基于毛細(xì)管電泳的天然產(chǎn)物中酶抑制劑篩選研究進(jìn)展

李 鳳, 張艷梅, 康經(jīng)武

(1. 西安文理學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院, 陜西 西安 710065; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 上海 201403; 3. 生命有機(jī)化學(xué)國家重點實驗室, 中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 上海 200032)

生物體內(nèi)各種酶參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡等幾乎所有的生理過程,對細(xì)胞信號通路的調(diào)控起著非常關(guān)鍵的作用。威脅人類健康的幾類重大疾病如癌癥、糖尿病及高血壓等被發(fā)現(xiàn)與相關(guān)酶的失調(diào)密切相關(guān),因此酶是目前新藥研發(fā)的重要靶標(biāo)。同時酶抑制劑已成為全球排名第二的熱門靶向藥物,是各大制藥公司研發(fā)的熱點。迄今為止,已有37個用于治療癌癥的小分子蛋白激酶抑制劑(protein kinase inhibitors, PKIs)獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市,另外還有大約150多個抑制劑正處在臨床實驗階段[1]。天然產(chǎn)物具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和良好的成藥性,是發(fā)現(xiàn)藥物的重要資源。從合成化合物庫中進(jìn)行高通量篩選(HTS)的命中率小于0.001%,從天然產(chǎn)物中篩選到新藥的命中率卻能高達(dá)0.3%[2]。Newman和Cragg[3]對1981年到2014年間全球上市的新藥的來源做了統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)這34年間上市的1 211種小分子藥物中,有65%上市藥物都是來源于天然產(chǎn)物及其衍生物。從天然產(chǎn)物中尋找活性化合物(比如酶抑制劑),解析其化學(xué)結(jié)構(gòu),之后進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究(structure activity relationships, SAR)得到先導(dǎo)化合物,是當(dāng)前我國新藥研究的重要領(lǐng)域之一,同時也是實現(xiàn)中藥“走出去”的必經(jīng)之路。天然產(chǎn)物分離純化過程耗時費力,一直是藥物篩選的決速步驟。而基于光譜或者放射性檢測的高通量篩選模式,難適用于成分復(fù)雜的天然產(chǎn)物。因此,發(fā)展快速、可靠和有效的酶抑制劑篩選技術(shù),用于復(fù)雜天然產(chǎn)物中活性成分篩選,特別對明確中藥的藥理作用具有非常重要的現(xiàn)實意義。

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE),具有分離效率高、分析速度快、操作簡單、樣品和試劑用量少、分離模式多以及抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點[4]。由于不使用固定相,樣品基質(zhì)不容易污染毛細(xì)管柱,因此可以直接篩選天然產(chǎn)物粗提物,實現(xiàn)底物和產(chǎn)物的分離和檢測。Banke等[5]將CE用來研究堿性蛋白酶的活性,從此開啟了CE在酶學(xué)研究中的應(yīng)用,包括酶活性測試、酶動力學(xué)的研究、酶底物的鑒定以及酶抑制劑的篩選等[6-8]。近年來,CE在藥物分析和藥物篩選研究中的應(yīng)用越來越受到重視[9,10]。基于此,本文對CE在天然產(chǎn)物中酶抑制劑篩選的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,總結(jié)了近10年來CE在天然產(chǎn)物中酶抑制劑篩選中的應(yīng)用實例(見表1),希望有助于該技術(shù)的普及和推廣。

1 毛細(xì)管電泳用于抑制劑篩選的基本技術(shù)簡介

采用CE進(jìn)行酶活測試和酶抑制劑篩選,主要有兩種方式[6,10]:一是離線模式(off-line或pre-capillary assay),二是在線模式(on-line或in-capillary assay)。

1.1 離線分析

離線模式下,CE僅作為一種分離工具。酶、底物、輔助因子或者其他必需的化合物在柱外混合均勻并孵育后,再將酶反應(yīng)液導(dǎo)入毛細(xì)管柱進(jìn)行分離和檢測,通過測定產(chǎn)物或底物的峰面積變化計算酶反應(yīng)動力學(xué)、抑制動力學(xué)以及抑制活性。離線的酶活測定方法簡單,可以各自優(yōu)化反應(yīng)條件和分離條件。但也存在著一些不足之處:首先,柱外的酶反應(yīng)與柱上的樣品分析之間存在一定的時間差,因此在進(jìn)樣分析之前必須將酶反應(yīng)淬滅;其次,柱外的酶反應(yīng)消耗至少微升級的試劑量。為了實現(xiàn)真正意義上納升規(guī)模的篩選,非常有必要將酶反應(yīng)由柱外轉(zhuǎn)移到只有納升級測定體積的毛細(xì)管柱內(nèi)。因此,近年來,在線的酶活測定新技術(shù)發(fā)展十分迅速。

1.2 在線分析

在線的CE活性測試和抑制劑篩選,可以實現(xiàn)柱上反應(yīng)、分離和檢測的一體化。毛細(xì)管不僅可以用作分離通道,同時也可以用作酶反應(yīng)容器。已經(jīng)發(fā)展出的方法有均相測試方法-電泳介導(dǎo)的微分析(electrophoretically mediated microanalysis, EMMA)和非均相測試方法-固定化酶微反應(yīng)器(immobilized enzyme microreactor, IMER)[71]。

1.2.1電泳介導(dǎo)的微分析

EMMA是Bao和Regnier[72]在1992年首次提出,用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的在線活性測試?；驹硎菍⒚?xì)管柱頭作為微反應(yīng)器,通過電泳或者擴(kuò)散作用使得酶和各個反應(yīng)因子混合均勻,最終根據(jù)各個物質(zhì)電泳淌度的不同將底物和產(chǎn)物進(jìn)行分離。EMMA用于酶活測試和抑制劑篩選具有非常突出的優(yōu)勢:(1)參與酶反應(yīng)的各個物質(zhì)的混合可以采用電泳混合或者擴(kuò)散混合兩種模式;(2)混合、反應(yīng)、分離以及檢測都在一根毛細(xì)管柱內(nèi)進(jìn)行,提高了分析的效率,非常適合于短壽命反應(yīng)產(chǎn)物的檢測以及快速反應(yīng)動力學(xué)的研究;(3)試劑和樣品消耗量小,大大降低了篩選成本;(4)便于自動化和高通量。

近年來,除了傳統(tǒng)的連續(xù)模式(zonal EMMA)被廣泛應(yīng)用外,一系列新的EMMA模式也被廣泛報道,包括區(qū)帶-區(qū)帶模式(plug-plug EMMA)、部分填充模式(partial-filling EMMA)、快速極性反轉(zhuǎn)模式(rapid polarity switching EMMA)、縱向擴(kuò)散模式(at-inlet longitudinal diffusion)、層流剖面的橫向擴(kuò)散模式(transverse diffusion of laminar flow profile, TDLFP)等。

1.2.2固定化酶微反應(yīng)器

毛細(xì)管固定化酶微反應(yīng)器結(jié)合了固定化酶和CE兩者的優(yōu)勢,通過固定化使靶標(biāo)酶的穩(wěn)定性得到提高且可重復(fù)利用,同時CE納升規(guī)模的溶液操作性能進(jìn)一步減少試劑的消耗量,從而大大降低分析成本[73,74]。CE的高分離選擇性可消除復(fù)雜樣品基質(zhì)及化合物樣品之間的相互作用對檢測帶來的干擾,不僅有效地提高了分析的準(zhǔn)確性,同時也為混合物的篩選提供了又一多樣化的分析平臺。與EMMA技術(shù)的均相酶活性測定相比,毛細(xì)管固定化酶微反應(yīng)器因無需反應(yīng)物之間的混合步驟而使得酶活測定更為簡便和直接,且同時適用于帶電化合物和中性化合物的分析。

2 CE在藥物篩選中的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)移酶(transferases)

蛋白激酶(protein kinase)是一類重要的磷酸轉(zhuǎn)移酶,催化蛋白質(zhì)的磷酸化過程。它參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化以及凋亡等生理過程,對細(xì)胞信號通路的調(diào)控也起著非常關(guān)鍵的作用。蛋白激酶的失調(diào)往往與各種疾病,如炎癥、高血壓、糖尿病、關(guān)節(jié)炎,特別是癌癥緊密相關(guān),已經(jīng)成為繼G蛋白偶聯(lián)受體之后第二大類最重要的藥物靶標(biāo)。蛋白激酶根據(jù)磷酸受體不同分為五大類,包括絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶、組氨酸激酶、半胱氨酸激酶以及天冬氨酸/谷氨酸激酶。由于激酶反應(yīng)涉及磷酸根的轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致底物與產(chǎn)物有較大的電泳淌度差異,所以CE特別適合蛋白激酶抑制劑的篩選。早期,Gratz等[11]以酪蛋白激酶2(CK2)為模型,建立離線CE-UV檢測磷酸化前后底物的變化,實現(xiàn)了CK2的酶活性測試和抑制劑篩選?？到?jīng)武課題組[12]基于EMMA技術(shù),建立了直接檢測三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)生成量的通用型激酶抑制劑篩選技術(shù)。同時以己糖激酶為模型,考察了抑制劑3-溴丙酮酸(3-BrPA)的抑制動力學(xué),證明該方法具有簡單、快速以及經(jīng)濟(jì)的特點。近年來,Okhonim等[75]提出一種在線混合反應(yīng)物的新方法,即TDLFP。它是將每種反應(yīng)物溶液以較大壓力短時間進(jìn)樣,使得樣品在毛細(xì)管柱內(nèi)呈層流拋物線,每個反應(yīng)物溶液都會穿過上一個反應(yīng)物,最后再以相同方式注入酶反應(yīng)的緩沖溶液,使之前進(jìn)樣的反應(yīng)物通過軸向界面的橫向擴(kuò)散實現(xiàn)均勻混合,有利于產(chǎn)物的快速生成。Nehmé等[13]將CE-TDLFP技術(shù)用于天然黃酮化合物庫中靶向細(xì)胞周期依賴激酶5/p25(CDK5/p25)和葡萄糖合成激酶3β(GSK3β)抑制劑的篩選,最終實現(xiàn)了復(fù)雜體系沙棘粗提物的活性測試。該課題組[14]還將該篩選技術(shù)應(yīng)用于天然黃酮類化合物中靶標(biāo)蛋白激酶CDK5/p25、細(xì)胞周期依賴激酶1/周期蛋白B (CDK1/cyclin B)抑制活性評價中。進(jìn)一步利用CE分離結(jié)合UV檢測二磷酸腺苷(adenosine diphophate, ADP)的產(chǎn)生,從而實現(xiàn)了蛋白激酶信號通路PI3K/AKT/mTOR的活性測試以及抑制劑篩選[16]。Zhang等[76]發(fā)展了一種基于激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detector, CE-LIF)檢測的多個細(xì)胞內(nèi)源激酶的抑制劑平行篩選及選擇性評價方法。CE高效的分離能力和LIF檢測器的高選擇性使得同時測試多個胞內(nèi)激酶的活性成為可能。

圖1 毛細(xì)管電泳結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的酶抑制劑的篩選流程圖[17-20]Fig. 1 Schematic illustration of the workflow for screening enzyme inhibitors by CE in combination with HPLC-MS[17-20]

近年來,康經(jīng)武課題組[17]還建立了CE-LIF結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用的天然產(chǎn)物粗提物中酶抑制劑的篩選方法。該方法的流程圖見圖1,利用CE可以直接測定天然產(chǎn)物粗提物的活性。用CE跟蹤HPLC分離純化的各個成分,利用HPLC-MS/MS對其活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。將該方法用于篩選天然產(chǎn)物中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制劑。首次從丹參粗提物中篩選了兩個抑制作用為亞微摩爾級的新mTOR抑制劑丹酚酸A和丹酚酸C。之后,采用相同的策略建立了受體酪氨酸激酶表皮生長因子受體(EGFR)的抑制劑篩選和選擇性評價方法[18],最終將其應(yīng)用于39種中藥粗提物組成的化合物庫中進(jìn)行篩選,對篩選的活性粗提物進(jìn)行進(jìn)一步的活性成分追蹤。最終,鑒定得到澤蘭中槲皮素和蘆丁是EGFR的抑制劑,其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.88 μmol/L和10.1 μmol/L。基于CE-EMMA技術(shù),我們[19]還建立了蛋白激酶A(PKA)抑制劑篩選方法,將其用于33種天然產(chǎn)物粗提物中抑制劑的篩選,通過活性追蹤篩選,最終從黃芩粗提物中篩選到黃芩苷具有較強(qiáng)的抑制PKA活性的作用,其IC50值為0.69 μmol/L。最近,我們[20]還基于CE-LIF進(jìn)一步建立了斷裂點簇集區(qū)-艾貝爾森激酶(BCR-ABL)抑制劑的篩選方法,從37種中藥小分子化合物庫中篩選到木犀草素和表兒茶素沒食子酸酯具有較強(qiáng)的抑制活性,其IC50值分別是5.4 μmol/L和4.8 μmol/L。實驗中,我們用藥物篩選中的統(tǒng)計學(xué)Z′因子評價上述篩選數(shù)據(jù)的質(zhì)量。結(jié)果計算得到的Z′因子均大于0.9,遠(yuǎn)大于可信度的閾值0.5,證實了CE方法用于抑制劑篩選的可靠性。

上述一系列的研究工作表明,將HPLC-MS的結(jié)構(gòu)鑒定和CE的高效篩選相結(jié)合,直接用于中藥粗提物的活性成分篩選可以實現(xiàn)高效率的藥物篩選。由于采用了CE作為分離工具,有效地避免了樣品基質(zhì)對篩選的干擾,對于復(fù)雜樣品體系(如中藥粗提物等)可以直接進(jìn)行活性篩選跟蹤,無需繁瑣的樣品前處理步驟,為系統(tǒng)性研究開發(fā)天然產(chǎn)物,闡明活性成分的作用機(jī)理提供了強(qiáng)有力的分析工具。

2.2 水解酶(hydrolase)

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)能催化α-1,4-糖苷鍵水解,抑制α-葡萄糖苷酶的活性從而抑制餐后高血糖,可以有效預(yù)防糖尿病并減少并發(fā)癥的產(chǎn)生。Guo等[24]將CE-EMMA應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選,實現(xiàn)了21種中藥提取物中酶抑制劑的篩選。Zhang等[26]制備了α-葡萄糖苷酶固定化酶微反應(yīng)器來篩選其抑制劑。首先利用納米金顆粒與巰基之間的作用,將納米金顆粒共價結(jié)合到毛細(xì)管整體柱的多孔聚合物表面,然后將酶固定在納米金顆粒上,從11種天然產(chǎn)物粗提物中成功篩選出α-葡萄糖苷酶抑制劑。Liu等[27]將α-葡萄糖苷酶固定在磁性四氧化三鐵(Fe3O4)納米粒子上,Fe3O4粒子預(yù)先經(jīng)殼聚糖修飾,隨后將所得納米粒子與戊二醛反應(yīng),在磁性納米粒子外層修飾醛基,最后利用酶氨基與醛基作用將酶固定。磁性固定化酶與底物進(jìn)行反應(yīng)后,只需施加一個外加磁場就可以將其和反應(yīng)混合物實現(xiàn)快速分離。

神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)具有唾液酸酶活性,在甲型、乙型流感病毒的復(fù)制、感染和致病過程中起重要作用。因此,篩選NA抑制劑是研究和開發(fā)抗病毒藥物的重要途徑。Zhao等[28]通過戊二醛交聯(lián)制備了NA固定化酶微反應(yīng)器,實現(xiàn)了在線篩選其抑制劑?？疾炝?8種天然產(chǎn)物的抑制活性,并對有活性的8種組分按活性大小進(jìn)行了排序。Jiang等[29]也建立了基于CE的NA活性測試的方法,實驗中優(yōu)化了反應(yīng)和分離分析條件,將建立的方法用于復(fù)雜體系可口革囊星蟲粗提物中抗流感病毒抑制劑的篩選,最終篩選出7種對NA有抑制活性的粗提物。

酪氨酸酶(tyrosinase, TRS)是黑色素生物合成的關(guān)鍵酶,化妝品市場上的美白產(chǎn)品以TRS抑制劑為主。TRS活性過高會引起黑色素沉積,從而引發(fā)皮膚色素性疾病。Tang等[30]將CE-EMMA應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥中TRS抑制劑的篩選。該課題組[31]還發(fā)展了化學(xué)鍵合的TRS微反應(yīng)器。Jiang等[32]通過層層自組裝方式在毛細(xì)管柱端構(gòu)建“聚電解質(zhì)-酶-聚電解質(zhì)”的三明治夾心結(jié)構(gòu),制備得到離子鍵合的固定化TRS微反應(yīng)器,連續(xù)酶分析25次后,酶活性只損失了12%,最終從19種中藥粗提物中篩選出了2種活性粗提物。Su等[33]基于Zn(Ⅱ)-L-leucine和β-環(huán)糊精(β-CD)的螯合作用構(gòu)建了手性配體交換毛細(xì)管電泳(CLE-CE)體系用于TRS抑制劑的篩選。

腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)是一種氨基水解酶,將腺嘌呤核苷水解催化成為次黃嘌呤核苷。由于ADA和黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)是嘌呤代謝的關(guān)鍵酶, Lin等[34]同時將ADA和XOD固定在金納米粒子上制備了雙酶固定化微反應(yīng)器,將兩種酶的底物混合進(jìn)樣,結(jié)果表明,使用雙酶固定化酶微反應(yīng)器不僅方便、快速、成本低,而且可以同時評價兩種酶的抑制劑活性。最近,Qi等[35]又報道了ADA和嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase, PNP)雙酶抑制劑篩選方法。作者將紅細(xì)胞裂解液作為天然酶源進(jìn)行天然產(chǎn)物中抑制劑的篩選,巧妙地應(yīng)用了ADA的產(chǎn)物次黃嘌呤核苷作為PNP的底物,并對方法進(jìn)行了驗證,同時還首次報道了當(dāng)歸對ADA的抑制作用。Ji等[36]采用聚陰離子電解質(zhì)海藻酸鈉包埋ADA,然后通過靜電作用將其固定在修飾了聚陽離子涂層的毛細(xì)管進(jìn)樣端,實現(xiàn)了在線篩選ADA抑制劑。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)屬于蛋白水解酶家族,可降解很多細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMPs活性的紊亂,會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的入侵、遷移以及血管增生,因此MMPs已成為重要的癌癥靶標(biāo)和生物標(biāo)志物。Hai等[37]首次建立了EMMA在線熒光檢測MMPs抑制劑的篩選方法。以MMP-2和MMP-9為模型酶,合成的熒光標(biāo)記多肽作為底物,采用短端進(jìn)樣的方法依次將酶、底物和抑制劑注入毛細(xì)管,在正負(fù)電壓作用下,三者進(jìn)行混合并在線反應(yīng)、分離和檢測,實現(xiàn)了多種MMPs候選抑制劑(沒食子酸酯、油酸、白藜蘆醇、槲皮素、咖啡酸、葡糖胺和多西環(huán)素)的活性評價。之后,該課題組[38]進(jìn)一步將CE-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于MMP-9抑制劑的篩選中,大大提高了方法的靈敏度,抑制劑的檢出限低至nmol/L級。

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, ACHE)抑制劑可以通過抑制ACHE的活性從而維持神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿的正常水平。目前ACHE抑制劑是臨床上用于改善阿爾茨海默病(alzheimer′s disease, AD)患者認(rèn)知障礙的常用藥物,因此篩選ACHE抑制劑具有重要的現(xiàn)實意義。Min等[40]在前人的基礎(chǔ)上,通過層層自組裝方式在毛細(xì)管柱端構(gòu)建“聚電解質(zhì)-酶-聚電解質(zhì)”的三明治夾心結(jié)構(gòu),制備得到離子鍵合的固定化酶微反應(yīng)器。利用具有生物兼容性的穩(wěn)定劑殼聚糖和藻酸鹽,大大提高了ACHE固定化酶反應(yīng)器的穩(wěn)定性,并成功應(yīng)用于天然產(chǎn)物中ACHE抑制劑的篩選?？到?jīng)武課題組[41]基于CE-EMMA技術(shù),建立了ACHE的酶活測試和酶抑制劑篩選方法。我們[42]采用半制備HPLC對黃連粗提物進(jìn)行分離制備,再基于EMMA的ACHE抑制劑篩選方法進(jìn)行黃連粗提物的活性成分跟蹤篩選。最終,篩選出黃連粗提物中有7種生物堿(表小檗堿、黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿、非洲防己堿、巴馬汀、小檗堿)對ACHE有不同程度的抑制作用。

其他的水解酶還包括胰蛋白酶、胃蛋白酶等。Yin等[43]利用氧化石墨烯與胰蛋白酶之間的靜電吸引,使用靜電層層組裝,實現(xiàn)了雙層酶的固定,大大增加了酶的固載量。他們利用CE-IMER實現(xiàn)了在線分析牛血清白蛋白(BSA)的酶解肽段,與溶液中胰蛋白酶酶解12 h得到的肽段數(shù)量相當(dāng)。Min等[44]利用雙功能試劑戊二醛制備了胰蛋白酶微反應(yīng)器,并且成功地從19種天然產(chǎn)物提取物中篩選出胰蛋白酶抑制劑。Zhang等[45]利用戊二醛與酶末端的氨基反應(yīng),將胃蛋白酶固定在毛細(xì)管整體柱上,實驗表明在連續(xù)反應(yīng)40次后,胃蛋白酶的活性仍能保持95.9%;將制備的酶微反應(yīng)器放置在4 ℃冰箱里面36天,酶活性僅損失15.1%;最終,作者將制作的胃蛋白酶微反應(yīng)器用于9種天然產(chǎn)物中抑制劑的篩選。

2.3 氧化還原酶(oxidoreductases)

單胺氧化酶B(monoamine oxidase B, MAO-B)和XOD是常見的氧化還原酶抑制劑篩選的靶標(biāo)酶分子,可催化分子氧作為電子受體參與一系列氧化還原反應(yīng)。特別是,MAO-B在調(diào)節(jié)內(nèi)源性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺代謝中起關(guān)鍵作用。Hu等[52]使用毛細(xì)管進(jìn)樣端作為酶反應(yīng)器,從天然產(chǎn)物中成功篩選出MAO-B抑制劑;在最優(yōu)條件下,2 min內(nèi)就實現(xiàn)了底物、產(chǎn)物和酶的分離;最終從16種粗提物庫中篩選出山楂和何首烏對MAO-B有抑制活性。Li等[53]使用蛋白-脂質(zhì)體復(fù)合物進(jìn)行柱外MAO-B抑制劑的篩選,通過加入含乙二胺四乙酸(EDTA)和Na2S2O5的HClO4溶液猝滅反應(yīng),與傳統(tǒng)的抑制劑篩選方法相比,該法更簡單、快速、節(jié)省酶源,干擾因素少。XOD是嘌呤分解代謝過程中的一種很重要的酶,催化由黃嘌呤形成尿酸以及次黃嘌呤形成黃嘌呤的氧化過程。XOD抑制劑可以降低血漿中的尿酸含量,臨床上可用于痛風(fēng)患者的治療。Zhang等[54]以EMMA為手段,采用部分填充的酶反應(yīng)器技術(shù),建立了一種快速、高效、簡便的XOD活力及抑制動力學(xué)測定方法;以已知抑制劑4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶(APP)為例,對XOD進(jìn)行了抑制動力學(xué)研究,IC50和Ki分別為30 μmol/L和8 μmol/L;并最終將建立的方法應(yīng)用于15種天然產(chǎn)物的活性測試。

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族,它參與大量內(nèi)源性物質(zhì)以及包括藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝過程。Reminek等[55]應(yīng)用CE-TDLFP建立了細(xì)胞色素P450 2C9異構(gòu)體(CYP2C9)藥物代謝的評價方法。以雙氯芬酸為底物探針,磺胺苯吡唑為抑制劑探針,對CYP2C9進(jìn)行了動力學(xué)和抑制動力學(xué)的研究。在TDLFP模式中,蛋白用量大大減低,單次用量小于30 nL。Asensi-Bernardi等[56]建立了CYP3A代謝藥物分子維拉帕米(verapamil, VER)的分析方法。EMMA與部分填充技術(shù)結(jié)合,加入高度硫酸化的β-環(huán)糊精,實現(xiàn)了維拉帕米和去甲維拉帕米的手性拆分。動力學(xué)常數(shù)測試實驗表明,當(dāng)?shù)孜餅镾-VER時,其Km和Vmax分別是51±9 μmol/L和22±2 pmol/(L·min·pmol CYP),當(dāng)?shù)孜餅镽-VER時,其Km和Vmax分別是47±9 μmol/L和21±2 pmol/(L·min·pmol CYP)。

2.4 其他酶

Nehmé課題組[62,63]利用短端進(jìn)樣的模式,采用UV和LIF檢測方式,建立了離線分析方式和在線分析方式(CE-TDLFP)對人中性白細(xì)胞彈性硬蛋白酶(HNE)的4種可能底物多肽進(jìn)行動力學(xué)研究。進(jìn)一步利用CE-TDLFP-LIF對HNE的抑制反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行了研究,抑制劑熊果酸的IC50和Ki分別是5.62±0.10 μmol/L、2.81±0.05 μmol/L,抑制劑齊墩果酸的IC50和Ki分別是8.21±0.23 μmol/L、4.11±0.12 μmol/L[62]。另外,他們課題組[63]首次利用微尺寸熱泳(microscale thermophoresis, MST)對HNE和熊果酸的相互作用進(jìn)行了研究,測得HNE-熊果酸復(fù)合物的Ki為2.72 μmol/L,這與CE-TDLFP-LIF測得的Ki為2.81±0.05 μmol/L非常吻合?？到?jīng)武課題組[64]將離線的CE酶活測試方法與HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合,實現(xiàn)了組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的酶學(xué)研究和酶抑制劑篩選。從38種中藥小分子化合物庫中,篩選出一種微摩爾級的HDAC抑制劑(木犀草素),其IC50為40 μmol/L。最近,我們[65]還報道了組蛋白去甲基化酶(JMJD3)抑制劑的篩選工作,發(fā)現(xiàn)了兩種新的JMJD3抑制劑丹酚酸A和葛根素木糖苷。

3 總結(jié)和展望

現(xiàn)代藥物研發(fā)費用極高帶來了一系列的問題。提高新藥研發(fā)的效率首先需要從藥物篩選技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)。相比其他的藥物篩選技術(shù),CE在復(fù)雜成分樣品的分析上具有明顯的優(yōu)勢,而且由于低消耗使得運行成本相對較低,完全可以成為一種標(biāo)準(zhǔn)藥物篩選的平臺。但是受CE普及程度的影響,真正使CE成為一種廣泛接受的藥物篩選技術(shù)還需要很長的路要走。關(guān)鍵在于發(fā)展更為簡便而且穩(wěn)定性更好的CE儀器,在使用流程上實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作,避免過度依賴經(jīng)驗,此外還應(yīng)該發(fā)展新的方法使CE成為不可或缺的藥物篩選技術(shù)。這些問題的解決將會促進(jìn)CE在藥物研發(fā)以及生命分析等領(lǐng)域的普及和廣泛應(yīng)用。