BDNF Val66Met基因多態(tài)性與老年糖尿病患者認(rèn)知功能損害的相關(guān)性

劉佳，羅鴻宇，王潔妤，張麗，但小娟，楊偉

糖尿病是老年人群的常見疾病，常伴隨著認(rèn)知功能損害，其阿爾茨海默病(AD)發(fā)病率增高[1-2]。然而目前糖尿病出現(xiàn)認(rèn)知功能損害的確切機制仍不明確。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的一員，與神經(jīng)元的生長、分化、增殖、可塑性及大腦的認(rèn)知和記憶密切相關(guān)[3]。有研究證實，血BDNF水平在AD和糖尿病患者中下降[4-6]，但也有研究結(jié)果卻不一致[7-8]，可能是由于血清BDNF易受降糖降脂藥物、生活方式如運動、吸煙和飲酒等多種因素的影響[9]。Val66Met基因位于BDNF基因的編碼外顯子，其G/A多態(tài)性導(dǎo)致編碼的第66位氨基酸發(fā)生纈氨酸—甲硫氨酸(Val-Met)轉(zhuǎn)換，從而影響B(tài)DNF分泌[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在健康人群中風(fēng)險等位基因A攜帶者海馬體積和海馬相關(guān)記憶下降, 可能與AD發(fā)病相關(guān)[11-12]。糖尿病人群與健康人群比較，A等位基因攜帶者延遲回憶能力減退[4]。但該位點與老年糖尿病人群認(rèn)知功能下降是否相關(guān)目前少有報道。本研究分析了老年糖尿病患者認(rèn)知功能障礙與BDNF基因多態(tài)性的相關(guān)性，探討2型糖尿病認(rèn)知功能損害的可能機制，以期望為糖尿病認(rèn)知功能損害提供個體化治療依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月—2019年5月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院老年科診治糖尿病患者(年齡≥65歲)592例，其中認(rèn)知損害(CI)組189例，認(rèn)知正常組403例，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入組對象或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥65歲；(2)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)符合“中國2型糖尿病防治指南2017年版”[13]；(3)文化程度在初中及初中以上者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)影像學(xué)檢查有明確神經(jīng)系統(tǒng)疾病史(腦血管病、帕金森病等)；(2)嚴(yán)重內(nèi)科疾病不能配合檢查者，中重度貧血及甲狀腺功能減退者；(3)糖尿病高滲或酮癥酸中毒；(4)明確的精神疾病等；(5)嚴(yán)重視力或聽力障礙。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 臨床資料：(1)臨床特征，包括身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、疾病情況及降糖藥用藥信息[二甲雙胍、胰島素、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶4(dipeptidy1 peptidase-4, DPPⅣ)抑制劑]等；(2)生化指標(biāo)，空腹血糖(FPG)，糖化血紅蛋白(HbA1C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；胰島素抵抗指數(shù)(HOMA2-IR) 通過計算軟件(www.ocdem.ox.ac.uk)獲得[14]；(3)認(rèn)知功能評定，采用簡易智能評估量表(MMSE)評估，共30項，分為定向力、短時記憶、計算及注意力、延遲回憶和語言能力等5部分，總分范圍0～30分。根據(jù)中國癡呆與認(rèn)知障礙指南寫作組制定的認(rèn)知障礙標(biāo)準(zhǔn)，文盲組≤19分，小學(xué)組≤22分，初中以及上≤ 26分為認(rèn)知功能損害[15]。

1.3.2 基因分型檢測：采取靜脈血5 ml抗凝處理，按照QIAGEN公司基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA。BDNF Val66Met上游引物5’-AAGAAGCAAA-CATCCGAGGACA-3’,下游引物5’-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3’，引物由上海生工合成。然后應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)擴增目的DNA片段。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，根據(jù)電泳條帶遷移速率不同進行分析，對BDNF Val66Met進行基因分型。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料比較 2組的性別、年齡、高血壓病史、BMI水平、Ln HOMA2-IR及其他口服降糖藥物相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。與認(rèn)知正常組比較，CI組的糖尿病病程、HbA1C、血LDL-C、空腹血糖水平增高，而受教育時間(年)偏低及口服二甲雙胍比例下降(P均<0.05)，見表1。

2.2 2組BDNF Val66Met 基因多態(tài)性比較 其在總?cè)巳褐蟹植挤螲ardy-Weinberg平衡(P>0.05)，最小等位基因(A)頻率為46.6%。雖然3種基因型GG、AG、AA在CI組和認(rèn)知正常組之間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是風(fēng)險等位基因A在CI組中分布明顯高于認(rèn)知正常組(51.1%vs.44.5%，P=0.036)，見表1。

表1 2組一般資料和BDNF基因多態(tài)性分布比較

2.3 BDNF基因多態(tài)性與MMSE分值的相關(guān)性分析

2.3.1 BDNF基因多態(tài)性MMSE分值比較：在總?cè)巳褐械任换駻攜帶者的語言能力及定向力、延遲回憶分值低于非攜帶者(P<0.05)，但在MMSE總分值、短時記憶和計算能力方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 BNDF Val66Met基因多態(tài)性中MMSE各項分值的比較分)

2.3.2 BDNF風(fēng)險等位基因與MMSE分值的線性相關(guān)分析：進一步分析BDNF Val66Met風(fēng)險等位基因A與MMSE總分以及各分值的相關(guān)性(見表3)。采用線性回歸分析，調(diào)節(jié)表1有顯著差異的相關(guān)因素后，每拷貝風(fēng)險等位基因A與MMSE(β=-0.096,P=0.011), 定向力(β=-0.155,P<0.001)，延遲回憶(β=-0.134,P=0.001)呈負(fù)相關(guān)，但在短時記憶、計算及注意力和語言能力方面無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.4 糖尿病患者認(rèn)知功能障礙的多因素分析 將表3中有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的因素采用Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病病程、FPG、HbA1C、LDL-C是糖尿病認(rèn)知功能障礙的獨立危險因素，受教育時間和口服二甲雙胍是糖尿病認(rèn)知功能障礙的保護因素(P均<0.05)，見表4。此外，BDNF Val66Met是糖尿病人群認(rèn)知功能障礙風(fēng)險基因，其等位基因A攜帶者(AA+GA)認(rèn)知障礙發(fā)病風(fēng)險是非攜帶者的1.696倍(95%CI1.119～2.569，P=0.013)。高血壓與老年糖尿病患者認(rèn)知功能減退無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表3 BDNF風(fēng)險等位基因與MMSE各項分值的相關(guān)性分析

表4 老年糖尿病患者認(rèn)知功能障礙多因素Logistic回歸分析

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，與非糖尿病人群比較，糖尿病患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率增加了1.5倍，其危險因素主要包括血糖代謝紊亂、胰島素抵抗、血脂異常、血壓增高、肥胖及遺傳因素如APOE基因等[2]。而近期針對糖尿病人群橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知損害組在腦卒中、高血壓及抑郁方面比例均高于糖尿病認(rèn)知正常組，而在飲酒、吸煙、血脂水平、空腹血糖、BMI及APOE風(fēng)險基因方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義[16-18]。而本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病程、HbA1C及LDL-C水平增高均是糖尿病認(rèn)知功能下降的危險因素，但并未發(fā)現(xiàn)高血壓人群在認(rèn)知損害組中比例增高，可能與高血壓本身就是腦卒中的高危因素有關(guān)，既往研究中未除外腦卒中患者，糖尿病所造成的認(rèn)知功能損害可能混入了高血壓導(dǎo)致的腦卒中從而引起認(rèn)知功能下降，此外既往研究對象還包含了抑郁癥患者，因此導(dǎo)致了結(jié)果的差異。而本研究在研究對象選擇方面除外糖尿病合并腦卒中和抑郁癥患者，其相關(guān)性結(jié)果更能準(zhǔn)確體現(xiàn)糖尿病與非血管性認(rèn)知功能障礙及阿爾茨海默病(AD)之間的聯(lián)系。目前二甲雙胍與糖尿病認(rèn)知功能的相關(guān)性無一致結(jié)論，有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍造成的維生素B12和鈣的缺乏可以增加認(rèn)知功能損害的風(fēng)險[19-20]，但另一些研究卻相反[21-22]，本研究顯示二甲雙胍是糖尿病患者認(rèn)知功能損害的保護因素，補充維生素B12及鈣劑是否與二甲雙胍對認(rèn)知功能的影響有關(guān)，還需進一步研究證實。

血BDNF水平在T2DM 人群中較正常人群降低[4-6]，而BDNF Val66Met 基因多態(tài)性可以影響B(tài)DNF細胞內(nèi)運輸和活動依賴性分泌從而影響B(tài)DNF的功能[10]。 該基因多態(tài)性分布頻率因人種的不同而出現(xiàn)差異，在亞洲人群A等位基因的分布頻率最高達48.1%[23]，較歐洲人群增高2倍以上[6]。在亞洲人群中研究發(fā)現(xiàn)，對比T2DM和正常組人群認(rèn)知功能，2組間基因分布頻率無顯著差異，但在延遲回憶分值方面A等位基因攜帶者較非攜帶者顯著下降[24-26]。因此推測BDNF Val66Met 基因多態(tài)性并非直接影響了T2DM易感性，而是對糖尿病患者部分認(rèn)知域下降造成了影響。糖尿病認(rèn)知功能損害常伴隨多個認(rèn)知域，如即刻記憶、延遲記憶、學(xué)習(xí)和執(zhí)行能力的下降[21]。本研究以老年人群為研究對象，結(jié)果顯示在總?cè)巳褐蠥等位基因分布頻率為46.6%，并發(fā)現(xiàn)風(fēng)險等位基因A增加可導(dǎo)致延遲回憶分值下降，與以往研究一致[4]。此外A等位基因攜帶者在定向力和語言能力方面分值較非攜帶者下降。在調(diào)整學(xué)歷和糖尿病病程等其他危險因素后，提示BDNF Val66Met可能是老年T2DM認(rèn)知功能損害的獨立危險因素。

目前BDNF Val66Met對認(rèn)知功能影響的機制尚不明確。一方面，有研究發(fā)現(xiàn)，Val66Met基因突變在健康人群中可以影響海馬相關(guān)的記憶功能和海馬體積[12]，與正常人群海馬相比，散發(fā)型阿爾茨海默病患者海馬中BDNF表達明顯降低，這些結(jié)果提示BDNF基因突變及造成隨后蛋白水平的變化可能與AD的早期病理改變有關(guān)[11-12]。此外該位點還能通過影響神經(jīng)元BDNF的功能，與一些神經(jīng)系統(tǒng)和精神疾病相關(guān)。另一方面，Val66Met位點突變導(dǎo)致BDNF表達下降，而BDNF可以通過刺激生長激素抑制素的表達增加β-淀粉樣蛋白的降解[27]，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生。在糖尿病人群中，胰島素抵抗和高胰島素血癥，可能導(dǎo)致腦內(nèi)胰島素作用減弱，Aβ生成增多和降解減少，從而使神經(jīng)元產(chǎn)生退行性改變[2,28]，可形成AD的相關(guān)病理改變，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。此外，糖尿病病變本身出現(xiàn)的顱內(nèi)微血管慢性缺血病變，也會造成認(rèn)知功能的損害。而BDNF Val66Met多態(tài)性是否會加劇糖尿病人群胰島素抵抗、高胰島素血癥及微血管病變需要更進一步的研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)BDNF Val66Met基因是老年糖尿病患者認(rèn)知功能損害的風(fēng)險基因，但是本研究為病例對照研究，BDNF Val66Met風(fēng)險等位基因攜帶者對糖尿病患者認(rèn)知功能障礙發(fā)病風(fēng)險的影響還需要進一步前瞻性研究來證實。此外本研究的局限性還在于認(rèn)知功能損害重要的風(fēng)險基因APOE未納入分析。故今后進一步擴大樣本量，探討2種風(fēng)險基因?qū)夏晏悄虿』颊哒J(rèn)知功能的影響。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉佳:實施研究過程，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，撰寫論文；羅鴻宇、張麗：實施主要研究過程；王潔妤：設(shè)計研究流程和方案；但小娟:數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析，進行文獻調(diào)研與整理；楊偉：提出研究方向及思路，參與論文修改