miR-141-3p和miR-22-3p在胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

秦瑞峰，薛佳棟，霍浩然，張佳，袁增江

胰腺癌是臨床惡性程度較高的惡性腫瘤，手術(shù)后生存時間較短，目前發(fā)病率逐年上升且有年輕化趨勢，嚴重危害患者的生命安全[1-2]。如何改善胰腺癌患者的預(yù)后是目前臨床研究的重點，但相關(guān)突破有限，分子靶向干預(yù)成為新思路。miRNA是一種不能編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，在細胞分化、增殖及凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[3-4]。miR-141可抑制腦膠質(zhì)瘤細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，miR-141-3p作為其重要亞型可能也有相似作用[5]；miR-22-3p可通過靶向膠質(zhì)細胞升高基因-1(AEG-1)抑制非小細胞肺癌細胞的表達[6]，但目前關(guān)于上述2種miRNA在胰腺癌中扮演的角色研究極少。本研究檢測胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量，探討其與疾病特征、預(yù)后的內(nèi)在聯(lián)系，旨在尋找與胰腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的分子并為后續(xù)靶向治療提供新思路，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月—2017年1月在河北省邯鄲市中心醫(yī)院普外三科進行手術(shù)治療的胰腺癌患者92例作為研究對象，納入標準：(1)經(jīng)術(shù)中組織病理確診為原發(fā)性胰腺癌；(2)首次確診疾病并接受手術(shù)治療；(3)符合手術(shù)治療指征且具有完整的臨床資料；(4)年齡≤80歲。排除標準：(1)合并其他原發(fā)惡性腫瘤性疾??；(2)合并嚴重營養(yǎng)不良，無法耐受手術(shù)創(chuàng)傷；(3)術(shù)前接受胰腺癌保守治療；(4)合并嚴重出凝血功能異常和/或自身免疫性疾?。?5)合并肺炎等活動性感染。其中男50例，女42例，年齡32～78(57.29±8.11)歲；腫瘤最大直徑(3.82±0.86)cm；腫瘤位置，胰頭28例，胰體尾64例；TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期65例；腫瘤分化程度，低分化40例，中分化39例，高分化13例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，遠處轉(zhuǎn)移40例。取患者術(shù)中病灶標本及癌旁組織標本各92份進行分析，病灶標本經(jīng)病理檢查確診為胰腺導(dǎo)管腺癌，癌旁組織標本經(jīng)病理檢查確診無癌細胞。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR檢測miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺組織中的表達 取胰腺組織和癌旁組織適量，采用miRNA提取試劑盒(北京天根，CW0627)提取組織中的miRNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根，SW2142S)將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-141-3p引物序列為5’-AGCGATTGAGCTGATGTCG-3’, 3’-TTAGGCTGACCAGTGATGAC-5’，miR-22-3p引物序列為5’-CTTGATGATAAGCTGAAGC-3’, 3’-CCTGAAGATGAGCGTAGGA-5’。采用miRNA實時熒光定量PCR檢測試劑盒(北京天根，CW2142S)配置PCR反應(yīng)體系后按照以下程序進行反應(yīng)：95℃ 3 min預(yù)變性，95℃ 5s、60℃ 15s重復(fù)40個循環(huán)，根據(jù)循環(huán)曲線，以U6為內(nèi)參，計算miR-141-3p、miR-22-3p的表達量。設(shè)置癌旁組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量為標準值100，計算胰腺癌組織中對應(yīng)miRNA的相對表達量。根據(jù)胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p表達量的中位數(shù)對胰腺癌患者進行亞分組，具體分為高表達、低表達組各46例。

1.3 預(yù)后隨訪 采用門診或住院復(fù)查、電話回訪等方式進行隨訪，隨訪截止時間為2019年6月30日，生存時間為確診日期至死亡日期或截止日期的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示，2組間比較采用χ2檢驗；繪制Kaplan-Meier生存曲線，用Log-rank檢驗對2組生存時間的差異進行分析；采用COX多因素風險回歸模型分析預(yù)后的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺組織中的表達比較 胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量分別為75.39±9.12、64.22±8.07，均低于癌旁組織的100.00，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺組織中的表達比較

2.2 miR-141-3p、miR-22-3p表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 不同miR-141-3p表達的胰腺癌患者中，TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同miR-22-3p表達的胰腺癌患者中，遠處轉(zhuǎn)移的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 miR-141-3p、miR-22-3p表達與預(yù)后的關(guān)系 患者隨訪2～38個月，隨訪中位時間為16個月。miR-141-3p、miR-22-3p高表達組患者的中位生存時間分別為21.2個月、20.8個月，明顯高于miR-141-3p、miR-22-3p低表達組患者的8.8個月、9.0個月，miR-141-3p、miR-22-3p高表達組患者生存率高于低表達組，經(jīng)Log-rank檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(Log-rank χ2/P=6.873/0.009，5.999/0.014)，見圖1。

2.4 胰腺癌患者預(yù)后的影響因素分析 建立COX比例回歸模型，因變量為胰腺癌患者預(yù)后狀況(存活=0，死亡=1)，根據(jù)表2選擇P<0.05的TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移、miR-141-3p、miR-22-3p為自變量?；貧w過程采用逐步后退法，共有TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移、miR-141-3p、miR-22-3p納入回歸方程，提示TNM分期較高、腫瘤分化程度較低、遠處轉(zhuǎn)移、miR-141-3p低表達、miR-22-3p低表達均是導(dǎo)致胰腺癌患者預(yù)后不良的危險因素(P<0.05)，見表3。

3 討 論

胰腺癌預(yù)后極差，絕大多數(shù)患者在確診后短期內(nèi)死亡[7]。手術(shù)切除腫瘤是改善胰腺癌患者預(yù)后的最主要方式，但很大一部分患者仍出現(xiàn)術(shù)后短期內(nèi)復(fù)發(fā)或者全身擴散，尋找在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的分子并進行靶向干預(yù)可能是未來該病治療的新手段之一?；谀壳癿iRNA在惡性腫瘤組織中的異常表達及在病情演進過程中發(fā)揮的重要作用，推測其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中也可能發(fā)揮一定作用。miR-141-3p、miR-22-3p均是重要的miRNA，國外研究報道，miR-141-3p在多種惡性腫瘤組織中表達不一，如可抑制腎癌細胞生長但對直腸癌細胞具有促生長作用，上調(diào)其表達可抑制結(jié)直腸癌細胞的生長轉(zhuǎn)移[8-10]；國內(nèi)研究指出[11]，miR-141-3p異常表達可影響卵巢癌細胞的惡性生物學行為。miR-22-3p由miR-22前體3’端臂剪切而來，其在多種惡性腫瘤組織中呈異常低表達，可抑制乳頭狀甲狀腺癌進展，可能與其靶向抑制ATP環(huán)化酶的作用相關(guān)[12-14]；抑制miR-22-3p表達可促進肺腺癌進展，上調(diào)miR-22-3p表達可抑制肝癌細胞增殖[15-16]。目前國內(nèi)關(guān)于miR-141-3p、miR-22-3p對胰腺癌發(fā)生發(fā)展的影響研究極少，本研究檢測胰腺癌組織、癌旁組織中上述miRNA的表達量發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中miR-141-3p、miR-22-3p的表達量較癌旁組織明顯降低，推測異常低表達的miR-141-3p、miR-22-3p參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。這與上述2種miRNA對腫瘤的抑制作用吻合，可能與Yoon等[17]的研究中所述靶向STAT4的作用相關(guān)，但具體機制未明，有待后續(xù)基礎(chǔ)研究深入明確。

表2 miR-141-3p、miR-22-3p表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

表3 胰腺癌患者預(yù)后的影響因素分析

低miR-141-3p、miR-22-3p表達的胰腺癌患者TNM分期較高、腫瘤分化程度較低、遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，而其在性別、年齡、腫瘤最大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的差異則不明顯。TNM分期較高、腫瘤分化程度較低、遠處轉(zhuǎn)移均與癌癥惡性程度關(guān)系最為密切，以上結(jié)果從臨床病理特征方面說明，miR-141-3p、miR-22-3p異常低表達可加劇胰腺癌惡性程度。miR-141-3p低表達促進胰腺癌惡性分化及遠處轉(zhuǎn)移的機制不明，國外研究認為，可能與其影響PI3K/Akt信號通路活性、調(diào)節(jié)trim13相關(guān)凋亡通路功能等相關(guān)[18-19]。在miR-22-3p影響癌細胞惡性進展的機制方面，有研究認為可能與其調(diào)控eIF4EBP3、sirt1等基因表達的作用相關(guān)[20-21]，但目前尚無結(jié)論。關(guān)于miR-141-3p、miR-22-3p對胰腺癌細胞生物學行為影響的直接機制研究目前極少，有待后續(xù)研究進一步明確。

經(jīng)COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期較高、分化程度較低、合并遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胰腺癌患者生存時間縮短的危險因素，與此同時miR-141-3p、miR-22-3p低表達也是胰腺癌患者預(yù)后不佳的直接影響因素，這與上述miR-141-3p、miR-22-3p低表達者的病理特點結(jié)果一致，說明miR-141-3p、miR-22-3p低表達可促進胰腺癌病情進展。最后繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p、miR-22-3p低表達的胰腺癌患者生存時間較短，進一步佐證了miR-141-3p、miR-22-3p表達變化對患者預(yù)后的影響。

綜上所述，胰腺癌組織中存在miR-141-3p、miR-22-3p異常低表達現(xiàn)象，與TNM分期、腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移共同成為胰腺癌預(yù)后不良的獨立危險因素。靶向上調(diào)miR-141-3p、miR-22-3p表達量可能成為日后胰腺癌治療的新思路。本次研究也存在以下局限性，如納入病例數(shù)較少、未涉及miRNA表達影響胰腺癌病情的分子機制，有待后續(xù)大樣本臨床研究、基礎(chǔ)研究進一步探討。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

秦瑞峰：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；薛佳棟：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;霍浩然、張佳：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；袁增江：進行統(tǒng)計學分析