紅茂草異紫堇堿對LPS誘導(dǎo)小鼠RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子的影響

王霞 王廷璞 袁毅君 高義霞 王鵬 趙強(qiáng) 趙仁生

摘要[目的]研究紅茂草異紫堇堿對細(xì)菌脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放炎性因子的影響。[方法]用CCK-8試劑盒方法檢測不同劑量紅茂草異紫堇堿（1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL）對RAW 264.7細(xì)胞的毒性作用;用硝酸酶還原法測定不同濃度紅茂草異紫堇堿（50、100、200和400 μg/mL）條件下細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度;用ELISA法測定添加不同濃度紅茂草異紫堇堿（100、200和400 μg/mL）干預(yù)4 h，再加入LPS（0.1 μg/mL）孵育20 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α的含量，通過上述方法測定的結(jié)果來評價紅茂草異紫堇堿的抗炎作用。[結(jié)果]紅茂草異紫堇堿濃度在15、25 μg/mL時，可顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞增殖（P≤0.05）;并且在紅茂草異紫堇堿存在條件下，促炎因子IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α釋放量都有不程度的降低，而抗炎因子IL-10和NO的釋放量有不同程度的升高。[結(jié)論]紅茂草異紫堇堿能夠抑制促炎因子IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α的釋放;另一方面能夠促進(jìn)抗炎因子IL-10和NO的釋放來抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞紅茂草異紫堇堿;RAW 264.7細(xì)胞;LPS;細(xì)胞炎癥因子

中圖分類號R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2020）04-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.051

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Isocorydine Alkaloid in Dicranostigma leptopodum （Maxim.） Fedde（DLF）on Inflammatory Factors in RAW264. 7 Cells Stimulated by LPS

WANG Xia，WANG Ting-pu，YUAN Yi-jun et al

（College of Bioengineering and Technology， Tianshui Normal University， Tianshui，Gansu 741001）

Abstract[Objective] To study the effects of isocorydine alkaloid in Dicranostigma leptopodum （Maxim.） Fedde （DLF） on secretion of inflammatory factors in RAW 264.7 cell stimulated by lipopolysaccharide，LPS. [Method]Toxic effect on RAW 264.7 cell with different doses of isocorydine alkaloid in DLF （ 1， 5， 15， 25， 50， 100， 200， 300 and 400 μg/mL） were detected by CCK 8 kit method. The concentration of NO in cell medium added different doses of isocorydine alkaloid in DLF （50， 100， 200 and 400 μg/mL） were detected by the enzyme nitrate reduction method. After pretreated with various concentration of isocorydine alkaloid in DLF（100， 200 and 400 μg/mL） 4 h. The cell were exposed to 0.1 μg/mL LPS for 20 h. The activity of interleukin 6（IL-6）、10（IL-10） and 1β（IL-1β）， PEG-2 and tumor necrosis factor α（TNF-α） as well as NO by ELISA and an Nitrate acid reductase. The anti-inflammatory effect was evaluated by above method. [Result] Concentration of isocorydine alkaloid in DLF were 15 and 25 μg/mL， which could promote RAW 264.7 cells proliferation significantly （P≤0.05）. Isocorydine alkaloid in DLF increased the secretion of IL-10 and NO as well as reduced IL-1β，IL-6，PEG-2 and TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells. [Conclusion] The anti-inflammatory effectory of isocorydine alkaloid in LDF may be mediated in part of by promoting IL-10 and NO and inhibiting the production of IL-1β，IL-6，PEG-2 and TNF-α.

Key wordsIsocorydine alkaloid in DLF;RAW 264.7 cells;LPS;Inflammatory factors

紅茂草[Dicranostigma leptopodum（Maxim.）Fedde，DLF] 罌粟科禿瘡花屬二年生或多年生草本植物，俗稱禿子花、禿瘡花、勒馬回（陜西），主要分布在云南西北部、四川西部、西藏、青海東部、甘肅南部及東南部、陜西秦嶺北坡、山西南部、河南西部、河北西南部，生于海拔400～2 900 m草坡、路邊、田埂、墻頭或屋頂[1]?！蛾兾髦胁菟帯酚涊d：“味苦、澀、性涼、清熱解毒，消腫，止痛，殺蟲。治扁桃體炎，牙痛，咽喉痛，淋巴結(jié)核，禿瘡，瘡癤疥癬，癰疽”[2]。紅茂草生物堿主要包括異紫堇堿、紫堇堿、原阿片堿和百屈菜堿，其中異紫堇堿的含量最高[3]。試驗研究證明，紅茂草素注射液對小鼠脾臟、紅細(xì)胞的吞噬功能會產(chǎn)生影響;低劑量紅茂草素注射液（0.2 g/kg）具有促進(jìn)紅細(xì)胞免疫黏附的作用，還能明顯促進(jìn)脾細(xì)胞分泌IL-2，且無劑量依賴關(guān)系;而5.0、1.0 g/kg 能使血清溶血素含量升高[4-6]。王廷璞等[7-10]研究發(fā)現(xiàn)紅茂草在一定濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞具有毒性作用，并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌有明顯的抑制作用 。毛愛紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)紅茂草生物堿對四氯化碳引起小鼠肝臟記性損傷具有很好的保護(hù)作用。龔艷妮等[12]研究表明紅茂草注射液可顯著促進(jìn)荷瘤小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖 。趙強(qiáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)紅茂草生物堿具有良好的安全性。紅茂草的異紫堇啡堿、原阿片堿藥理作用已有較廣泛的研究，而異紫堇堿的研究較少，主要集中在抗失血性休克、解痙、抗缺氧作用。

細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組分之一，其毒性成分主要為類脂質(zhì)A，感染后會產(chǎn)生毒性反應(yīng)。在人體免疫系統(tǒng)對抗細(xì)菌入侵時，LPS作為重要的抗原分子被抗原遞呈細(xì)胞（APC）捕獲，從而引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。體內(nèi)免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下會大量釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子，但是適量的炎癥因子可有利于免疫系統(tǒng)發(fā)揮正作用，如果過量就會對機(jī)體造成病理損傷，另一方面可能造成促發(fā)全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步引發(fā)多器官功能衰竭，甚至死亡的后果[14-17]。因此，LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞是研究炎癥機(jī)制的很好的炎癥細(xì)胞模型[18]。

目前關(guān)于紅茂草異紫堇堿體外抗炎作用機(jī)制的相關(guān)研究鮮見報道。因此天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院甘肅省高校農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實驗室和免疫學(xué)實驗室提取分離純化出紅茂草異紫堇堿，擬采用 LPS 誘使小鼠 RAW 264.7 巨噬細(xì)胞活化，建立體外炎癥模型，通過檢測紅茂草異紫堇堿對細(xì)胞上清中NO 的分泌量及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、PEG-2、TNF-α和IL-10 的分泌水平，旨在研究紅茂草異紫堇堿抗炎作用機(jī)制，從而判斷紅茂草異紫堇堿在機(jī)體外的抗炎效果，為深入研究紅茂草異紫堇堿體外抗炎作用機(jī)制打下基礎(chǔ)，也為其臨床應(yīng)用提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞。RAW 264.7細(xì)胞來源于ATCC，由北納聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)研究院代購。

1.1.2儀器及主要試劑。CK Model 680型酶標(biāo)儀，日本Bio-Rad公司;紅茂草異紫堇堿由天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院王廷璞研究員提供;LPS為sigma公司產(chǎn)品;IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α試劑盒購自欣博盛生物科技有限責(zé)任公司;NO試劑盒購自碧云天;胎牛血清購自gibico;DME/F12培養(yǎng)基購自Hyclon;cck-8 購自碧云天。

1.2方法

1.2.1紅茂草異紫堇堿對RAW 264.7細(xì)胞的毒性作用。

RAW 264.7細(xì)胞按4 000個/孔接入96孔板中，0.2 mL/孔，培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)基，每孔加入190 μL DME/F12培養(yǎng)基（含10% FBS），空白組加入10 μL PBS，其余各組分別加入紅茂草異紫堇堿，使其終濃度分別為1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL（分別記為1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL組），于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后在OD=450 nm處測定吸光度。各組做3個平行。

1.2.2不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響。

RAW 264.7細(xì)胞按4 000個/孔接入96孔板中，0.2 mL/孔，培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)基，每孔加入180 μL DME/F12培養(yǎng)基（含10% FBS），空白組和陰性對照組每孔加入10 μL PBS，其余各組分別加入紅茂草異紫堇堿，使其終濃度分別為50、100、200和400 μg/mL（分別記為50、100、200和400 μg/mL組），于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后空白組加入10 μL 的PBS，其余各孔加入10 μL的LPS（終濃度為0.05 μg/mL），與二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按NO試劑盒說明書測定NO 的濃度。各組做4個平行。

1.2.3不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和PEG-2的影響。

RAW 264.7細(xì)胞按6×104個/孔接入96孔板中，0.5 mL/孔，培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)基，每孔加入450 μL DME/F12培養(yǎng)基（含10% FBS），空白組和陰性對照組每孔加入25 μL PBS，其余各組分別加入紅茂草異紫堇堿，使其終濃度分別為100、200和400 μg/mL（分別記為100、200和400 μg/mL組），于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后空白組加入25 μL的PBS，其余各孔加入25 μL的LPS（終濃度為0.1 μg/mL），于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α試劑盒說明書測定IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α的濃度。各組做5個平行。

1.3試驗數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1紅茂草異紫堇堿對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

CCK-8試劑盒是一種基于WST-8化合物而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的測定。細(xì)胞增殖越多越快，則試劑盒反應(yīng)顏色越深;細(xì)胞毒性越大，細(xì)胞被抑制增殖，則顏色越淺。由表1可知，紅茂草異紫堇堿濃度在1和5 μg/mL時，紅茂草異紫堇堿促進(jìn)RAW 264.7 細(xì)胞增殖效果十分顯著（P≤0.01）;其濃度在15、25 μg/mL時，紅茂草異紫堇堿可顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞增殖（P≤0.05）;紅茂草異紫堇堿在50、100、200、300和400 μg/mL與空白組相比也可促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞增殖（P>0.05）。以上結(jié)果表明，紅茂草異紫堇堿能促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞增殖，在較低濃度時促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞增殖效果比較明顯，在高濃度時也可促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞增殖，但沒有低濃度時效果顯著。

2.2不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響

用不同濃度的紅茂草異紫堇堿干預(yù)4 h后加入LPS（0.05 μg/mL）共同孵育20 h，用一氧化氮試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度。由表2可知，紅茂草異紫堇堿可顯著促進(jìn)抗炎因子NO的釋放（P≤0.05），并且隨著紅茂草異紫堇堿濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度也隨之

增高。在細(xì)胞內(nèi)NO可作為信號分子，參與細(xì)胞內(nèi)炎癥信號

轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，以上試驗結(jié)果表明，紅茂草異紫堇堿可能是通過促進(jìn)NO分子的釋放來抑制細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。

2.3不同濃度紅茂草異紫堇堿對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和PEG-2的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入紅茂草異紫堇堿干預(yù)4 h，加入LPS（0.1 μg/mL）孵育20 h后檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子和PEG-2的濃度。

由表3可知，空白組中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度較低，與陰性對照組相比LPS的加入可十分顯著地促進(jìn)TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放（P≤0.01）。在200和400 μg/mL的紅茂草異紫堇堿的濃度條件下，可顯著抑制RAW 264.7細(xì)胞對TNF-α的釋放（P≤0.05），與陰性組相比，100 μg/mL的紅茂草異紫堇堿也可抑制TNF-α的釋放，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;在100、200和400 μg/mL的紅茂草異紫堇堿濃度條件下，不能顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β的濃度（P>0.05），但從變化趨勢分析，當(dāng)紅茂草異紫堇堿的濃度為400 μg/mL，可以抑制RAW 264.7細(xì)胞釋放IL-1β;在200和400 μg/mL的濃度條件下的紅茂草異紫堇堿可顯著抑制RAW 264.7細(xì)胞釋放IL-6（P≤0.05，P≤0.01）;與陰性組相比，100 μg/mL濃度條件下的紅茂草異紫堇堿也可抑制IL-6的釋放，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

紅茂草異紫堇堿濃度在100、200和400 μg/mL 的條件下可顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞釋放抗炎因子IL-10（P≤0.05），隨著其濃度的增大抗炎因子的釋放量也隨之增大;在200和400 μg/mL濃度條件下的紅茂草異紫堇堿可顯著抑制RAW 264.7細(xì)胞釋放炎癥因子PEG-2（P≤0.05），其濃度為100 μg/mL時，與陰性對照組相比，紅茂草異紫堇堿也可抑制RAW 264.7細(xì)胞釋放PEG-2，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。由此可見，紅茂草異紫堇堿可以抑制促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放，且隨著紅茂草異紫堇堿濃度的增加，抑制作用也表現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)。紅茂草異紫堇堿通過促進(jìn)抗炎因子IL-10和抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和PEG-2的釋放來發(fā)揮其抗炎作用。

綜上試驗結(jié)果推測，紅茂草異紫堇堿干擾LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、PEG-2、TNF-α的釋放，另一方面促進(jìn)IL-10的釋放和NO的分泌發(fā)揮抗炎作用。

3討論與結(jié)論

炎癥反應(yīng)是臨床常見的病理過程，近來有文獻(xiàn)報道核因子-κB（NF-κB）和有絲分裂原激活磷酸激酶（MAPKs）的激活可以調(diào)節(jié)炎性因子[19-21]，并且炎癥過程中細(xì)胞會產(chǎn)生一系列因子可能會影響線粒體功能[22-23]。除此之外，脂多糖（LPS）為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分也能夠誘導(dǎo)機(jī)體全身性炎癥反應(yīng)，在體外常用于刺激免疫細(xì)胞來篩選抗炎藥物[24]。

LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶，進(jìn)而合成大量的NO氣體分子。在免疫性炎癥發(fā)病進(jìn)程中，體內(nèi)NO 水平升高可從多個途徑影響病理進(jìn)程[25-26]，NO是具有生物氣體分子，濃度的變化可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信息的傳遞，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮很重要的作用[27-28]。該研究發(fā)現(xiàn)紅茂草異紫堇堿濃度在1～400μg/mL時，對RAW 264.7 細(xì)胞無毒害作用。紅茂草異紫堇堿可通過促進(jìn)NO的釋放從而起到抗炎作用，隨著紅茂草異紫堇堿濃度的增大，在細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度也隨之增大。

LPS能夠誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌炎性因子，如NO、IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α等[29]。在正常水平下它們參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、發(fā)揮抗感染的作用。但是隨著這些炎癥因子在體內(nèi)的濃度增大，它們可刺激免疫細(xì)胞和非免疫免疫細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子（如IL-18、E-選擇素和ICAM-1等），從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。IL-10是一種抗炎因子，主要通過活化巨噬細(xì)胞來發(fā)揮其抗炎作用;IL-6在獲得性免疫和先天性免疫中發(fā)揮重要的作用，它通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性在慢性炎癥中發(fā)揮重要的作用;IL-1β作為一種促炎因子，主要在炎癥反應(yīng)初期發(fā)揮作用，IL-1β通過旁分泌和自分泌的方式誘導(dǎo)其他促炎因子的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，從而加重組織的炎癥反應(yīng);TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起主要的作用;PEG-2在體內(nèi)是一種重要的促炎因子，IL-1β刺激細(xì)胞產(chǎn)生并向炎癥部位聚集，進(jìn)一步對組織造成損傷[29]。