超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定魚和蝦中多類禁、限用獸藥殘留

陳興連, 林 濤, 劉興勇, 梅文泉, 王 麗,耿慧春, 程 龍, 汪祿祥*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明), 云南 昆明 650205; 2. 上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司, 上海 200335)

隨著現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)呈集約化和規(guī)?；l(fā)展,水產(chǎn)生物疫情的爆發(fā)頻率也逐漸增高,為了治療和預(yù)防水產(chǎn)生物病蟲害,以及減少高密度飼養(yǎng)帶來的風險,養(yǎng)殖過程中常使用磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、硝基呋喃類等抗生素及三苯甲烷類獸藥。這些藥物抗菌效果好,價格低廉,部分藥等效替代品少,而使用者和經(jīng)營者對這些藥物的毒性和危害認識不足,導(dǎo)致超量和超種類的濫用、誤用、違規(guī)使用,以及不遵守休藥期等現(xiàn)象屢禁不止[1-4],由此引起水產(chǎn)品中獸藥的殘留、超標現(xiàn)象時有發(fā)生。大量獸藥污染的水產(chǎn)品經(jīng)食物鏈進入人體后,會破壞人的造血系統(tǒng),導(dǎo)致毒性損傷、激素障礙變態(tài)反應(yīng)、過敏反應(yīng)及細菌耐藥性等危害[5,6]。復(fù)旦大學(xué)相關(guān)研究人員還認為抗生素的暴露模式可能是促進脂肪生成并導(dǎo)致兒童肥胖的危險因素之一[7]。我國農(nóng)業(yè)部235號公告將三苯甲烷類、氯霉素和硝基呋喃類列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥,而磺胺類、喹諾酮類、甲砜霉素、氟甲砜霉素列為水產(chǎn)養(yǎng)殖限用藥。目前,食品安全監(jiān)督機構(gòu)以及相關(guān)企業(yè)將這5類獸藥作為日常檢測項目進行重點監(jiān)控?？兹甘G及硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)迅速代謝,而與蛋白結(jié)合的代謝物在生物體內(nèi)能長期穩(wěn)定存在[8],因此常通過檢測其代謝物以反應(yīng)樣品真實的藥物殘留情況。

測定獸藥殘留的現(xiàn)有標準方法[9-15]多按照化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的同族或單一藥物來測定。雖樣品前處理方法適合多類基質(zhì),但完成一個樣品中不同類獸藥檢測需經(jīng)幾次前處理,檢測成本高,周期長,造成儀器設(shè)備、人員浪費,也難以滿足愈來愈多突發(fā)事件的應(yīng)急監(jiān)控需要[16,17]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)在滿足多組分同時檢測的情況下仍具有選擇性強、基質(zhì)干擾小、靈敏度和檢測效率高等優(yōu)勢,是近幾年來水、土、動物源性食品及排泄物等基質(zhì)中多類獸藥殘留快速測定的首選[18-25]。盡管同時測定水產(chǎn)品中多類獸藥殘留也有較多文獻報道[26-28],但同時測定磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、硝基呋喃類代謝物、孔雀石綠、隱色孔雀石綠的文獻鮮有報道,且國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測要求水產(chǎn)品(魚、蝦)測定這5類獸藥。因此,迫切需要建立水產(chǎn)品中這5類獸藥的快速檢測方法。

本研究通過優(yōu)化樣品前處理方法、色譜及質(zhì)譜條件,建立了同時提取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物、喹諾酮類、磺胺類、三苯甲烷類、氯霉素類共5類28種藥物的新方法。該方法對提高水產(chǎn)品監(jiān)管工作效率、節(jié)約檢測成本、保障食品安全具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290超高效液相色譜儀、ZORBAX C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)(美國Agilent公司); QTRAP 5500三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);渦旋振蕩器(美國Thermo公司); JD200-2電子天平(沈陽龍騰電子有限公司); TGL-15 B型高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道爾夫公司)。

表 1 28種獸藥、12種同位素內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)

DP: declustering potential; CE: collision energy; * quantitative ion.

本實驗所用溶液標準物質(zhì)(見表1)均購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心(北京), 7種喹諾酮類、12種磺胺類、4種硝基呋喃類代謝物的質(zhì)量濃度均為10 mg/L, 3種氯霉素類藥物的質(zhì)量濃度均為100 mg/L,其余物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為5 mg/L。

甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);甲酸(色譜純,美國Sigma公司);乙酸銨、氯化鈉、正己烷(分析純,上海國藥集團);磷酸氫二鉀(分析純,國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司);純凈水(杭州娃哈哈公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18、氨基鍵合硅膠填料(NH2, 50 μm)(中國迪馬科技有限公司);二甲亞砜(分析純,天津風船化學(xué)試劑科技有限公司); 2-硝基苯甲醛(純度>98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);鹽酸(優(yōu)級純,上海國藥集團)。

1.2 標準溶液配制

用甲醇稀釋各獸藥溶液標準物質(zhì)及內(nèi)標物質(zhì):氯霉素、喹諾酮類、磺胺類、硝基呋喃類代謝物配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L,甲砜霉素和氟甲砜霉素配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L,其他物質(zhì)配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的標準儲備液,于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

稱取5.00 g(精確至0.01 g)均質(zhì)試樣,置于50 mL塑料離心管中,依次加入13.0 mL 0.2 mol/L鹽酸和0.05 mL 0.16mol/L 2-硝基苯甲醛溶液,置于37.0 ℃恒溫振蕩器中保持16 h,取出冷卻至室溫,再加入6～8 g氯化鈉、15.0 mL乙腈,渦旋提取5～7 min,以5 000 r/min離心3 min,取出上清液,再加入15.0 mL乙腈重復(fù)提取一次,合并兩次提取液,待凈化。

1.3.2凈化

向提取液中加入5～6 mL正己烷,渦旋1 min,以5 000 r/min離心3 min,取出乙腈層濃縮至干,加入1.0 mL甲醇復(fù)溶,待凈化。

取50 mg C18、30 mg PSA及60 mg NH2吸附材料,置于50 mL離心管中,加入2.0 mL甲醇,渦旋30 s后去除上清液,將上述1.0 mL待凈化溶液轉(zhuǎn)移至離心管中,渦旋1 min,取上清液過0.22 μm濾膜,待UHPLC-MS/MS測定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

采用正交試驗方差分析方案[1]，研究播種架傾角、種勺線速度、種勺空間尺寸與播種架播種性能指標之間的關(guān)系，對數(shù)據(jù)進行分析處理，分析影響播種質(zhì)量上述3因素中的主要因素；再用綜合加權(quán)分析法對數(shù)據(jù)進行優(yōu)化，確定最佳的參數(shù)范圍。

色譜柱:ZORBAX C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.2 mL/min;進樣量:2.0 μL。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素:流動相A為水,B為甲醇。梯度洗脫程序為0～3.0 min, 5%B～95%B; 3.0～6.0 min, 95%B; 6.0～6.5 min, 95%B～5%B; 6.5～8.5 min, 5%B。

其他化合物:流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.1 mmoL/L乙酸銨), B為乙腈。梯度洗脫程序為0～3.0 min, 5%B～30%B; 3.0～4.0 min, 30%B～40%B; 4.0～6.0 min, 40%B～95%B; 6.0～8.0 min, 95%B; 8.0～8.2 min, 95%B～5%B; 8.2～10.0 min, 5%B。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源;離子源溫度:550 ℃;噴霧氣(GS1)壓力:0.379 MPa;輔助加熱氣(GS2)壓力:0.379 MPa;氣簾氣壓力:0.241 MPa。氯霉素類藥物為負離子模式掃描,噴霧電壓:-4 500 V;監(jiān)測模式:-MRM;磺胺類、喹諾酮類、孔雀石緑、隱色孔雀石緑、硝基呋喃類代謝物為正離子模式掃描,噴霧電壓:5 500 V;監(jiān)測模式:+MRM。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件中的去簇電壓和碰撞能量對離子豐度具有較大影響,對方法靈敏度有決定性作用。去簇電壓過低時難以實現(xiàn)目標物與被其吸附的溶劑分子的去簇;過高時離子碎裂,導(dǎo)致源內(nèi)裂解。碰撞能量過高時,由母離子生成的碎片過多,子離子響應(yīng)過低;碰撞能量過低時,不能生成所需的子離子。同一離子在不同型號儀器上所需的去簇電壓和碰撞能量也不盡相同,本實驗通過針泵以流動注射的方式對1.2節(jié)配制的標準溶液進行分析,為每個待測藥物選取響應(yīng)最高的兩對離子對及相應(yīng)的最佳去簇電壓和碰撞能量,并根據(jù)各離子對的響應(yīng)高度確定定量與定性離子對,相關(guān)參數(shù)見表1。

2.1.2色譜條件優(yōu)化

流動相對化合物的離子化效率、色譜峰形、峰高和分離效果都有較大影響。由于這5類藥物結(jié)構(gòu)中含有叔氨基、強堿性基團等,易與色譜填料中殘余的硅醇基產(chǎn)生氫鍵作用,造成色譜峰拖尾、展寬,以及保留時間漂移等現(xiàn)象[1],為了盡可能提高藥物分離度,實現(xiàn)結(jié)構(gòu)相似化合物及同分異構(gòu)體的分離,減少雜質(zhì)峰干擾,提高化合物響應(yīng),實驗對流動相進行了優(yōu)化,選擇甲醇、乙腈為有機相,同時在水相中添加甲酸、乙酸銨,考察分離效果。

實驗還考察了以乙腈為有機相,水相中分別加入乙酸銨、甲酸及二者均加入時4類藥物的色譜行為及靈敏度。結(jié)果表明,水相中只加入乙酸銨或甲酸時部分藥物峰響應(yīng)較低,部分峰形差且展寬嚴重,乙酸銨和甲酸均加入時4類藥物的峰形及靈敏度均較好?？赡茉蚴羌姿峥商峁〦SI源在Q1四極桿內(nèi)離子化所需的H+,促進了[M+H]+峰形成的同時抑制了目標化合物[M+Na]+峰的形成。此外,流動相在弱酸性環(huán)境條件下加入適量乙酸銨可以再次提高待測物離子化效率,且乙酸銨的加入還能夠調(diào)節(jié)溶液的離子強度,致使色譜峰形更加對稱[4,7]。經(jīng)對甲酸體積分數(shù)和乙酸銨濃度的考察,最終選擇乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.1 mmoL/L乙酸銨)為流動相。

(2)在ESI-模式下測定3種氯霉素類藥物。采用乙腈為流動相測定時,草魚等部分樣品中藥物受雜質(zhì)峰干擾大于甲醇。此外,水相中無論加氨水還是乙酸銨,樣品中藥物響應(yīng)均較純水時低。因此最終選擇甲醇-水為流動相。

優(yōu)化后的28種藥物的MRM色譜圖見圖1。

圖2 不同水解液對羅非魚中28種獸藥峰響應(yīng)強度的影響Fig. 2 Effect of different hydrolysates on the peak response intensities of the 28 veterinary drugs in tilapia samples

圖1 28種獸藥的MRM總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of the 28 veterinary drugs in MRM mode a. sulfonamides, quinolones, malachite green, leucomalachite green and nitrofuran metabolites; b. chloramphenicols.

2.2 樣品前處理條件

喹諾酮類、硝基呋喃類代謝物等部分藥物在肌體內(nèi)與蛋白質(zhì)具有較強的結(jié)合作用,但經(jīng)適當?shù)乃峄驂A水解后可游離出來[29,30]。因此本實驗通過選擇水解液、優(yōu)化提取條件和凈化材料等將水產(chǎn)品中5類藥物同時提取和凈化。

2.2.1樣品水解液

以羅非魚為例,添加同等濃度的獸藥標準溶液,然后分別用10.0 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液、甲酸溶液及1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液水解,衍生化反應(yīng)后提取、測定,考察各藥物的峰響應(yīng)情況。實驗結(jié)果表明,采用甲酸溶液水解時,大部分藥物的響應(yīng)低于采用磷酸氫二鉀及鹽酸溶液時的響應(yīng)。采用磷酸氫二鉀溶液水解時,氨基脲不出峰,且氯霉素類、孔雀石綠及代謝物、大多喹諾酮類、硝基呋喃類代謝物的響應(yīng)低于鹽酸溶液(見圖2)。因此本實驗最終選擇0.2 mol/L鹽酸為樣品的水解液。

實驗還考察了0.2 mol/L鹽酸溶液的加入體積(5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0和17.0 mL)對28種獸藥提取效率的影響。結(jié)果表明,當鹽酸加入量少時,部分藥物及內(nèi)標物的基質(zhì)效應(yīng)(ME)較強,提取效率偏低,氯霉素、AMOZ等受雜質(zhì)峰干擾較大。隨著加入鹽酸體積的增大,雜質(zhì)干擾逐漸減小,大多藥物及內(nèi)標物的提取效率逐漸增高,當鹽酸用量為13.0 mL時，大多數(shù)藥物回收率達到最佳且干擾最小,當鹽酸用量超過13 mL時,由于水相過多不利于部分藥物提取,導(dǎo)致提取效率降低。綜合考慮各種藥物提取效率及雜質(zhì)干擾情況,最終確定水解液體積為13.0 mL。

2.2.2提取條件優(yōu)化

多類殘留藥物同時檢測的難點在于提取試劑種類、提取試劑酸堿度、提取次數(shù)的選擇。標準方法[15]測定硝基呋喃代謝物時,衍生化反應(yīng)后需將樣品的pH值調(diào)至7.0～7.5,因此本實驗考察了磷酸氫二鉀溶液加入量與提取試劑、提取次數(shù)3個因素對28種藥物回收率的影響,每個因素取3個水平進行正交實驗(見表2)。

表 2 正交實驗條件

結(jié)果表明,對于磺胺類、喹諾酮類、三苯甲烷類、氯霉素類4類藥物而言,提取次數(shù)2次最好,其中部分藥物提取1次時回收率只有50%左右,而提取3次干擾雜質(zhì)峰較多;磷酸氫二鉀溶液加入0 mL時回收率最好,加入13 mL和26 mL時回收率相差不大;采用提取試劑乙腈時回收率最好,因此上述4類藥物的最優(yōu)方案為A2B1C2。對于硝基呋喃類代謝物,以上因素組合的27種方案中,采用A1B2C2與A2B1C2時,藥物的回收率及峰響應(yīng)高度均優(yōu)于其他25種方案,雖A1B2C2部分藥物響應(yīng)值略高于A2B1C2,但回收率采用內(nèi)標法計算,二者相差不大,且檢出限仍低于標準方法[15]。通過綜合分析,最終確定同時提取28種藥物的提取方案為A2B1C2，即采用乙腈提取2次。

由于樣品加入13.0 mL鹽酸水解時將大量的水帶入了提取液中,而乙腈與水混溶,若不將水去除,則難以將提取液濃縮至干,因此于樣品中加入提取試劑的同時再加入6～8 g氯化鈉至水相飽和,離心后取乙腈濃縮。與標準法[12-14]相比,不僅可大大減少濃縮時間,且由于在鹽析作用下,提取液中大量的雜質(zhì)沉淀于水相,因此還避免了濃縮時大量起泡的缺陷及泡沫溢出對目標物帶來的損失,也減少了雜質(zhì)對儀器的污染及對藥物峰的干擾。

2.2.3凈化條件優(yōu)化

樣品采用1.3.1節(jié)方法提取后將提取液濃縮至近干,加1.0 mL甲醇定容,過膜后上機測定。結(jié)果顯示,部分藥物回收率超出70%～120%范圍;部分樣品中氨基脲、氯霉素、氟甲砜霉素的色譜響應(yīng)較低且受雜質(zhì)峰干擾嚴重;不同批次的草魚、鯉魚中隱色孔雀石綠色譜響應(yīng)的重復(fù)性較差?？赡茉蚴腔|(zhì)中的雜質(zhì)與目標物相互競爭電離或目標物隨基質(zhì)共流出所致[31],而選擇合適的凈化方式及凈化材料除去雜質(zhì)可降低基質(zhì)效應(yīng),減少共流出。

圖3 去除凝膠狀物(a)前、(b)后草魚中氯霉素的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of chloramphenicol in grass carp (a) before and (b) after removing gelatinous substance

本文考察了正己烷液液萃取及分散固相萃取凈化的效果。結(jié)果表明,經(jīng)正己烷凈化后,氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的回收率有較大提高,實驗還觀察到,提取液加入正己烷，經(jīng)渦旋、離心后離心管底部聚集了一層凝膠狀物質(zhì),將去除凝膠狀物前、后的色譜圖進行對比,發(fā)現(xiàn)去除凝膠狀物后,氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的色譜響應(yīng)顯著增高,而干擾峰大大降低,從而推測氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的干擾峰及基質(zhì)抑制效應(yīng)是該凝膠狀物所致。以草魚中氯霉素為例的色譜圖見圖3。

此外,由于C18、PSA、NH2對樣品中的蛋白質(zhì)、脂類、脂肪酸及強極性雜質(zhì)等有較好的吸附效果,實驗根據(jù)樣品基質(zhì)的特點,將正己烷凈化后的提取液濃縮至近干,甲醇定容后再加入不同比例的C18、PSA與NH2材料(三者混合后加2.0 mL甲醇潤洗,去除上清液)分散固相萃取凈化,當三者用量分別為50、30和60 mg時,隱色孔雀石綠的色譜響應(yīng)值趨于穩(wěn)定,28種獸藥回收率均在70%～120%范圍內(nèi)。

因此,本實驗最終選擇向提取液中加入5～6 mL正己烷,經(jīng)渦旋、離心、去除正己烷及凝膠狀物后再采用50 mg C18、30 mg PSA和60 mg NH2填料進行分散固相萃取凈化。

表 3 28種獸藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area ratio of analyte to the internal standard;x: mass concentration of analyte, μg/L.

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是影響結(jié)果準確性的一個重要因素,常被用于評價樣品前處理方法,基質(zhì)效應(yīng)越強,方法的準確性越低。本文以例行監(jiān)測抽樣數(shù)量較大的鯉魚、草魚、羅非魚、對蝦等8種陰性樣品(下同)為基質(zhì),通過(基質(zhì)標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率-1)×100%來計算28種獸藥的基質(zhì)效應(yīng),以評價基質(zhì)中干擾物對目標分析物信號的影響。結(jié)果表明,28種獸藥中,大多數(shù)獸藥的|ME|在0～20%之間,為弱基質(zhì)效應(yīng),約3%獸藥的|ME|在20%～50%之間,為中等基質(zhì)效應(yīng)(見附表1,詳見https.//www.chrom-China.com)。表明采用該方法測定魚、蝦中本實驗考察的28種殘留獸藥時基質(zhì)干擾較小。

2.3.2線性范圍和檢出限

配制5類獸藥的系列標準溶液,以目標化合物定量離子與其內(nèi)標物峰面積之比對相應(yīng)的質(zhì)量濃度進行線性回歸,同時以陰性魚和蝦樣品為基質(zhì),以3倍和10倍信噪比對28種藥物進行檢出限和定量限的考察,結(jié)果見表3。28種獸藥在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系較好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.99,檢出限和定量限分別為0.1～0.8 μg/kg和0.3～2.7 μg/kg,與標準方法[12-15]相比,本方法具有更高的檢測靈敏度。

2.3.3回收率和精密度

分別添加約1、5、20倍定量限水平的28種混合標準溶液于魚和蝦陰性樣品中,進行加標回收率試驗,每個樣品基質(zhì)做6次平行試驗,計算其平均回收率及相對標準偏差(見附表2)。結(jié)果表明,5類獸藥的平均回收率為70.0%～120%,相對標準偏差為0.9%～10.0%。

2.4 實際樣品檢測

為了進一步驗證方法的可行性,應(yīng)用所建立的方法對經(jīng)標準方法測定有恩諾沙星(54.3 μg/kg)、AOZ(0.34 μg/kg)、SEM(0.79 μg/kg)檢出的鯽魚、鯉魚、蝦樣品進行檢測,定性結(jié)果與標準方法相同,其中恩諾沙星、AOZ及SEM含量分別為54.9、0.31和0.69 μg/kg,表明本方法可用于魚、蝦中5類禁、限用獸藥的測定。

3 結(jié)論

本文建立方法通過一次前處理完成了不同性質(zhì)的5類獸藥的提取和凈化,解決了水產(chǎn)品例行監(jiān)測完成這5類藥物測定需采用4種前處理及儀器分析方法的難題,可在短時間內(nèi)完成大批量樣品的檢測,大大降低了檢測成本,結(jié)果準確可靠,可為食品檢驗監(jiān)督機構(gòu)對魚、蝦中禁、限用獸藥殘留的測定提供更簡便、快捷、廉價的技術(shù)支持。