超高效液相色譜-大氣壓化學電離-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定血漿、尿液和瓜果類蔬菜中葫蘆素B、E和I

張曉藝, 張秀堯, 蔡欣欣, 李瑞芬

(溫州市疾病預防控制中心, 浙江 溫州 325001)

人們喜愛的瓜果類蔬菜,如葫蘆瓜(瓠瓜、蒲瓜)、絲瓜、南瓜、甜瓜、黃瓜、西瓜、香瓜、小胡瓜(zucchini)、冬南瓜(winter squash)等都屬于葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(CucurbitaLinn.)植物的果實,正常時無苦味,但有的有苦味,苦味瓜果的外形與正常瓜果無區(qū)別,只有在食用時才能發(fā)現(xiàn),食用后會引起中毒[1-10],中毒時會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉以及腹痛等癥狀,嚴重時可引起脫水、低血壓、嘔血、便血、心跳加速、頭痛以及眩暈,甚至于肺水腫,偶爾還會引起脫發(fā),國外稱之為毒性南瓜屬綜合征。引起中毒的物質(zhì),有認為是糖甙生物堿[3],也有認為是葫蘆素類物質(zhì)[1,4,7-10]。葫蘆素類物質(zhì)屬四環(huán)三萜類化合物,主要有葫蘆素B (CuB)、葫蘆素E(CuE)和葫蘆素I (CuI)等[11],其化學結(jié)構見圖1。葫蘆素類味苦,具有一定的生理活性,具有抗氧化、抗腫瘤和護肝等作用,但也有一定毒性,葫蘆素E會抑制絲切蛋白(cofilin)磷酸化,顯示細胞毒性[12]。葫蘆素B小鼠灌胃半數(shù)致死量(LD50)為(14.0±3.0) mg/(kg·bw),皮下給藥的LD50為(1.00±0.07) mg/(kg·bw);葫蘆素E小鼠灌胃的LD50為340 mg/(kg·bw),腹腔注射的LD50為2 mg/(kg·bw)[13]。3H-葫蘆素B灌胃15 min后進入血液,4 h達到峰值,此時血漿蛋白結(jié)合率為88.7%,在肝、膽、胃內(nèi)優(yōu)勢分布,在肺中含量高且持久,24 h內(nèi)尿液和糞便中未見原形藥物,膽汁含給藥量的30.62%,并存在肝腸循環(huán)[14]。

圖1 CuB、CuI、CuE和內(nèi)標物夾竹桃甙的化學結(jié)構Fig. 1 Chemical structures of CuB, CuE, CuI and oleandrin (IS)

報道的葫蘆素類檢測方法有液相色譜法[15-18]和液相色譜-質(zhì)譜法[19-21]。液相色譜法多用于測定藥用植物中葫蘆素類成分[15-17],也有用于葫蘆素B注射劑在小鼠體內(nèi)的藥動學研究[18],但靈敏度低,定性能力差,無法滿足中毒檢測的要求。有液相色譜-質(zhì)譜法用于葫蘆素類藥物的動力學研究,Zhao等[19]采用二氯甲烷萃取,反相色譜柱分離,在電噴霧電離、正離子模式下以CuB的[M+Na]+為母離子進行多反應監(jiān)測(MRM)掃描,檢測了大鼠血漿中葫蘆素B的濃度;Fiori等[20]則采用乙腈蛋白沉淀法進行樣品前處理,反相色譜法分離,在電噴霧電離、負離子、MRM模式下測定了大鼠血漿中CuI和CuE的濃度。也有采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定小胡瓜中毒樣品、患者血清和尿液等體液中CuB、CuI、CuE和CuE-葡萄糖甙的報道[21],樣品采用二氯甲烷萃取,濃縮5倍后進樣分析,經(jīng)五氟苯基色譜柱分離,在電噴霧電離、負離子模式下采用選擇離子監(jiān)測(SIM)模式檢測。

為了確定葫蘆科南瓜屬苦味瓜果中引起中毒的化學成分,本實驗采用固相支持液液萃取法(SLE)提取和凈化樣品,超高效反相液相色譜法分離,建立了大氣壓化學電離、負離子模式、MRM方式的檢測方法,用于引起中毒的苦味瓜果及患者血漿和尿液中CuB、CuE和CuI的測定,方法快速、靈敏、準確,用于實際中毒樣品的測定,首次從引起中毒的苦味葫蘆瓜及中毒患者的血漿和尿液中檢出CuB。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀由ACQUITY UPLC BSM二元溶劑泵、FTN自動進樣器和CM-A柱溫箱組成(美國Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/復合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司); Ultra-Turrax T-25型分散機、MS3旋渦混旋器(德國IKA公司); 2510超聲波清洗機(美國Branson公司); 3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國Millipore公司)。

乙腈、甲醇和叔丁基甲醚(色譜純,德國Merck公司); Cleanert SLE柱(1 000 mg/6 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司)。葫蘆素B(純度≥97%)、葫蘆素E(純度≥95%)和葫蘆素I(純度≥95%)標準物質(zhì)購自美國Sigma公司;夾竹桃甙標準物質(zhì)(純度≥90%)購自加拿大TRC公司,臨用時分別用甲醇溶解,配制成標準儲備液、10.0 mg/L混合標準中間液和1.00 mg/L混合標準工作液,于-80 ℃保存。健康人血漿經(jīng)浙江省衛(wèi)生行政部門審批后由溫州市中心血站提供,尿液由健康志愿者提供。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1血漿和尿液

在1.00 mL血漿或尿液中加入20 μL 0.10 μg/mL內(nèi)標物夾竹桃甙,混勻,上樣于SLE柱,放置5 min以上,用4.0 mL叔丁基甲醚洗脫,洗脫液于50 ℃水浴中氮氣吹干,殘渣溶于200 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,過0.22 μm濾膜,待測。

1.2.2瓜果類蔬菜

切碎樣品,均質(zhì)后,稱取2.00 g試樣,置于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,均質(zhì)15 s,刀頭用10 mL乙腈清洗,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心5 min,吸取上清液,殘渣再用刀頭清洗液重復提取1次,合并提取液,混勻,定容至20 mL,吸取500 μL提取液,置于5 mL試管中,加入500 μL甲醇和1 000 μL水,混勻,過0.22 μm濾膜,濾液待測。高濃度樣品再用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋至合適濃度。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件

分析柱為XBridge BEH C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.5 μm),保護柱為Van Guard BEH C18保護柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫45 ℃;流動相A:甲醇,流動相B: 0.025%(v/v)氨水溶液;流速:0.600 mL/min。梯度洗脫程序:0～3.5 min, 40%A～85%A; 3.5～3.6 min, 85%A～95%A; 3.6～5.5 min, 95%A; 5.5～5.6 min, 95%A～40%A; 5.6～7.5 min, 40%A。進樣體積10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源為大氣壓化學電離(APCI)源,負離子模式;掃描方式為MRM模式;離子源溫度(TEM): 350 ℃;離子化電壓(IS): -4 500 V;放電電流(NC): 5 μA;氣簾氣(CUR)壓力:277 kPa;噴霧氣(GS1)壓力:414 kPa;碰撞氣(CAD)強度:Medium。3種葫蘆素和內(nèi)標物的去簇電壓分別為-60 V和-130 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 3種葫蘆素和內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

運行開始時,色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液,2.70 min再切換到質(zhì)譜離子源,質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)至3.60 min,六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2 結(jié)果和討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

實驗發(fā)現(xiàn)CuB、CuE和CuI在電噴霧電離、正離子模式下可以形成較強的[M+Na]+峰,但以這些[M+Na]+峰作為母離子進行碰撞,得到的碎片離子強度很低且不穩(wěn)定;而在電噴霧電離、負離子模式下可以形成[M-H]-、[M+HCOO]-和[M+Cl]-等離子,以這些離子作為母離子進行碰撞也無法得到穩(wěn)定且有足夠強度的碎片離子,若依據(jù)文獻[21]選擇這些離子進行SIM方式檢測,對于實際樣品,特別是血漿和尿液等基質(zhì)復雜的樣品,得到質(zhì)譜信號的基線很高,靈敏度無法滿足中毒樣品低濃度檢測的要求。嘗試采用大氣壓化學電離模式對待測物進行優(yōu)化,在正離子方式下電離,3種葫蘆素類成分的[M+H]+峰強度較弱,但在負離子方式下電離,這些化合物的[M-H]-峰強度較強,以[M-H]-峰作為母離子進行碰撞能夠得到穩(wěn)定的碎片離子,且均有較強的脫水[M-H-H2O]-碎片峰,葫蘆素B和葫蘆素E還有[M-H-CH3COOH]-峰(見圖2)。因此選擇負離子大氣壓化學電離模式作為后續(xù)測定的質(zhì)譜條件,再對離子化電壓、放電電流、離子源溫度、去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化,使得分子離子對的信號達到最強,選擇信號最強的兩對分子離子對,以響應相對較強的子離子作為定量離子,另一子離子作為定性離子。同時設定合適的峰駐留時間(dwell time)確保色譜峰的采樣點數(shù)在15～20點,從而得到較好的定量重復性。

圖2 CuB、CuE、CuI和內(nèi)標物夾竹桃甙的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig. 2 Daughter ion scan spectra of CuB, CuE, CuI and oleandrin (IS)

2.2 色譜條件優(yōu)化

采用大氣壓化學電離源,液相色譜的流動相流速需≥0.6 mL/min,實驗選擇XBridge BEH C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.5 μm)作為分離柱,分別對甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)進行比較。結(jié)果顯示,以甲醇-水系統(tǒng)作為流動相時,3種待測物有更高的響應值,因此選擇甲醇-水系統(tǒng)進行后續(xù)優(yōu)化。在甲醇-水系統(tǒng)中分別添加不同體積分數(shù)的甲酸(0.05%～0.30%)、氨水(0.010%～0.050%)和不同濃度的乙酸銨(1～5 mmol/L)。結(jié)果表明,流動相中加入甲酸和乙酸銨,3種待測物的質(zhì)譜信號受到明顯抑制,而加入氨水后質(zhì)譜響應則有較大的增強,以甲醇-0.025%(v/v)氨水作為流動相時(見圖3), 3種葫蘆素類成分的質(zhì)譜響應最強,故選作分離的流動相。然后再對流動相的流速、梯度洗脫條件、柱溫等條件進行優(yōu)化,3種待測物能夠得到較好的分離(見圖4)。

圖3 流動相中氨水的體積分數(shù)對3種葫蘆素質(zhì)譜響應的影響Fig. 3 Effect of volume fractions of ammonia in mobile phases on the MS response of the three cucurbitacins

圖4 3種葫蘆素及內(nèi)標物夾竹桃甙的UPLC-MS/MS色譜圖Fig. 4 UPLC-MS/MS chromatograms of the three cucurbitacins and oleandrin (IS)

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

葫蘆素類為四環(huán)三萜類化合物,脂溶性較強,對于血漿和尿液中的樣品前處理方法,文獻[20]采用乙腈沉淀法,文獻[19,21]均采用二氯甲烷液液萃取法,考慮到乙腈沉淀法只能去除血漿中蛋白質(zhì)等雜質(zhì),樣品凈化效果不理想,故本實驗采用液液萃取法,考慮到傳統(tǒng)的液液萃取法萃取效率比較低,易乳化,操作較為繁瑣,而基于液液萃取法原理的固相支持液液萃取法具有萃取效率高、影響因素少和操作簡單等優(yōu)點,已應用于生物樣品的前處理中[22,23],故選作樣品凈化的方法。

取1.00 mL血漿或尿液加標樣品(5.0 μg/L)上SLE柱,然后分別用4.0 mL二氯甲烷、叔丁基甲醚和乙酸乙酯進行洗脫。結(jié)果顯示,二氯甲烷和叔丁基甲醚洗脫液中3種待測物的質(zhì)譜響應值均高于乙酸乙酯洗脫液,考慮到二氯甲烷為含氯試劑,不利于環(huán)境保護,且毒性較大,不予選用。因此最終選擇叔丁基甲醚作為固相支持液液萃取法的洗脫溶液。

分別取6份1.00 mL血漿和尿液的加標樣品(5.0 μg/L)上SLE柱,分別用2.0、4.0和6.0 mL叔丁基甲醚進行洗脫,以6.0 mL的洗脫率為100%計。結(jié)果顯示,4.0 mL叔丁基甲醚洗脫率約為98%,故選擇4.0 mL叔丁基甲醚作為SLE萃取柱的洗脫劑,洗脫液經(jīng)氮吹后殘渣溶于200 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,樣品濃縮了5倍。6份不同來源的血漿和尿液經(jīng)本法處理后測定,在相應的保留時間上未見干擾色譜峰。

由于引起中毒的瓜果類蔬菜樣品中毒物濃度相對較高,故瓜果類蔬菜樣品提取液稀釋后直接測定。取葫蘆瓜加標樣品2.00 g(加標水平0.5 mg/kg),分別用20 mL甲醇或乙腈分2次提取,合并提取液,取500 μL提取液加入500 μL水,混勻,過0.22 μm濾膜后測定。結(jié)果顯示,甲醇與乙腈的提取效果相近,但離心后甲醇提取液中樣品殘渣懸浮于提取液中,不方便提取液的移取,而乙腈作為提取液則無此缺點,而故選用乙腈作為樣品的提取溶液。

取加標葫蘆瓜樣品2.00 g(加標水平0.5 mg/kg),分別用10 mL乙腈提取3次,以3次提取率之和為100%計。結(jié)果顯示,前2次乙腈的提取率約為99%,故最終選擇10 mL乙腈提取2次。此時樣品稀釋10倍,再用水稀釋1倍,測定時約有30%的基質(zhì)抑制效應,若將測定液再用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋1倍,測定時并無明顯的基質(zhì)效應(ME)。

2.4 內(nèi)標物的選擇

采用內(nèi)標法定量可以校正待測物在樣品前處理中的損失,可以校正質(zhì)譜測定過程中的波動和基質(zhì)效應等,從而得到更好的準確度和精密度,最理想的是采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標法,但目前葫蘆素類成分尚無商品化的同位素標記物,嘗試采用能在大氣壓化學負離子模式下電離的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和夾竹桃甙作為內(nèi)標物,結(jié)果顯示，夾竹桃甙的保留時間和離子對的m/z與CuB、CuE和CuI相近,故選用夾竹桃甙作為血漿和尿液樣品的內(nèi)標物。

2.5 方法驗證

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

血漿或尿液中待測物用基質(zhì)加標標準曲線內(nèi)標法定量,分別在6份各含1.00 mL空白血漿或尿液中加入適量混合標準工作溶液,使各待測物的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,再分別按1.2.1節(jié)進行樣品前處理和測定,采用MultiQuant定量軟件進行數(shù)據(jù)處理,以目標化合物的定量離子對與內(nèi)標物的峰面積比值(Y)對其對應的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進行線性回歸(權重取1/X)。

瓜果類蔬菜樣品采用溶劑標準曲線外標法定量,用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋混合標準工作溶液,使3種葫蘆素的質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、20.0、100和500 μg/L,進行檢測,以目標化合物的定量離子對的峰面積(Y′)對其對應的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進行線性回歸(權重取1/X)。

表 2 3種葫蘆素的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

Y: the peak area ratio of the quantitative ion of analyte to internal standard (weight 1/X);Y′: the peak area of the quantitative ion of analyte (weight 1/X);X: mass concentration, μg/L; # μg/kg.

表 3 血漿、尿液和葫蘆瓜中3種葫蘆素的加標回收率和精密度(n=6)

# μg/kg.

血漿、尿液和瓜果類蔬菜中3種待測物的線性范圍、線性方程和相關系數(shù)(r)見表2,相關系數(shù)均≥0.997 1,線性關系良好。在空白血漿和尿液樣品中分別加入低濃度的待測物進行測定,以分子離子對的信噪比≥3和≥10時的樣品濃度作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表2。血漿和尿液中3種待測物的檢出限均為0.03 μg/L,定量限均為0.1 μg/L,能夠滿足中毒檢測的要求;瓜果類蔬菜中3種待測物的檢出限為5～10 μg/kg,定量限為15～ 40 μg/kg。

2.5.2準確度和精密度

按歐洲藥品管理局(EMEA)的要求在定量限、3倍定量限、中等濃度和高濃度下進行準確度和精密度試驗[24],在血漿和尿液中加標3種葫蘆素,使各待測物濃度分別為0.1、0.3、1.0和8.0 μg/L,葫蘆瓜加標一定水平的待測物代表瓜果類蔬菜進行試驗,加標水平為40、100、1 000和15 000 μg/kg,每個水平平行試驗6次,一個工作日內(nèi)進行測定,計算平均加標回收率和精密度。

3種待測物的加標回收率和精密度結(jié)果見表3。血漿和尿液的平均加標回收率為89.0%～113%,相對標準偏差為1.7%～12.2%,符合文獻[24]要求;葫蘆瓜樣品的加標回收率為87.6%～114%,相對標準偏差為4.1%～11.1%。表明本法用于血漿、尿液和瓜果類蔬菜中3種毒物的檢測具有較高的準確度和精密度。

2.5.3基質(zhì)效應和提取回收率

基質(zhì)效應通過基質(zhì)標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率×100%進行評估。ME=100%表示無基質(zhì)效應,ME>100%表示基質(zhì)增強效應,ME<100%表示基質(zhì)抑制效應[25]。

用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋3種葫蘆素混合標準工作液,使其質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/L,制作溶劑標準曲線；取6份空白血漿和尿液樣品，按1.2.1節(jié)進行樣品前處理,加入3種葫蘆素混合標準工作液，使血漿或尿液樣品中3種葫蘆素的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,制作基質(zhì)標準曲線,測定并計算ME值。血漿和尿液中3種葫蘆素的ME值分別為147%～211%和133%～174%,顯示有較強的基質(zhì)增強效應,降低樣品濃縮倍數(shù)至1或2倍,但基質(zhì)增強效應并未減少。以葫蘆瓜為代表對瓜果類蔬菜進行基質(zhì)效應評估,3種葫蘆素的ME值為92.4%～98.2%,顯示無明顯的基質(zhì)效應。

圖5 中毒患者血漿和尿液中CuB的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of CuB in the plasma and urine of poisoned patients

提取回收率則通過計算基質(zhì)加標標準曲線與相同濃度的基質(zhì)標準曲線的斜率之比值再乘以100%來確定[25]。在6份空白血漿和尿液中添加3種葫蘆素混合標準工作液,使其質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,按1.2.1節(jié)進行樣品前處理,制作基質(zhì)加標標準曲線,測定并計算提取回收率,血漿和尿液中3種葫蘆素的提取回收率分別為64.6%～74.8%和66.8%～81.9%。瓜果類蔬菜以葫蘆瓜為代表進行提取回收率計算,3種葫蘆素的提取回收率約為94.3%～99.1%。

雖然經(jīng)過樣品前處理凈化,血漿和尿液中3種葫蘆素還顯示一定的基質(zhì)增強效應,但通過基質(zhì)加標標準曲線內(nèi)標法進行定量,校正樣品的基質(zhì)效應和提取回收的不完全,使最終得到滿意結(jié)果,符合中毒樣品快速檢測的要求。

2.5.4穩(wěn)定性試驗

樣品提取液在自動進樣器樣品盤上室溫放置72 h,每間隔24 h測定1次,3種待測物的含量變化均≤9.6%,表明沒有明顯的降解。

2.6 實際樣品的測定

2017年3月24日,廣西某小學有14名學生食用苦味葫蘆瓜炒肉片后出現(xiàn)惡心、腹瀉等癥狀。采用本法檢測苦味葫蘆瓜片(熟)樣品,從中檢出CuB,含量為0.94 mg/kg。

2019年6月21日,浙江省臺州市某工廠職工在食堂就餐時食用了苦味葫蘆瓜炒肉片,有30多人發(fā)病,出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉以及腹痛等癥狀。次日收到樣品,采用本法從葫蘆瓜片(熟)樣品中檢出CuB,含量為2.15 mg/kg,從瓜皮中也檢出CuB,含量為0.068 mg/kg; 24份血漿樣品中有4份檢出CuB,含量為0.05～0.07 μg/L; 21份尿液樣品中有20份檢出CuB,含量為0.15～1.20 μg/L,中位數(shù)為0.35 μg/L,所有樣品均未檢出CuE和CuI。血漿和尿液陽性樣品的MRM色譜圖見圖5。

檢測了18份市售瓜果類蔬菜樣品,其中葫蘆瓜5份、絲瓜3份、黃瓜3份、南瓜3份、冬瓜3份和苦瓜1份,有1份葫蘆瓜樣品檢出葫蘆素B,含量為0.10 mg/kg,其余均未檢出。

3 結(jié)論

本文結(jié)合食物中毒檢測的特點以及3種葫蘆素的化學性質(zhì),采用固相支持液液萃取法作為血漿和尿液的樣品前處理方法進行開發(fā),瓜果類蔬菜采用乙腈提取,再用溶劑稀釋,通過對超高效液相色譜與質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化,得到了較高的檢測靈敏度。方法學驗證結(jié)果表明,該法具有簡便、快速、靈敏、準確等優(yōu)點,滿足食物中毒檢測的要求,應用于實際樣品的檢測取得了滿意結(jié)果。本法適用于血漿、尿液和瓜果類蔬菜中3種葫蘆素類成分的同時快速檢測。