一種呋喃西林酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

李泳寧 彭臻菲 黃慧 蔡美虹 林清清

摘要[目的]建立一種飼料中呋喃西林酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。[方法]利用制備的人工抗原和高特異性單克隆抗體，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫技術(shù)建立呋喃西林檢測(cè)方法。[結(jié)果]在優(yōu)化條件下，檢測(cè)抗原濃度為10 μg/mL，抗體稀釋度為1∶5 000。呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有較好的線性關(guān)系（R2=0.998 7），IC50為1.43 ng/mL。與呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代謝物氨基脲的交叉反應(yīng)率低于0.5%。飼料樣品中添加呋喃西林的平均回收率為87.5%～96.0%，變異系數(shù)為6.1%～9.7%。[結(jié)論]該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于飼料中呋喃西林的分析檢測(cè)。

關(guān)鍵詞呋喃西林;酶聯(lián)免疫檢測(cè);單克隆抗體;飼料

中圖分類號(hào)R446.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2020）04-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.056

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Establishment of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of Nitrofurazone

LI Yong-ning，PENG Zhen-fei，HUANG Hui et al（Fujian Health College，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350101）

Abstract[Objective]To establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for the determination of nitrofurazone in feed.[Method]The artificial antigen and the high specificity monoclonal antibodies against nitrofurazone were prepared.An indirect competitive ELISA for the determination of nitrofurazone in feed was established.[Result]The optimization of ELISA parameters were that the concentration of antigen was 10 μg/mL and the dilution multiples of antibodies was 1∶5 000.The good linear range was 0.1-10.0 ng/mL（R2=0.998 7） and IC50 was 1.43 ng/mL.The cross-reactivity （CR） rate was less than 0.5% with other nitrofurans such as furazolidone，furaltadone，furantoin and semicarbazide.The average recovery from artificially contaminated nitrofurazone of feed was 87.5%-96.0%，with coefficient of variation （CV） was 6.1%-9.7%.[Conclusion]The method developed is rapid，accurate and sensitive and will be helpful for rapid screening for nitrofurazone in feed.

Key wordsNitrofurazone;Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）;Monoclonal antibody;Feed

硝基呋喃類藥物是一類具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲(chóng)均有作用[1]。呋喃西林是硝基呋喃類代表藥物之一，具有殺菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，曾被廣泛使用在養(yǎng)殖業(yè)中。但越來(lái)越多的研究表明，硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物具有一定的毒性作用，可誘發(fā)癌癥[2]，尤其是呋喃西林代謝物氨基脲對(duì)人體有致癌、致畸胎等副作用[3]。因此，越來(lái)越多的國(guó)家嚴(yán)禁使用呋喃西林藥物，而2002年我國(guó)農(nóng)業(yè)部193號(hào)公告也禁止使用硝基呋喃類藥物在食用動(dòng)物上。但是由于呋喃西林使用效果明顯、價(jià)格便宜，目前仍然存在違規(guī)用藥情況。因此，對(duì)呋喃西林的檢測(cè)顯得尤為重要。

目前，呋喃西林的方法主要有高效液相色譜法[4-5]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-7]。其中，高效液相色譜法可靠性較強(qiáng)且重復(fù)性好，廣泛應(yīng)用于飼料以及動(dòng)物食品中的殘留檢測(cè)，最低檢出限可達(dá)1 μg/kg;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，最低檢出限可達(dá)0.50 μg/kg，但儀器設(shè)備要求高，檢測(cè)費(fèi)用成本昂貴。近年來(lái)快速發(fā)展的免疫檢測(cè)法具有檢測(cè)速度快、靈敏度高和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各類藥物殘留的檢測(cè)中，也是目前檢測(cè)的重要方向。由于呋喃西林在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，而其代謝物可在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定存在，一般采用檢測(cè)呋喃西林代謝物來(lái)判定食用動(dòng)物中是否存在藥物殘留，而對(duì)呋喃西林的免疫學(xué)檢測(cè)方法則報(bào)道較少。該研究利用合成的人工抗原和高特異性抗呋喃西林單克隆抗體建立呋喃西林免疫檢測(cè)方法，并進(jìn)行飼料中呋喃西林的檢測(cè)方法研究，可望用于飼料樣品的大量篩查。

1材料與方法

1.1材料與儀器呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、呋喃唑酮和呋喃妥因購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;呋喃它酮和呋喃西林代謝物氨基脲購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;卵清蛋白（ovalbumin，OVA）為Worthington公司產(chǎn)品;四甲基聯(lián)苯胺（3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB）為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京莊盟公司。其他試劑均為分析純。NFZ-OVA人工抗原和抗呋喃西林單克隆抗體由福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)藥工程中心制備。SpectraMax M3型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

該研究利用制備的抗呋喃西林高特異性單克隆抗體，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫技術(shù)建立呋喃西林檢測(cè)方法。結(jié)果表明，呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有較好的線性關(guān)系（R2=0.998 7），IC50為1.43 ng/mL。與呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代謝物氨基脲的交叉反應(yīng)率均低于0.5%。飼料樣品中添加3個(gè)濃度呋喃西林的回收率為87.5%～96.0%， CV值為6.1%～9.7%?？梢?jiàn)該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于飼料中呋喃西林的分析檢測(cè)。

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