過表達miR-155對強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞凋亡的影響及作用機制探討

茍玉蕭，吳霞，陳龍，汪佳利

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種免疫相關(guān)的慢性炎性關(guān)節(jié)疾病，主要臨床表現(xiàn)為髖部、腰部、頸部等關(guān)節(jié)疼痛，具有較高的致畸性和致殘性。AS發(fā)病多由感染、免疫遺傳因素引起，患者滑膜關(guān)節(jié)、軟骨關(guān)節(jié)、肌腱及韌帶附著點被炎性細(xì)胞浸潤，引起外周關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，滑膜在關(guān)節(jié)的損傷破壞中發(fā)揮著重要作用，而AS的常見病理學(xué)改變是滑膜組織異常增生，形成滑膜炎，進而引起血管翳，并侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨化強直[2]。隨著年齡的增大或其他原因，滑膜組織缺少足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，滲透性降低，這一過程極有可能導(dǎo)致滑膜細(xì)胞活性降低甚至死亡，從而影響滑膜組織的代謝，最終促使滑膜炎形成[3]。目前尚未完全清楚強直性脊柱炎的分子機制，大量研究發(fā)現(xiàn)或與滑膜細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。MicroRNA(miRNA)是存在于真核生物中一類長度為18～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)是由Dicer酶加工的單鏈RNA前體(包含70～90個堿基)形成，能夠與特定靶基因相結(jié)合進而參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達[4]，其作用機制主要是直接結(jié)合在特定的靶信使RNA的3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)，促使靶RNA發(fā)生降解或者翻譯受到抑制，從而使目的基因表達受到影響。作為miRNA家族的重要成員之一，miR-155所在的非編碼B細(xì)胞集合基因簇(BIC)第3個外顯子位于人類21號染色體上[5]。目前miR-155在強直性脊柱炎中的作用研究逐漸成為熱點，但其作用機制尚不十分明確。因此，現(xiàn)對強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞進行miR-155過表達，并探討其對細(xì)胞凋亡的影響機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)主要細(xì)胞：大腸桿菌菌株DH5α、人胚胎腎上皮細(xì)胞293T由遂寧市中心醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室保存；強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞由該實驗室制備并保存。miR-155模擬物(miR-155 mimic)及空白對照(mimic control)由上海吉瑪生物技術(shù)公司代為合成；miR-155過表達慢病毒載體系統(tǒng)購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司，由GV369、輔助包裝質(zhì)粒pHelper1.0和pHelper2.0 3個載體質(zhì)粒構(gòu)成。(2)試劑：DMEM、胎牛血清(FBS)、雙抗、0.25%胰酶購自美國Gibico公司；限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；Taq聚合酶和T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司。(3)儀器：雙熒光素酶報告基因分析試劑盒、DNA Ladder購自美國Thermo公司； JC-1、PCR、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及去內(nèi)毒素小量提取質(zhì)粒試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司； SD-001/SD-002動物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒購自英文特生物技術(shù)北京有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；線粒體膜電位檢測試劑盒購自美國R&D公司；Annexin V-APC/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒KGA1023購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；HEK293T細(xì)胞、內(nèi)參β-actin抗體、兔抗人FADD一抗、兔抗人Caspase-3、兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax一抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞制備及培養(yǎng)： 強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞來自2018年5—8月在四川省遂寧市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科行人工髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的強直性脊柱炎患者，均符合強直性脊柱炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。男女各4例，患者年齡32～55歲，中位數(shù)41.22歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

在無菌超凈工作臺內(nèi)，將收集的病變滑膜組織取出，加D-Hanks液反復(fù)浸泡清洗干凈，用滅菌手術(shù)剪刀將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，加入適量在37℃水浴箱中預(yù)熱的0.25%胰酶進行消化，肉眼觀察組織無明顯塊狀后，加適量FBS終止消化，并吸入離心管中離心 10 min，轉(zhuǎn)至超凈臺，棄上清，加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基2 ml將細(xì)胞輕輕吹打開，吸至培養(yǎng)瓶中，再補加適量含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，2～3 d后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，隔天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度達到80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。若制備細(xì)胞量大或暫時不使用，可加細(xì)胞凍存液后置于液氮中凍存，待用時取出復(fù)蘇培養(yǎng)即可。

1.2.2 miR-155過表達載體構(gòu)建及慢病毒收獲：PCR方法擴增出目的片段，酶切并用凝膠回收試劑盒進行純化回收。連接線性化慢病毒表達載體GV369，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布具有嘌呤霉素抗性的LB平板，挑取菌落進行鑒定，然后將陽性克隆擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，測序正確的陽性克隆命名為GV369-miR-155。

將生長良好的293T細(xì)胞置于新的培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，次日待細(xì)胞長至70%左右，棄掉原培養(yǎng)液，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)放于培養(yǎng)箱2 h后備用。將構(gòu)建的陽性質(zhì)粒GV369-miR-155、輔助包裝質(zhì)粒Helper1.0和Helper2.0與轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，室溫孵育，然后取適量混合液緩慢滴加至備用的293T細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動混勻后，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時設(shè)置GV369空載體轉(zhuǎn)染對照，6 h后取出棄液，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后吸取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中營養(yǎng)液，在提前設(shè)置好的4℃離心機中離心10 min, 將上清液倒入濾器中過濾，然后轉(zhuǎn)至超速離心管中，4℃超速離心2 h，PBS重懸沉淀即為包裝好的慢病毒液，分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 miR-155慢病毒過表達穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建：首先篩選嘌呤霉素對強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞的最低全部致死濃度，將對數(shù)生長期的強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞鋪于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)后，每孔加入適量含有不同梯度濃度嘌呤霉素的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，每隔48 h換液，連續(xù)篩選1周，觀察細(xì)胞生長狀況，全部死亡的濃度即為最低篩選濃度。

復(fù)蘇強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞，待細(xì)胞生長狀態(tài)處于對數(shù)生長期時鋪于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，次日細(xì)胞長至75%左右時，加入適量GV369-miR-155慢病毒液和空載體慢病毒液，感染強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞8 h后換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光標(biāo)簽的表達。按照篩選嘌呤霉素最低致死劑量時的細(xì)胞密度，將上述細(xì)胞傳代至6孔板，每隔48 h換為含最低致死劑量嘌呤霉素的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，連續(xù)篩選1周，挑取未被藥物殺死的活細(xì)胞即為陽性細(xì)胞，進行擴大培養(yǎng)即為構(gòu)建成功的穩(wěn)定表達細(xì)胞系。分別將感染了GV369-miR-155及空載體慢病毒液的強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞系分為GV369-miR-155-NP組和GV369-NP組，以未轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞為空白組。

1.3.2 RT-qPCR法檢測miR-155的表達效率：收集感染GV369-miR-155-NP和GV369-NP的細(xì)胞及空白組細(xì)胞，TRIzol試劑提取總RNA，用DNA/RNA測量儀測得RNA濃度。取符合要求的RNA樣本，采用半定量RT-qPCR 法擴增miR-155 mRNA。按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，然后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40 個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。擴增結(jié)束后，產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，PUX Mix Marker 作為分子量參照物同時電泳，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1，用凝膠成像分析儀在紫外光下采集圖像，采用Gepro 4.2軟件分析目的基因與同一條帶β-actin的光密度比值。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：細(xì)胞分組處理同上，將各組細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰酶進行消化，吸至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗2次，收集細(xì)胞。加入適量AnnexinV Binding Buffer重懸細(xì)胞，再分別加Annexin V-APC及7-AAD，室溫避光孵育15 min。用Annexin V-APC/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對細(xì)胞雙染，以避免與慢病毒表達的GFP熒光色譜的重疊，作用1 h內(nèi)將制備好的樣品置于流式細(xì)胞儀中檢測分析。

1.3.4 熒光素酶報告基因分析：以人胚胎腎上皮細(xì)胞293T基因組DNA為模板，采用PCR擴增FasL的3'-非翻譯區(qū)序列，構(gòu)建至熒光素酶報告基因載體pGL3中，記為野生型pGL3-FasL-WT，同時構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒pGL3-FasL-MUT。將HEK293T細(xì)胞按30%左右密度鋪24孔板，將miR-155 mimic及mimic control分別與空載質(zhì)粒、野生型pGL3-FasL-WT及突變型pGL3-FasL-MUT共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，分為對照組、野生組和突變組。轉(zhuǎn)染后24 h，根據(jù)雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3.5 Western-blot法檢測Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)、Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達：細(xì)胞分組處理同上，將各組細(xì)胞采用SD-001/SD-002動物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒提取收集細(xì)胞中總蛋白，并用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白含量。將制備好的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加含有5% BSA的封閉液室溫下封閉2 h。分別加用封閉液1∶1 000稀釋的兔抗人FADD一抗、1∶500稀釋的Caspase-3一抗、1∶1 000稀釋的兔抗人Bcl-2及1∶2 000稀釋的兔抗人Bax，置于4℃冰箱孵育過夜。次日，PBST洗膜3次，每次10 min，再加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜，加ECL進行顯色，暗室曝光拍照，并以β-actin作為內(nèi)參蛋白。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.6 線粒體膜電位變化情況檢測：細(xì)胞分組處理同上，參照J(rèn)C-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書，依次完成實驗步驟，將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，在不同波長下觀察細(xì)胞顯色水平，其中紅色熒光，激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長580 nm；綠色熒光，激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm 觀察。使用計算機采集熒光圖像，Image J軟件重疊紅綠熒光，將合成熒光的紅、綠色熒光光密度比值作為膜電位表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 miR-155穩(wěn)定過表達強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞系建立情況 感染慢病毒的強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞，經(jīng)過適宜濃度的嘌呤霉素篩選后，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過表達miR-155細(xì)胞系GV369-miR-155-NP，以及空載體慢病毒細(xì)胞系GV369-NP。在熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)慢病毒感染的過表達細(xì)胞系和空載體細(xì)胞系均出現(xiàn)綠色熒光，即慢病毒表達載體上的標(biāo)簽蛋白GFP表達，表明感染成功，而空白組細(xì)胞未見綠色熒光，見圖1。

2.2 3組miR-155表達量比較 與空白組比較，GV369-miR-155-NP組中miR-155表達量明顯升高(t=12.399，P=0.000)；GV369-NP組與空白組中miR-155表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系能高效表達miR-155，見圖2。

2.3 3組細(xì)胞凋亡率比較 與空白組比較，GV369-miR-155-NP組細(xì)胞凋亡率明顯降低(t=12.612，P=0.000)；GV369-NP組和空白組比較，細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 3組熒光素酶活性比較 雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-155后，野生型FasL的熒光素酶活性被抑制(t=10.200，P=0.000)，突變型FasL的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

2.5 3組FADD、Caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表達水平比較 與空白組比較，GV369-miR-155-NP組中FADD、Caspase-3及Bax的表達水平明顯下降，而Bcl-2表達水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.450，P=0.000；t=7.711，P=0.000；t=6.977，P=0.001；t=8.658，P=0.000)。GV369-NP組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

2.6 3組線粒體膜電位比較 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h 經(jīng)JC-1處理后，空白組中細(xì)胞線粒體膜電位較低(紅色熒光與綠色熒光比值較低)。與空白組比較，GV369-miR-155-NP組中細(xì)胞線粒體膜電位出現(xiàn)明顯上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.879，P=0.002)，空白組與GV369-NP組比較線粒體膜電位變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

3 討 論

近年，強直性脊柱炎已成為一種常見高發(fā)性慢性病，不論是中老年人群還是青年人群均可發(fā)病。強直性脊柱炎可引起多種癥狀，髖部、腰部、頸部等關(guān)節(jié)疼痛為其主要臨床表現(xiàn)[7]。目前，年齡、飲酒、過度勞累等被認(rèn)為是導(dǎo)致強直性脊柱炎的外在因素。關(guān)于其發(fā)病的分子機制與傳導(dǎo)通路也存在眾多觀點，炎性因子、遺傳基因、氧化應(yīng)激、NO誘導(dǎo)、MicroRNA等在強直性脊柱炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[8]，而NF-κB、PI3K/Akt、MAPK、Wnt/β-catenin、Notch等被認(rèn)為是與該病相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路[9]。這些分子與信號通路相互影響，關(guān)系密切，在疾病發(fā)生過程中共同起作用。

眾多研究表明，miR-155作為MicroRNA家族的重要成員，參與機體多項生理活動。miR-155在銀屑病患者皮損中呈上調(diào)表達[10]，與炎性因子刺激有關(guān)。另外，miR-155在白血病中相當(dāng)于一種癌基因，在多種實體腫瘤如結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌等高度表達，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等[11-14]。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞中表達量比正?；ぜ?xì)胞顯著降低[15]。本研究中構(gòu)建強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞miR-155過表達細(xì)胞系，結(jié)果顯示，與空白組比較，GV369-miR-155-NP組細(xì)胞凋亡率明顯降低，這一結(jié)果證實miR-155可抑制強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞發(fā)生凋亡，與既往的研究結(jié)果相符。

死亡受體與其配體相結(jié)合是細(xì)胞凋亡外源性通路的介導(dǎo)機制，強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞凋亡與外源性通路FasL/Fas介導(dǎo)有關(guān)[16]。FasL/Fas凋亡通路的關(guān)鍵蛋白包含Caspase-3及FADD ，有報道稱[17]，miR-155對該通路有調(diào)控作用，本研究采用雙熒光素酶報告基因驗證了miR-155與FasL具有靶向調(diào)控關(guān)系。進一步分析構(gòu)建的穩(wěn)定過表達miR-155細(xì)胞系中FADD和Caspase-3 蛋白表達情況，結(jié)果顯示，與空白組比較，F(xiàn)ADD和Caspase-3在GV369-miR-155-NP組中的表達水平明顯下降。進一步證實miR-155對FADD和Caspase-3的表達起到抑制作用，與其能夠抑制細(xì)胞凋亡的結(jié)果相符。

內(nèi)源性途徑引起的細(xì)胞凋亡首先發(fā)生于線粒體內(nèi)，又稱線粒體途徑，該途徑主要通過Bcl-2 家族蛋白進行調(diào)節(jié)，Bcl-2 家族蛋白主要包括抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-W、Bcl-xL及Mcl-1等，促凋亡成員Bak、Bax及Bok等[18]。Bcl-2作為主要的抗凋亡成員在線粒體外膜發(fā)揮作用，可以維持膜結(jié)構(gòu)的完整性[19]；Bax作為主要的促凋亡成員是通過破壞線粒體膜的完整性進而發(fā)揮作用的[20]。Bcl-2家族蛋白能夠使線粒體膜的通透性發(fā)生精確的改變，也能誘導(dǎo)線粒體使其通透性轉(zhuǎn)變孔道開放，而保護其外膜免受損傷，同時線粒體基質(zhì)出現(xiàn)高滲狀態(tài)，進一步膨脹造成外膜破裂，都能使膜間隙中的凋亡誘導(dǎo)因子、細(xì)胞色素C、促凋亡蛋白等物質(zhì)進入胞質(zhì)中，而后促凋亡蛋白可獨立破壞核內(nèi)染色質(zhì)，也可通過激活Caspase，最終引起細(xì)胞凋亡[21]。本研究同時檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，GV369-miR-155-NP組中Bax的表達水平下降，而Bcl-2表達水平升高，與其他2組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果提示，miR-155在抑制強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞凋亡中可能通過線粒體途徑介導(dǎo)。為此進一步檢測細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況，結(jié)果GV369-miR-155-NP組細(xì)胞膜電位保持穩(wěn)定，另外2組出現(xiàn)顯著下降趨勢，再次驗證線粒體途徑參與了miR-155抑制強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞的凋亡。

綜上，miR-155在強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞凋亡中具有重要作用，可以通過靶向調(diào)控外源性FasL/Fas通路參與Caspase-3和FADD介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，此外，miR-155也可通過線粒體介導(dǎo)的途徑抑制強直性脊柱炎滑膜細(xì)胞凋亡。此結(jié)果為以后進一步研究強直性脊柱炎提供可靠依據(jù)，同時對該病的功能恢復(fù)治療具有重要意義。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

茍玉蕭:設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；吳霞:提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;陳龍:實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;汪佳利:課題設(shè)計