大孔吸附樹脂分離純化牛蒡葉綠原酸的工藝研究

袁曉慶 李莉 劉言娟 王振

摘要[目的]建立大孔吸附樹脂分離純化牛蒡葉中綠原酸的工藝。[方法]通過單因素試驗(yàn)研究提取液種類、濃度、pH、提取溫度、料液比以及提取時(shí)間等參數(shù)對綠原酸提取率的影響，確定最佳提取工藝;以大孔吸附樹脂對牛蒡葉中綠原酸的分離效率為評價(jià)指標(biāo)，通過靜態(tài)和動態(tài)吸附/解吸附試驗(yàn)優(yōu)化分離純化工藝。[結(jié)果]pH=1的蒸餾水為提取溶劑，料液比1∶20（g∶mL）、提取溫度80 ℃、回流1 h時(shí)對牛蒡葉中綠原酸的提取效果最佳，平均提取率為1.82%;考察了6種大孔吸附樹脂對牛蒡葉綠原酸的分離純化性能，以吸附/解吸附性能為評價(jià)指標(biāo)，確定了LX-218為最佳大孔吸附樹脂。LX-218型MAR分離純化牛蒡葉綠原酸的最佳工藝條件為：上樣量為30 BV（樹脂床體積），上樣濃度為0.7倍提取原液濃度（相當(dāng)于原生藥），上樣液pH=3，以4 BV/h流速吸附，5 BV pH=5的60%乙醇以5 BV/h的流速解吸附。在優(yōu)化的工藝條件下，牛蒡葉綠原酸得率為84.41%，純度為55.26%。[結(jié)論]LX-218型大孔吸附樹脂對牛蒡葉綠原酸有較好的吸附容量和解吸附率，優(yōu)化的生產(chǎn)工藝條件適用于牛蒡葉綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞牛蒡葉;大孔吸附樹脂;綠原酸;分離純化;工藝優(yōu)化

中圖分類號R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2020）04-0168-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.049

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Technology of Separation and Purification of Chlorogenic Acid from Burdock Leaves by Macroporous Adsorption Resin

YUAN Xiao-qing，LI Li，LIU Yan-juan et al（Linyi University，Linyi，Shandong 276000）

Abstract[Objective]To establish the optimum technological conditions for the separation and purification of chlorogenic acid from burdock leaves by macroporous adsorption resin（MAR）.[Method]The optimum extraction process was obtained by studying the effects of extractant type，concentration，pH，extraction temperature，ratio of solid-liquid ratio and extraction time with single factor experiment.Based on separation efficiency of chlorogenic acid from burdock leaves，the optimal separation and purification processes were obtained by static and dynamic adsorption/desorption experiments.[Result]The optimum extraction process as follows：the extractant was distilled water with pH=1，the ratio of solid-liquid ratio was 1：20（g：mL），the extraction temperature was 80 °C，the reflux time was 1 h.The average extraction rate was 1.82% with the above extraction process.The separation and purification performance of six kinds of macroporous adsorption resins for burdock chlorogenic acid were investigated.Taking adsorption / desorption performance as the evaluation index，LX-218 was determined as the best macroporous adsorption resin.The optimal process conditions on LX-218 MAR for the separation and purification of burdock chlorophyllic acid as follows：the loading amount was 30 BV（resin bed volume），the loading concentration was 0.7 times the concentration of the extracted stock solution（equivalent to raw material），and the loading solution pH=3，adsorption at 4 BV/h flow rate，respectively.For the desorption process，chlorogenic acid loaded MAR column was desorbed by 5 BV ethanol-aqueous solution（60∶40，V∶V） with pH value of 5 at flow rate of 5 BV/h.Under the optimal conditions，the yield of chlorogenic acid from burdock leaves and purity were 84.41% and 55.26%，respectively.[Conclusion]LX-218 macroporous adsorption resin has good adsorption and desorption performance for chlorogenic acid.The optimized technique is suitable for the industrial production of chlorogenic acid from burdock leaves.

Key wordsBurdock leaves;Macroporous adsorption resin;Chlorogenic acid;Separation and purification;Process optimization

牛蒡又名大力子、惡實(shí)、牛蒡子，屬于菊科類植物，近年來作為保健型蔬菜受到人們的青睞。它全身是寶，其子、根均可入藥，富含糖、纖維素、蛋白質(zhì)、鈣、鐵等人體所需的多種營養(yǎng)物質(zhì)和礦物質(zhì)等[1-2]。我國是牛蒡生產(chǎn)大國，僅臨沂市蘭陵縣的莊塢、層山、二廟等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，種植面積達(dá)0.67萬hm2以上，縣外發(fā)展種植基地0.80萬hm2以上，年總產(chǎn)量約70萬t，占全國牛蒡產(chǎn)量的50%以上。每年會有大約15萬t的牛蒡莖葉產(chǎn)生，但是這些牛蒡莖和葉絕大部分被廢棄，沒有被充分利用起來，這不僅給環(huán)境造成了嚴(yán)重污染也浪費(fèi)了資源，通過MAR分離純化牛蒡葉提取液中的綠原酸，可獲得純度較高的綠原酸，能很好地實(shí)現(xiàn)廢物利用[3]。此工藝能夠延長牛蒡的產(chǎn)業(yè)鏈，提高其附加值。目前，分離純化天然產(chǎn)物的方法應(yīng)用較多的有大孔吸附樹脂（macroporous adsorption resin，MAR）柱色譜、硅膠柱色譜、制備液相色譜和逆流色譜等，這些技術(shù)方法在有效成分的分離純化中得到了不同程度的應(yīng)用。其中MAR技術(shù)因具有吸附量大、選擇性好、再生容易等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的分離純化中有廣泛應(yīng)用。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于苷類、黃酮類、皂苷類、生物堿類等多種天然產(chǎn)物的分離與純化中[4-6]。

綠原酸具有抗腫瘤、降壓、抗氧化、提高人體免疫力等多種生物活性，且與同類藥物相比，副作用較少。對急性咽喉炎癥和皮膚病有明顯療效，臨床上用于治療急性細(xì)菌性感染疾病及放化療時(shí)所致的白細(xì)胞減少癥，對月經(jīng)過多、子宮功能性出血有良好的止血效果[7-10]。該研究旨在確定牛蒡葉綠原酸的最佳提取工藝，優(yōu)選出一種適合純化牛蒡葉綠原酸的MAR，并對優(yōu)選出的MAR純化牛蒡葉綠原酸時(shí)的各項(xiàng)工藝條件及參數(shù)進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1儀器。KQ-250DB超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）;SHK-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科泰試驗(yàn)設(shè)備有限公司）; DHG-9035A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）;ST-06型300 g多功能粉碎機(jī)（永康市帥通工具有限公司）;Agilent1260 型高效液相色譜儀（G1329進(jìn)樣器，G1314F檢測器，G1311C四元泵，G1316A柱溫箱，ChemStation色譜工作站，美國安捷倫公司）;SHA-B 多功能水浴恒溫振蕩器（江蘇正基儀器有限公司）;BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;DF-101集熱式磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;ZD-85A氣浴恒溫振蕩器（常州潤華電器有限公司）;TC-C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司）。

1.1.2試劑。鹽酸（分析純，天津恒興化學(xué)制劑有限公司）;氫氧化鈉（分析純，天津恒興化學(xué)制劑有限公司）;醋酸（分析純，阿拉丁試劑有限公司）;乙醇（分析純，天津永大化學(xué)制劑有限公司）;甲醇（色譜純，Tedia Company）;碳酸鈉（分析純，天津恒興化學(xué)制劑有限公司）;綠原酸（純度98%，中國食品藥品檢定研究院）;LX-N2、LX-T28、AB-8、D101、LX-26 和LX-218型大孔吸附樹脂（西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司）。

1.1.3試材。牛蒡葉采自山東省臨沂市蘭陵縣，經(jīng)臨沂大學(xué)藥學(xué)院劉林教授鑒定為菊科類植物牛蒡Arctium lappa L.的葉。牛蒡葉洗凈，于60 ℃烘箱中干燥后，粉碎過60目篩，備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1對照品溶液的配制。取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品約2.5 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解，稀釋并定容至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的對照品溶液。

1.2.2供試品溶液的制備。分別取牛蒡葉提取液、過MAR柱的吸附殘液和洗脫液各10 mL，分別置于蒸發(fā)皿中蒸干，所得殘?jiān)眉状既芙猓謩e將其轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，過濾后取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。高效液相色譜條件：色譜柱為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫25 ℃;流動相為甲醇（A）+2.5%醋酸（B）;梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，25%A， 5～17 min，30%A;檢測波長326 nm;進(jìn)樣量10 μL;流速1.0 mL/min。

精密吸取“1.2.1”對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置于5 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度，得一系列綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、綠原酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出其回歸方程為Y=32 176X-97.517（R2=0.999 8），表明綠原酸對照品在10～100 μg/mL與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.4牛蒡葉綠原酸提取方法的優(yōu)化。

對影響綠原酸提取率的各項(xiàng)參數(shù)包括提取溶劑、提取溶劑pH、提取時(shí)間、提取溫度、料液比等進(jìn)行考察，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。按照“1.2.3”中的方法對牛蒡葉提取物中綠原酸含量進(jìn)行檢測，按照公式（1）計(jì)算不同提取條件下牛蒡葉綠原酸的提取率。

提取率=提取液中綠原酸的質(zhì)量濃度（μg/mL）×提取液的體積（mL）×10-6牛蒡葉粉末質(zhì)量（g）×100%（1）

1.2.5MAR預(yù)處理。該研究考察LX-N2、LX-T28、AB-8、D101、LX-26 和LX-218型MAR對牛蒡葉綠原酸的分離純化效果。6種MAR的各項(xiàng)理化參數(shù)如表2所示。在MAR的制備過程中，大量無機(jī)雜質(zhì)、致孔劑以及高分子單體等物質(zhì)會摻雜于其表面和空隙中，這些雜質(zhì)會影響MAR的穩(wěn)定性、洗脫物質(zhì)和再生回收液的純度等。因此在MAR使用前，必須對其進(jìn)行預(yù)處理以除去雜質(zhì)。預(yù)處理MAR的方法為：分別稱取6種MAR一定量，分別將其浸泡至95%乙醇中24 h，浸泡完畢，用蒸餾水洗滌各型號MAR至無醇味;用5%的HCl浸泡3 h，然后用蒸餾水洗至中性;5%的NaOH浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性[11]。

1.2.6MAR的篩選。

利用靜態(tài)吸附/解吸附試驗(yàn)對MAR進(jìn)行篩選。稱取預(yù)處理好的各型號MAR（相當(dāng)于干樹脂約1.5 g），分別置于250 mL具塞錐形瓶中，分別加入牛蒡提取液100 mL，于25 ℃恒溫振蕩器中恒溫振蕩24 h，進(jìn)行MAR的靜態(tài)吸附。吸附完成后，根據(jù)“1.2.3”中的方法測定原提取液、吸附殘液中綠原酸的含量，并根據(jù)公式（2）和（3）計(jì)算MAR的吸附量及吸附率。將靜態(tài)吸附后的MAR用80 mL 60%乙醇恒溫振蕩24 h，進(jìn)行解吸附，根據(jù)“1.2.3”中的方法測定解吸液中綠原酸含量，根據(jù)公式（4）和（5）分別計(jì)算各型號MAR的解吸附量和解吸附率[12-13]。

Qa=（Co-Cm ）×V/W（2）

Ea=（Co-Cm ）/Co×100%（3）

Qn=Cr×V/W（4）

Ed=Qn/Qa×100%（5）

式中，Qa為吸附量（mg/g）;C0為吸附液起始濃度（mg/mL）;Cm為吸附液平衡濃度（mg/mL）;V為溶液體積（mL）;W為樹脂重量（g）;Ea為吸附率（%）;Cr為解吸液平衡濃度（mg/mL）;Qn為解吸附量（mg/g）;Ed為解吸附率（%）。

1.2.7MAR分離純化工藝優(yōu)化。

對影響MAR分離純化效果的各項(xiàng)參數(shù)包括動態(tài)吸附流速、上樣液pH、上樣液濃度、上樣量、解吸液濃度、解吸液pH、解吸液流速和解吸液用量進(jìn)行考察。按照“1.2.3”中的方法對吸附殘液和提取液中的綠原酸含量進(jìn)行檢測，根據(jù)公式（2）和（3）計(jì)算MAR的吸附量及吸附率。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑對牛蒡葉綠原酸提取率的影響準(zhǔn)確稱取6份相同質(zhì)量的牛蒡葉粉末，每份10 g，分別選用蒸餾水、30%、50%、60%、70%和90%乙醇作為提取劑，在溫度為80 ℃、料液比1∶14、提取時(shí)間3 h的條件下對牛蒡葉進(jìn)行提取，按照“1.2.3”中的方法對提取液中綠原酸含量進(jìn)行檢測，按照公式（1）計(jì)算牛蒡葉綠原酸的提取率。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在其他條件不變時(shí)，以蒸餾水為提取溶劑時(shí)牛蒡葉綠原酸的提取率最好，且利用水作為提取溶劑，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合工業(yè)生產(chǎn)，所以該研究采用水作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2pH對牛蒡葉綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取9份相同質(zhì)量的牛蒡葉粉末，每份10 g，調(diào)節(jié)提取溶劑pH使其分別為1、2、3、4、5、6、7、8和10。在溫度為80 ℃、料液比1∶14、提取時(shí)間3 h的條件下對牛蒡葉進(jìn)行提取，按照“1.2.3”中的方法對綠原酸含量進(jìn)行檢測，按照公式（1）對綠原酸提取率進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著pH的逐漸增大，牛蒡葉綠原酸的提取率逐漸降低。在其他條件不變時(shí)，提取液pH=1時(shí)綠原酸提取率最好。出現(xiàn)這一規(guī)律的原因可能是因?yàn)榫G原酸的解離常數(shù)（pKa）為3.90，有研究報(bào)道[14]，提取酸性物質(zhì)時(shí)，提取溶劑的pH比目標(biāo)物的pKa值低1～2時(shí)有較好的提取效果。綜合以上條件，該研究選取提取液的pH為1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3溫度對牛蒡葉綠原酸提取率的影響準(zhǔn)確稱取5份相同質(zhì)量的牛蒡葉粉末，每份10 g，用pH=1的蒸餾水為提取溶劑，分別在50、60、70、80、90和100 ℃溫度下，在料液比1∶14、提取時(shí)間為3 h的條件下對牛蒡葉中的綠原酸進(jìn)行提取，按照“1.2.3”中的方法對綠原酸含量進(jìn)行檢測，按照公式（1）計(jì)算不同提取溫度時(shí)牛蒡葉綠原酸的提取率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在50～100 ℃隨著溫度的升高，牛蒡葉綠原酸的提取率先增大后降低，90 ℃時(shí)提取率最高，但是80與90 ℃時(shí)的提取率相差很小。綜合考慮能量消耗和綠原酸的穩(wěn)定性問題，該研究選取80 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4提取時(shí)間對牛蒡葉綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份相同質(zhì)量的牛蒡葉粉末，每份10 g，以pH=1的蒸餾水為提取溶劑，料液比1∶14，在溫度為80 ℃，提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h的條件下對牛蒡葉中的綠原酸進(jìn)行提取，按照“1.2.3”中的方法對綠原酸含量進(jìn)行檢測，按照公式（1）計(jì)算不同提取時(shí)間下牛蒡葉綠原酸的提取率，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在0.5～1.0 h時(shí)牛蒡葉綠原酸的提取率隨著提取時(shí)間的延長而增大，1 h后隨著時(shí)間的延長，提取率反而有所下降。這可能是由于綠原酸的二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，長時(shí)間加熱，使其氧化分解，綠原酸含量降低，所以該研究選用提取時(shí)間為1 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5料液比對牛蒡葉綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6份相同質(zhì)量的牛蒡葉粉末，每份10 g，以pH=1的蒸餾水為提取溶劑，在溫度為80 ℃、提取時(shí)間1 h，料液比分別為1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶30、1∶40的條件下對牛蒡葉中的綠原酸進(jìn)行提取，按照“1.2.3”中的方法對綠原酸含量進(jìn)行檢測，按照公式（1）計(jì)算按不同料液比進(jìn)行提取時(shí)牛蒡葉綠原酸的提取率，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在其他條件不變時(shí)，隨著料液比的減小，提取率逐漸增大，但是在料液比1∶20以后，繼續(xù)增大提取溶劑的量，提取率變化不大，所以該研究采用料液比1∶20進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.6牛蒡葉綠原酸的最佳提取工藝

綜上所述，牛蒡葉綠原酸的最佳提取工藝為提取溶劑為pH=1的蒸餾水，提取溫度為80 ℃，提取料液比為1∶20，提取時(shí)間為1 h。

2.7最佳MAR的考察

利用靜態(tài)吸附/解吸附試驗(yàn)對MAR進(jìn)行篩選。分別考察各型號樹脂對牛蒡葉綠原酸的吸附與解吸附性能，根據(jù)公式（2）和（3）計(jì)算MAR的吸附量及吸附率，根據(jù)公式（4）和（5）分別計(jì)算各型號MAR的解吸附量和解吸附率，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，LX-218型MAR的吸附率（Ea）最高，AB-8樹脂的解吸附率（Ed）最好，但吸附率比LX-218差。由于解吸液pH對解吸附率有較大影響，因此按照“1.2.6”中的方法考察60%乙醇在不同pH時(shí)對LX-218和AB-8這2種樹脂上所吸附目標(biāo)物的解吸附能力。調(diào)節(jié)60%乙醇解吸液的pH分別為1、3、5和7對LX-218和AB-8 2種樹脂上的目標(biāo)物進(jìn)行解吸附，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，解吸液pH對其洗脫能力有較大的影響，60%乙醇在pH為5時(shí)，LX-218型MAR對綠原酸解吸附能力最強(qiáng)。此時(shí)LX-218型MAR對牛蒡葉綠原酸的解吸附率達(dá)92.17%，遠(yuǎn)高于目標(biāo)物在AB-8上的解吸附率。綜合考慮吸附率與解吸附率，最終選擇LX-218型MAR進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.8MAR分離純化工藝的優(yōu)化

2.8.1動態(tài)吸附流速的考察。

精密量取按“2.6”方法制備的提取液4份，每份20 BV，分別以2、4、6和8 BV/h的流速在規(guī)格、徑高比等完全相同的MAR柱上進(jìn)行吸附，收集吸附殘液。分別將吸附殘液和提取液濃縮，然后于60 ℃真空干燥箱中干燥，用10 mL甲醇復(fù)溶，按照“1.2.3”方法對吸附殘液和提取液中的綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算吸附率，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，動態(tài)吸附流速越小，LX-218樹脂對牛蒡葉綠原酸的吸附容量越大。一般來說，動態(tài)吸附流速增大對目標(biāo)物在MAR柱上的吸附容量是不利的。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于流速增加會導(dǎo)致目標(biāo)物分子沒有足夠的時(shí)間進(jìn)入MAR的孔道，也沒有足夠的時(shí)間與MAR表面的活性位點(diǎn)發(fā)生充分作用。由圖6可知，以4 BV/h上樣的吸附率與2 BV/h 時(shí)沒有明顯差異，流速大于4 BV/h以后吸附率降低顯著，從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，流速較低會延長生產(chǎn)周期，不利于生產(chǎn)效率。綜合考慮，該研究選擇4 BV/h作為最佳吸附流速進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.8.2上樣液pH的考察。

由于綠原酸是酸性物質(zhì)，因此所處環(huán)境的pH對其存在形式有較大的影響，從而影響綠原酸與MAR之間相互作用力的強(qiáng)弱，該研究考察了樣品溶液pH對吸附率的影響。精密量取按“2.6”方法制備的提取液8份，每份20 BV，分別將其pH調(diào)節(jié)為1、2、3、4、5、6、7和8，然后在相同的MAR柱上進(jìn)行吸附，收集吸附殘液。分別將吸附殘液和提取液濃縮，然后于60 ℃真空干燥箱中干燥，用10 mL 甲醇復(fù)溶，按照“1.2.3”方法對吸附殘液和提取液中的綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算吸附率，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，隨著樣品溶液pH的增大，LX-218型MAR對牛蒡葉綠原酸的吸附率先增大后降低，當(dāng)上樣液pH=3時(shí)，MAR對綠原酸的吸附率最高。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是綠原酸是咖啡酸與奎尼酸酯化得到的，因而既能被酸也能被堿催化水解。在pH為1～3時(shí)，綠原酸水溶液水解的一級動力學(xué)方程反應(yīng)常數(shù)k值趨小，可推斷其反應(yīng)機(jī)制為酸催化的水解反應(yīng);在pH為3～8時(shí)，反應(yīng)常數(shù)k值趨大，可推斷其反應(yīng)機(jī)制為堿催化的水解反應(yīng);其水溶液在pH=3時(shí)最穩(wěn)定，因?yàn)榫G原酸在pH為3時(shí)最穩(wěn)定，以分子形式存在，與MAR活性位點(diǎn)之間的作用力較大，因此在該pH下，LX-218型MAR對牛蒡葉綠原酸有較大的吸附容量，該研究選取3作為樣品溶液的最佳pH進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.8.3上樣液濃度的考察。取牛蒡葉提取液20 BV 4份，分別將其稀釋至原提取液體積的1.0、0.7、0.5和0.3倍，取上述4種不同濃度的樣品溶液20 BV，分別將其pH調(diào)節(jié)為3，以4 BV/h 的動態(tài)吸附流速上樣，然后在相同的MAR柱上進(jìn)行吸附，收集吸附殘液。分別將吸附殘液和提取液濃縮，然后于60 ℃真空干燥箱中干燥，用10 mL甲醇復(fù)溶，按照“1.2.3”方法對吸附殘液和提取液中的綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算吸附率，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，隨著上樣液濃度的減小，樹脂對綠原酸的吸附率下降，但原提取液濃度和0.7倍原提取液濃度時(shí)，吸附率變化不大，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上樣液為原液濃度時(shí)，流速會逐漸減慢，可能是因?yàn)長X-218樹脂的粒徑太小，上樣液濃度過高，雜質(zhì)較多造成柱子堵塞，流速減小[15]。考慮上述因素，該試驗(yàn)采用0.7倍原提取液濃度作為上樣液濃度。

2.8.4上樣量的考察。

調(diào)節(jié)牛蒡葉提取液pH為3，上樣液濃度為0.7倍原液濃度，以4 BV/h的動態(tài)吸附流速上樣，按照MAR柱床體積收集流出液，流出液經(jīng)濃縮，60 ℃真空干燥箱中干燥，然后分別用10 mL甲醇復(fù)溶，按照“1.2.3”方法對吸附殘液中的綠原酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，上樣量為20 BV時(shí)樹脂柱開始泄漏，當(dāng)上樣量達(dá)30 BV時(shí)達(dá)到吸附飽和，因此該研究選擇30 BV作為最佳上樣量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[16]。

2.8.5解吸液濃度的考察。

精密量取提取液30 BV，上樣液濃度為0.7倍原提取液濃度，調(diào)節(jié)溶液pH為3，在MAR柱上以4 BV/h的流速上樣吸附，收集吸附殘液。然后，分別用5 BV 的0、30%、60%和90%乙醇以6 BV/h的流速進(jìn)行梯度解吸附，收集解吸液。將吸附殘液和解吸附液濃縮后于60 ℃真空干燥箱中烘干，10 mL甲醇復(fù)溶，按照“1.2.3”方法對吸附殘液和解吸液中綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算解吸附率，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，隨著乙醇濃度的增大，樹脂的解吸附率增大。當(dāng)乙醇濃度為90% 時(shí)，解吸附率最大。但90%乙醇進(jìn)行解吸附時(shí)，解吸液中雜質(zhì)含量較高，達(dá)不到較好的純化效果。當(dāng)60%乙醇進(jìn)行解吸附時(shí)，其解吸附率與90%乙醇的解吸附率相差不大，因此，綜合經(jīng)濟(jì)消耗以及洗脫液純度問題，該研究選擇最佳的解吸液為60%乙醇。

2.8.6解吸液pH的考察。

精密量取牛蒡葉提取液30 BV，上樣液濃度為0.7倍原提取液濃度，調(diào)節(jié)溶液pH為3，在MAR柱上以4 BV/h的流速上樣吸附，收集吸附殘液，分別用5 BV pH分別為1、3、5、7和8的60%乙醇進(jìn)行解吸附，收集解吸液，將吸附殘液和解吸附液濃縮后于60 ℃真空干燥箱中烘干，10 mL甲醇復(fù)溶，按照

“1.2.3”方法對吸附殘液和解吸液中綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算解吸附率，結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，當(dāng)pH為5時(shí)，解吸液對LX-218上的牛蒡葉綠原酸有最好的解吸附率，故該研究選用pH為5的解吸液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.8.7解吸液流速的考察。

精密量取牛蒡葉提取液30 BV，上樣液濃度為0.7倍原提取液濃度，調(diào)節(jié)溶液pH為3，在MAR柱上以4 BV/h的流速上樣吸附，收集吸附殘液，取pH=5的60%乙醇5 BV，然后分別以2、3、4、5、6和7 BV/h的流速進(jìn)行解吸附，收集解吸附液。將吸附殘液和解吸液濃縮后于60 ℃真空干燥箱中烘干，10 mL甲醇復(fù)溶，按照“1.2.3”方法對吸附殘液和解吸液中綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算解吸附率，結(jié)果如圖12所示。

由圖12可知，隨著解吸附流速的增大，牛蒡葉綠原酸在LX-218上的解吸附率逐漸減小。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是解吸液流速較大時(shí)，吸附在LX-218孔道中的牛蒡葉綠原酸不能及時(shí)地從中傳質(zhì)出來。圖12顯示，流速在3～5 BV/h增大時(shí)解吸附率降低程度較小，大于5 BV/h以后解吸附率迅速下降。綜合考慮生產(chǎn)效率與目標(biāo)物解吸附率，該研究采用5 BV/h作為解吸液流速進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.8.8解吸液用量的考察。

吸附飽和的LX-218型MAR柱用pH=5的60%乙醇以5 BV/h的流速進(jìn)行解吸附，按照樹脂柱床體積收集解吸液，濃縮后于60 ℃真空干燥箱中烘干，10 mL甲醇復(fù)溶，按照“1.2.3”方法對解吸液中綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算流出液中綠原酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖13所示。由圖13可知，當(dāng)pH=5的60%乙醇用量為5 BV時(shí)，目標(biāo)物基本達(dá)到解吸附終點(diǎn)。因此，最佳解吸液用量為5 BV。

2.9最佳工藝放大驗(yàn)證

牛蒡葉粉末以pH=1的蒸餾水為提取溶劑，在料液比1∶20、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h的條件下進(jìn)行提取。量取pH=3的牛蒡葉提取液30 BV，上樣液濃度為0.7倍原提取液濃度，于LX-218型MAR柱（4.5 cm×40 cm）上，以4 BV/h的動態(tài)吸附流速上樣，收集吸附殘液，再用5 BV pH=5的60%乙醇以5 BV/h的流速進(jìn)行解吸附。收集解吸液，將吸附殘液和解吸液濃縮后于60 ℃真空干燥箱中烘干，10 mL甲醇復(fù)溶，按照

“1.2.3”方法對吸附殘液和解吸液中綠原酸含量進(jìn)行檢測，計(jì)算得吸附容量為38.21 mg/g、解吸附率為94.7%，綠原酸得率為84.41%，綠原酸純度為55.26%。

3結(jié)論與討論

該研究首先確定牛蒡葉綠原酸的最佳提取工藝，對提取溶劑、提取時(shí)間和料液比等影響因素進(jìn)行了考察，最終確定最佳提取工藝為：提取溶劑為pH=1的蒸餾水，牛蒡葉粉末與提取溶劑的料液比為1∶20，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為1 h。通過靜態(tài)吸附試驗(yàn)測定6種極性不同的MAR對牛蒡葉綠原酸的吸附特性，包括強(qiáng)極性的MARLX-N2、中等極性的MARLX-T28、弱極性的MARAB-8和D101以及非極性的MARLX-26和LX-218。MAR對目標(biāo)物的分離純化是基于其表面的活性位點(diǎn)與目標(biāo)化合物之間的相互作用力（范德華引力或氫鍵作用）和樹脂多孔性的篩分作用共同作用的結(jié)果。該研究中的6種MAR雖然極性不同，但是其對目標(biāo)物的吸附容量差異不大，由此說明6種MAR對牛蒡葉綠原酸的吸附作用是以樹脂孔道的篩分作用為主。綜合比較6種MAR對牛蒡葉綠原酸的吸附量和解吸附率，結(jié)果表明，LX-218對綠原酸具有較好的吸附與解吸附性能，故確定LX-218作為最佳吸附樹脂。該研究通過對MAR分離純化牛蒡葉綠原酸工藝條件、影響參數(shù)等的系統(tǒng)研究，在優(yōu)化的條件下，牛蒡葉綠原酸的回收率和純度分別為84.41%和55.26%，該分離純化工藝可應(yīng)用于牛蒡葉綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]

劉丹赤.牛蒡葉中綠原酸的提取純化工藝研究[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2007：1-17.

[2] 徐傳芬，孫隆儒.牛蒡的研究現(xiàn)狀[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（6）：818-821.

[3] 郭秋娟，陳和平.響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)優(yōu)化牛蒡葉提取綠原酸工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（1）：177-181.

[4] 王春民，劉剛，費(fèi)艷，等.大孔吸附樹脂法純化黃芩總黃酮工藝的研究[J].中草藥，2010，41（1）：58-60.

[5] 蘆曉芳，馬清亮，王海香，等.大孔吸附樹脂分離純化酸棗仁皂苷影響因素探討[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2019，35（1）：40-49.

[6] 李俊，劉孟源，方升平，等.大孔吸附樹脂分離純化油橄欖葉總黃酮[J].中成藥，2019，41（2）：261-265.

[7] 祝明思，陳磊，張公亮，等.牛蒡葉中綠原酸超聲波法提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（1）：134 -136.

[8] 張瑩，史益強(qiáng)，戴琳，等.大孔吸附樹脂對金銀花中綠原酸的純化研究[J].化工時(shí)刊，2010，24（11）：1-6.

[9] 楊軍宣，尹蓉莉，陳金玉，等.金銀花葉中綠原酸的大孔吸附樹脂純化工藝研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（15）：20-23.

[10] 孫陽，黃和，胡燚.綠原酸提取純化方法的研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑，2017，39（3）：257-260.

[11] 李巖，趙欣，李曉靜，等.大孔樹脂分離純化天仙子總生物堿的研究[J].中成藥，2015，37（1）：89-94.

[12] 劉娟，羅佳函，劉德江，等.大孔吸附樹脂純化紫花地丁中綠原酸類成分的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34（5）：26-27.

[13] 高海立，郁吉鋒，黃路瑤，等.鐵皮石斛葉總黃酮的大孔樹脂純化工藝及抗氧化活性[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，41（3）：380-386.

[14] 張志榮，藥劑學(xué)[M].2版.北京：高等教育出版社，2014：420.

[15] 王雅，樊明濤，趙萍，等.大孔樹脂對沙棗多酚的動態(tài)吸附解析性能研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，38（12）：215-220.

[16] 蘭艷素，李長江，潘樂.大孔樹脂純化廣豆根總黃酮工藝的優(yōu)化[J].中成藥，2016，38（7）：1644-1647.