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    HPLC-ELSD法測定珠子參根莖中新化合物24(R)-珠子參苷R1 的質(zhì)量比

    2014-10-25 07:34:18王加付李蘭杰李緒文金永日時曉磊
    關(guān)鍵詞:液相色譜儀根莖定容

    王加付,彭 紹,李蘭杰,楊 潔,孫 婷,李緒文,金永日,時曉磊,3

    (1.吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,長春130012;2.黑龍江煙草有限責(zé)任公司,哈爾濱150001;3.吉林大學(xué) 軍需科技學(xué)院,長春130062)

    珠子參為五加科植物珠子參(Panax japonicus C.A.Mey.var.Major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng)的干燥根狀莖,具有補(bǔ)肺、養(yǎng)陰、活絡(luò)和止血的作用,用于治療氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)疼痛、咳血、吐血和外傷出血等癥.珠子參廣泛分布于云南、貴州、湖北和四川等地[1],生長于陰濕的針闊葉林、闊葉灌木、竹葉林以及雜灌叢中.目前,珠子參根莖的化學(xué)成分[2-5]和藥理作用[6-9]研究較多,其化學(xué)成分測定[10-11]主要集中在質(zhì)量濃度較大的皂苷竹節(jié)參皂苷Ⅳa和竹節(jié)參皂苷Ⅴ.本文采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測定珠子參根莖中新化合物24(R)-珠子參苷 R1的質(zhì)量比[12].

    1 材料與方法

    1.1 樣品與試劑

    珠子參分別購于云南省昆明市和河北省安國市,經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院張靜敏教授鑒定為珠子參的干燥根莖;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水;甲醇為色譜純;化合物24(R)-珠子參苷R1對照品自制,經(jīng)質(zhì)譜(MS)、紅外光譜(IR)、核磁共振氫譜(1H NMR)和核磁共振碳譜(13C NMR)等方法表征樣品結(jié)構(gòu),按HPLC-ELSD色譜條件歸一化測定樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.85%,其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.

    圖1 化合物24(R)-珠子參苷R1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of 24(R)-majoroside R1

    1.2 儀 器

    Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢驗(yàn)器(美國Alltech公司);RE-201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠);Mettlertoledo AG135型電子天平(德國Startorius YDO-OIR公司);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司).

    1.3 對照品的分離純化

    將珠子參根莖80%的乙醇粗提取物(約1.4kg)用洗脫劑V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=20∶1∶0.05進(jìn)行硅膠柱層析.經(jīng)薄層色譜(TLC)檢測可得A,B,C,D 4個極性不同的部分.將B部分用洗脫劑V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=10∶1∶0.05進(jìn)一步硅膠柱純化、合并并濃縮,得到B1和B2兩部分.將B1部分用V(甲醇)∶V(水)=1.5的溶劑進(jìn)行ODS柱層析,分離得到對照品70mg.

    1.4 對照品溶液的配制

    稱量對照品約10.12mg,置于10.00mL容量瓶中,以甲醇溶解、定容,得1.00mg/mL對照品儲備液.將2.0mL儲備液置于10.00mL容量瓶中,用甲醇定容,得0.2mg/mL對照品溶液.

    1.5 供試品溶液的制備

    將干燥的珠子參粉碎,過60目篩,精密稱取2.0g,用16mL甲醇作為提取溶劑,連續(xù)回流3次,回流時間依次為1.5,1.0,1.0h,合并提取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,以甲醇溶解,并定容至10.00mL,過0.22μm有機(jī)濾膜,取續(xù)濾液.

    1.6 色譜條件

    Aglilent Zorbax SB-C18(ODS,4.6mm×250mm,5μm)色譜柱;流動相為甲醇和水,等度洗脫,體積比為58∶42;流速為1.0mL/min;柱溫為25℃;載氣壓力為1.94×105Pa;漂移管溫度為85℃;撞擊器關(guān)閉;進(jìn)樣量為20μL.將對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.2mg/mL)和供試品溶液各20μL置于高效液相色譜儀進(jìn)行測定.

    2 條件優(yōu)化

    2.1 ELSD條件選擇

    經(jīng)紫外光譜測定,24(R)-珠子參苷R1在200~400nm無吸收,因此選擇ELSD作為檢測器.對ELSD的檢測條件進(jìn)行優(yōu)化,確定其條件為:載氣壓力1.94×105Pa;漂移管溫度85℃;撞擊器關(guān)閉.

    2.2 流動相選擇

    采用不同體積比的甲醇和水及乙腈和水作為流動相,通過比較色譜可見:采用乙腈和水作為流動相,待測化合物與樣品中的其他化合物無法達(dá)到基線分離;采用V(甲醇)∶V(水)=58∶42作為流動相可使混合物達(dá)到較好的分離效果(分離度>1.5),且保留時間為14.2min,因此采用V(甲醇)∶V(水)=58∶42作為流動相.

    2.3 提取條件的選擇

    2.3.1 提取溶劑選擇 將干燥的珠子參粉碎,過60目篩,稱取2.0g,分別選乙酸乙酯、乙醇、體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇及甲醇為提取溶劑,連續(xù)回流3次,合并、濃縮提取液,置于10.00mL容量瓶中,分別用色譜甲醇溶解、定容,過0.22μm有機(jī)濾膜,取20μL續(xù)濾液置于高效液相色譜儀進(jìn)行測定,結(jié)果列于表1.由表1可見,甲醇的提取效率最高,乙酸乙酯的提取效率最低,因此選擇甲醇作為提取溶劑.

    表1 不同提取溶劑所得24(R)-珠子參苷R1的峰面積Table 1 Peak areas of 24(R)-majoroside R1extracted by different extraction solvents

    2.3.2 提取溶劑用量選擇 將干燥的珠子參粉碎,過60目篩,精密稱取2.0g,將甲醇作為提取溶劑,考察每次提取用量為12,16,20mL時對待測物峰面積的影響,通過加熱回流的方式提取3次,分別用色譜甲醇定容至10.00mL,過0.22μm有機(jī)濾膜,取20μL續(xù)濾液置于高效液相色譜儀測定.結(jié)果列于表2.由表2可見,當(dāng)甲醇用量為16mL時,所得待測物的峰面積較大,因此甲醇的用量為16mL.

    表2 提取溶劑不同用量所得24(R)-珠子參苷R1的峰面積Table 2 Peak area of 24(R)-majoroside R1extracted at different solvent volumes

    2.3.3 提取次數(shù)的確定 將2.3.2中提取過3次的樣品,繼續(xù)提取1h,按1.5方法進(jìn)行處理,經(jīng)HPLC-ELSD測定,沒有待測物檢出,故提取次數(shù)確定為3次.

    綜上,確定提取條件為:將干燥的珠子參粉碎,過60目篩,精密稱取2.0g,分別用16mL甲醇連續(xù)回流3次,回流時間依次為1.5,1.0,1.0h,合并、濃縮提取液,以甲醇溶解,并定容至10.00mL.最佳條件下提取的24(R)-珠子參苷R1對照品和樣品的色譜如圖2所示.

    圖2 24(R)-珠子參苷R1 對照品(A)和珠子參樣品(B)的色譜Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)of 24(R)-majoroside R1

    3 方法與結(jié)果

    3.1 線性關(guān)系考察

    按照1.4方法制備1.00mg/mL對照品儲備液,精密移取0.20,0.50,1.00,2.00,5.00mL儲備液分別置于10.00mL容量瓶中,加色譜甲醇定容,得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液及對照品儲備液20μL置于高效液相色譜儀,平行測定3次,取平均值;以對照品進(jìn)樣量的lg m值為x軸、對照品峰面積的lg S值為y軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線,24(R)-珠子參苷R1的回歸方程為

    其線性范圍為0.40~20.0μg.

    3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

    將質(zhì)量濃度為0.1,0.2,0.5mg/mL的對照品溶液各20μL置于高效液相色譜儀中,分別連續(xù)進(jìn)樣6次(日內(nèi)精密度),測得24(R)-珠子參苷R1峰面積的RSD值分別為0.27%,0.52%和0.17%.連續(xù)進(jìn)樣3d,每天進(jìn)樣2次(日間精密度),測得24(R)-珠子參苷R1峰面積的RSD值分別為1.37%,1.61%和1.18%.

    3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    按1.5方法操作,制得6份供試品溶液,分別吸取20μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定,結(jié)果表明,24(R)-珠子參苷R1質(zhì)量濃度的RSD=0.96%(n=6).

    3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    按1.5方法制備供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,10h按上述色譜條件進(jìn)樣測定,結(jié)果表明,24(R)-珠子參苷R1峰面積的RSD為1.71%,供試品在10h內(nèi)完成測定即可.

    3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

    將干燥的珠子參樣品粉碎,過60目篩,精密稱取2.0g(化合物24(R)-珠子參苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.045 3%),共6份,每份均加入0.9mg的對照品,按1.5方法制備6份加標(biāo)供試品溶液.對其質(zhì)量濃度進(jìn)行測定,測得24(R)-珠子參苷R1的平均回收率為98.7%,其RSD=1.28%(n=6).

    3.6 樣品的測定

    將分別購于河北省安國市和云南省昆明市的珠子參樣品按1.5方法進(jìn)行處理,分別取質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的對照品溶液及2份樣品溶液各20μL置于高效液相色譜儀中,分別連續(xù)進(jìn)樣3次,記錄峰面積,測得河北省安國市和云南省昆明市的珠子參根莖中24(R)-珠子參苷R1的質(zhì)量比分別為3.06mg/g和0.45mg/g.

    綜上,本文采用HPLC-ELSD方法測定了不同產(chǎn)地珠子參根莖中新化合物24(R)-珠子參苷R1的質(zhì)量比,并對其方法學(xué)進(jìn)行了考察.結(jié)果表明,該方法可準(zhǔn)確、快速測定珠子參中24(R)-珠子參苷R1的質(zhì)量比,重復(fù)性及回收率較好,方法可靠.

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