于建模集，SWR、PCR和PLS 3種模型采用光譜(R)的RPD分別為2.51、3.45和4.03，雖然預(yù)測(cè)性能均較理想，但與FDR光譜相比，RPD值仍分別降低23.7%、6.8%和63.2%；驗(yàn)證集原始光譜(R)采用SWR模型RPD僅為0.82，穩(wěn)定性較差，PCR和PLS的RPD也僅在2.0左右，與FDR 3種光譜預(yù)測(cè)模型RPD值的1.66、2.54和2.96相比，表現(xiàn)出較大的差異性。不同光譜預(yù)測(cè)模型間，無(wú)論原始光譜(R)亦或FDR光譜，建模集亦或驗(yàn)證集，其變化趨勢(shì)均由小到大表現(xiàn)為SWR、PCR、PLS，如對(duì)于FDR-PLS菊苣葉片鎘質(zhì)量比光譜監(jiān)測(cè)模型，建模集和驗(yàn)證集決定系數(shù)(R2)分別高達(dá)0.99、0.92，相對(duì)分析誤差(RPD)則分別為10.95、2.96。綜上，本文采用基于FDR-PLS的光譜定量監(jiān)測(cè)模型來(lái)深入分析菊苣葉片鎘質(zhì)量比與其光譜反射率間關(guān)系，揭示指示鎘質(zhì)量比時(shí)空變化的穩(wěn)定特征波段，實(shí)現(xiàn)光譜鎘脅迫監(jiān)測(cè)的便捷化和無(wú)損化。

2.4 基于FDR-PLS監(jiān)測(cè)模型的葉片鎘質(zhì)量比特征波段確定

2.4.1主成分因子權(quán)重分析

在確定FDR-PLS光譜診斷模型來(lái)定量監(jiān)測(cè)菊苣葉片鎘質(zhì)量比后，明晰該模型中各波段權(quán)重或載荷效應(yīng)對(duì)有效明確不同自變量(X，400～2 400 nm光譜反射率)對(duì)因變量(Y，葉片鎘質(zhì)量比)總體潛在影響的重要性，闡明不同X對(duì)Y總體潛在影響比重，對(duì)快速篩選出葉片鎘質(zhì)量比的有效波段具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中，基于FDR-PLS的光譜監(jiān)測(cè)模型中主成分1和主成分2(PC1和PC2)可有效解釋光譜自變量和葉片鎘質(zhì)量比因變量的信息61.3%與61.5%，其不同鎘脅迫對(duì)菊苣葉片鎘質(zhì)量比影響的效應(yīng)載荷和權(quán)重如圖4所示。對(duì)于PC1，各波段權(quán)重絕對(duì)值較高的波長(zhǎng)分別位于659、717、954、1 026、1 093、1 234、1 295、1 630、1 745、1 845 nm，PC2則分別為503、604、659、979、1 026、1 075、1 255、1 405、1 943 nm，兩者出現(xiàn)較多的波段重合或鄰近。

表1 基于原初和一階微分光譜的菊苣葉片鎘質(zhì)量比高光譜不同監(jiān)測(cè)模型對(duì)比分析

圖4 基于FDR-PLS的菊苣葉片鎘質(zhì)量比監(jiān)測(cè)模型主成分1與主成分2各波長(zhǎng)權(quán)重

2.4.2基于FDR-PLS分析的葉片鎘質(zhì)量比有效波段確定

明確了菊苣葉片鎘質(zhì)量比最優(yōu)光譜監(jiān)測(cè)模型(FDR-PLS)和各波段權(quán)重之后，為進(jìn)一步篩選菊苣葉片鎘質(zhì)量比快速反演的有效波段，降低光譜診斷復(fù)雜度，提高光譜分析便捷性和時(shí)效性，采用PLS模型中的定量評(píng)價(jià)指標(biāo)：變量重要性投影值(VIP)的研究方法，分別計(jì)算全光譜中(400～2 400 nm)各波段對(duì)菊苣葉片鎘質(zhì)量比影響大小的VIP值(圖5)。VIP臨界值通常為1.0，本研究中由于高于1.0的特征波段較多且十分集中，難以有效區(qū)分和篩選，因此以VIP取2.5為菊苣葉片鎘質(zhì)量比有效波段選取的臨界值?；诖?，確定菊苣葉片鎘質(zhì)量比有效波長(zhǎng)分別為659(紅光)、725(紅邊)、907、1 026、1 112、1 255(近紅外)、1 630 nm(中紅外)，該結(jié)果與上述主成分因子效應(yīng)載荷分析PC1和PC2中各波段權(quán)重絕對(duì)值較大的特征波段相吻合，進(jìn)一步說(shuō)明本有效波段選擇的可靠性與穩(wěn)定性，同時(shí)也為作物鎘脅迫的快速和精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)參考和理論依據(jù)。

圖5 基于FDR-PLS監(jiān)測(cè)模型的菊苣葉片鎘質(zhì)量比有效波段確定

2.5 基于有效波段的模型驗(yàn)證

2.5.1獨(dú)立驗(yàn)證集驗(yàn)證

基于VIP分析方法確定菊苣葉片鎘質(zhì)量比有效波段，使光譜監(jiān)測(cè)波段維數(shù)由2 401個(gè)減為7個(gè)，極大降低了光譜分析的復(fù)雜性。為進(jìn)一步檢驗(yàn)基于上述有效波段所構(gòu)建FDR-PLS模型在預(yù)測(cè)鎘質(zhì)量比時(shí)的準(zhǔn)確度，利用“美洲菊苣”獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)上述模型進(jìn)行再次驗(yàn)證，以R2、RMSE和RPD來(lái)綜合評(píng)價(jià)模型的魯棒性，并繪制1∶1比例圖來(lái)直觀展示新FDR-PLS模型的精準(zhǔn)性(圖6)。與全波段FDR-PLS光譜監(jiān)測(cè)模型相比，采用降維后基于有效波段新構(gòu)建FDR-PLS模型預(yù)測(cè)性能雖有所降低，但仍具有較強(qiáng)的精準(zhǔn)度，建模集和驗(yàn)證集決定系數(shù)分別為0.868與0.834，相對(duì)分析誤差(RPD)則分別為2.74和2.41，符合模型穩(wěn)定監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)及需求。該結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所采用光譜分析技術(shù)和優(yōu)選有效波段是可行和可靠的，具有很強(qiáng)的代表性與應(yīng)用性。

圖6 基于有效波段的菊苣葉片鎘質(zhì)量比獨(dú)立驗(yàn)證集實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途闰?yàn)證

2.5.2不同菊苣品種實(shí)驗(yàn)再驗(yàn)證

圖7 基于有效波段的菊苣葉片鎘質(zhì)量比不同菊苣品種實(shí)驗(yàn)集模型精度驗(yàn)證

在上述驗(yàn)證基礎(chǔ)上，再次采用目前市場(chǎng)上常見的9個(gè)菊苣品種在50 μmol/L鎘脅迫時(shí)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步檢驗(yàn)基于有效波段所構(gòu)建FDR-PLS模型在預(yù)測(cè)鎘質(zhì)量比時(shí)的穩(wěn)定性(圖7)。結(jié)果表明，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證集R2、RMSE、RPD分別為0.817、13.0 mg/kg、1.77，生物學(xué)意義為基于有效波段新構(gòu)建FDR-PLS模型的實(shí)測(cè)鎘質(zhì)量比可以解釋81.7%的預(yù)測(cè)集，其誤差為13.0 mg/kg，效果較為理想，滿足模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度需求。但同時(shí)也應(yīng)看到，驗(yàn)證集RPD為1.77，位于1.40～2.0范圍，表示模型的精確性符合“可接受”范疇但仍有進(jìn)一步提高空間。綜上分析，本實(shí)驗(yàn)所確定菊苣葉片光譜定量監(jiān)測(cè)模型(FDR-PLS)和7個(gè)有效波段具有較強(qiáng)的精準(zhǔn)度和可利用性，為開展作物外源重金屬脅迫的高光譜快速及無(wú)損監(jiān)測(cè)提供了參考與借鑒。

3 討論

3.1 鎘脅迫對(duì)菊苣葉片高光譜反射率變化特性影響的營(yíng)養(yǎng)機(jī)制

研究表明，鎘脅迫對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育具有極強(qiáng)的危害性，較低濃度鎘即對(duì)植株幼苗光合色素(葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等)與葉片結(jié)構(gòu)(生物量、葉面積、葉片解剖參數(shù)等)產(chǎn)生明顯的毒害作用，而兩者則是影響葉片光譜變化的最關(guān)鍵因素[19-21]。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度重金屬鎘脅迫下菊苣葉片光譜反射率表現(xiàn)出較大的差異性，尤其是在可見光至近紅外區(qū)(400～1 300 nm)(圖3)。與金銘[22]研究結(jié)論相一致，隨鎘脅迫程度加劇，3個(gè)菊苣品種葉片光譜反射率均表現(xiàn)為葉綠素強(qiáng)吸收帶深度變淺，550 nm附近光譜反射率降低；近紅外區(qū)葉片光譜對(duì)鎘脅迫具有敏感響應(yīng)，主要是由于Cd2+進(jìn)入植物體后首先在細(xì)胞壁產(chǎn)生積累，而后與膜蛋白親離子基相結(jié)合，繼而引起膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)和葉片宏觀長(zhǎng)勢(shì)發(fā)生改變，影響光在葉片及細(xì)胞間傳輸路徑，繼而在光譜上形成了反射率不同的波譜曲線。以“歐洲菊苣”為例，六葉期0、5、10、25、50、100、200 μmol/L鎘濃度下其葉綠素含量平均為1.64、1.51、1.47、1.28、1.11、0.83、0.54 mg/g，地上部葉片鮮質(zhì)量則分別為10.84、9.68、9.18、5.15、2.14、1.31、0.87 g/株，差異顯著。1 300 nm之后中紅外區(qū)不同鎘濃度下葉片光譜反射率變化趨勢(shì)則不盡一致，主要原因是由于雖然鎘脅迫對(duì)菊苣長(zhǎng)勢(shì)產(chǎn)生了明顯影響，但處理間葉片含水率(本實(shí)驗(yàn)中，菊苣葉片含水率均在86%～91%之間)相比于葉片色素和生物量差異則不明顯，而該區(qū)域又是水的強(qiáng)吸收帶[23]。

3.2 菊苣鎘脅迫高光譜監(jiān)測(cè)的穩(wěn)定模型構(gòu)建

相比于逐步回歸(SWR)和主成分回歸(PCR)分析，基于偏最小二乘回歸(PLS)的菊苣葉片鎘質(zhì)量比定量監(jiān)測(cè)模型無(wú)論是原始光譜(R)亦或FDR光譜，其準(zhǔn)確度(R2)和精確度(RMSE和RPD)表現(xiàn)均相對(duì)最優(yōu)(表1)。研究認(rèn)為，PLS是集典型相關(guān)分析、主成分分析和多元線性回歸分析為一體的新型多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠有效利用所有自變量信息構(gòu)建高魯棒性預(yù)測(cè)模型[24]。同時(shí)，PLS能夠有效抑制或避免多個(gè)自變量間的共線性問(wèn)題，優(yōu)化變量信息，最大化自變量和因變量間的共線性，特別適合于自變量數(shù)較高且明顯多于因變量的光譜數(shù)據(jù)分析[25]。光譜變換方式間，采用FDR-PLS的菊苣葉片鎘質(zhì)量比預(yù)測(cè)性能則明顯優(yōu)于R-PLS，主要原因可能是由于FDR處理有效降低了背景環(huán)境中空氣吸收和散射對(duì)目標(biāo)光譜的影響，且FDR還可部分去除線性或接近線性背景、噪聲光譜對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[26-27]，該結(jié)果與筆者前期對(duì)其他作物研究結(jié)論均一致[28]，進(jìn)一步表明采用FDR-PLS模型在預(yù)測(cè)菊苣鎘質(zhì)量比時(shí)的可行性與可靠性。

3.3 菊苣鎘脅迫高光譜監(jiān)測(cè)的有效波段確定

在明確重金屬鎘脅迫光譜響應(yīng)特征及構(gòu)建穩(wěn)定監(jiān)測(cè)模型基礎(chǔ)上，尋求能穩(wěn)定預(yù)測(cè)鎘脅迫程度及鎘濃度時(shí)空變化的特征波段或有效波段，對(duì)提高光譜診斷時(shí)效性和分析效率，降低開發(fā)便攜式光譜監(jiān)測(cè)儀器成本等均具有重要意義。本研究中，基于FDR-PLS中各波段VIP值，確定菊苣葉片鎘質(zhì)量比有效波長(zhǎng)為659、725、907、1 026、1 112、1 255、1 630 nm(圖5)。其中，659、725 nm波長(zhǎng)位于可見光區(qū)的“紅邊”范圍，該區(qū)域是由于作物葉綠素強(qiáng)吸收和葉片結(jié)構(gòu)的高反射所致，是指示作物鎘脅迫程度、營(yíng)養(yǎng)狀況及群體結(jié)構(gòu)的重要波段[29-30]；907、1 026、1 112、1 255 nm波長(zhǎng)則位于近紅外區(qū)，是反映作物結(jié)構(gòu)特性的關(guān)鍵波段。本實(shí)驗(yàn)中，隨鎘脅迫程度增加，菊苣植株變小，莖稈纖細(xì)，葉面積和葉片厚度均明顯降低，顯著影響葉片對(duì)光的吸收與利用性能，而上述特征變化在光譜曲線上的響應(yīng)則主要集中在近紅外區(qū)(圖3)。1 630 nm波長(zhǎng)則位于中紅外區(qū)，是指示葉片水分狀況的特征波段，雖然不同鎘濃度脅迫間菊苣葉片含水率差異不大，但整體而言，隨鎘脅迫程度加劇其葉片呈發(fā)黃枯萎狀，葉片含水率則相對(duì)較低，進(jìn)一步說(shuō)明基于葉片原位高光譜對(duì)反演作物鎘脅迫狀況的準(zhǔn)確性與靈敏度。此外，基于上述有效波段所構(gòu)建FDR-PLS模型仍然獲得了相對(duì)較好的預(yù)測(cè)性能，獨(dú)立驗(yàn)證集和品種驗(yàn)證相對(duì)分析誤差(RPD)分別為2.41與1.77，表明前述所確定菊苣葉片鎘質(zhì)量比有效波段是合理與適宜的，可以用于鎘質(zhì)量比的快速和準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)(圖6、7)。雖然本研究數(shù)據(jù)融合了多個(gè)品種與鎘濃度脅迫效應(yīng)，但實(shí)驗(yàn)的開展是在特定的室內(nèi)水培條件下獲得的，因此，在后續(xù)研究中可將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與土培甚至田間試驗(yàn)相融合，以進(jìn)一步擴(kuò)大本研究結(jié)果的推廣應(yīng)用性。

4 結(jié)論

(1)鎘脅迫顯著影響菊苣葉片鎘質(zhì)量比及原位高光譜反射特性。隨鎘脅迫程度的增加，其葉片鎘質(zhì)量比在3個(gè)供試品種間均明顯提升；葉片原位高光譜反射率在可見光-近紅外區(qū)(400～1 300 nm)則逐步降低，且近紅外區(qū)處理間差異程度弱于可見光區(qū)，中紅外區(qū)(1 300～2 400 nm)光譜反射率未表現(xiàn)出明顯或一致性變化規(guī)律。

(2)全波段光譜分析模型間，以基于一階微分光譜(FDR)的偏最小二乘回歸(PLS)模型預(yù)測(cè)性能表現(xiàn)最優(yōu)，即FDR-PLS，其獨(dú)立驗(yàn)證集決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和相對(duì)分析誤差(RPD)分別為0.92、181.3 mg/kg和2.96，滿足模型精準(zhǔn)預(yù)測(cè)需求。

(3)在明確菊苣葉片鎘質(zhì)量比最佳預(yù)測(cè)模型FDR-PLS后，根據(jù)各波段無(wú)量綱評(píng)價(jià)指標(biāo)VIP值，確定其特征波長(zhǎng)分別為659、725、907、1 026、1 112、1 255、1 630 nm，實(shí)現(xiàn)了光譜便捷和高效分析的目的。此后，基于上述有效波長(zhǎng)構(gòu)建FDR-PLS監(jiān)測(cè)模型，其獨(dú)立驗(yàn)證集R2、RMSE、RPD分別為0.834、222.4 mg/kg和2.41，9個(gè)供試品種驗(yàn)證集R2、RMSE、RPD則分別為0.817、13.0 mg/kg和1.77，預(yù)測(cè)效果較為理想。