磁性氧化石墨烯的制備及其在環(huán)境水樣中7種內(nèi)分泌干擾物檢測(cè)中的應(yīng)用

郭菁豪, 童裳倫

(浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院, 浙江 杭州 310058)

隨著市政污水和養(yǎng)殖廢水的排放,人體和動(dòng)物排泄物及殘留動(dòng)物飼料中的雌酮、雌二醇、雌三醇等雌激素進(jìn)入環(huán)境水體[1],誘導(dǎo)魚類性別比例發(fā)生變化,使魚類種群的繁殖能力下降[2],對(duì)生物甚至人類的繁衍產(chǎn)生影響。乙炔基雌二醇等由人工合成的激素被用于避孕[3],更年期的激素替代療法中也會(huì)用到人工合成的雌激素。雙酚A等重要的化工原料也被發(fā)現(xiàn)具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[4],隨生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢水進(jìn)入環(huán)境,對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生威脅。這些天然或人工合成的化合物在環(huán)境中的濃度處于痕量水平時(shí),就會(huì)對(duì)生物和人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾,被統(tǒng)稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)。為了了解環(huán)境中EDCs的污染情況并為相關(guān)政策法規(guī)的制定提供數(shù)據(jù)支撐,開發(fā)測(cè)定水體中各EDCs濃度的方法具有重要意義。

EDCs分析方法已有高效液相色譜法、氣相色譜法、生物檢測(cè)法和毛細(xì)管電泳法等,其中最常用的是高效液相色譜或氣相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用[5-7]。這種組合具有良好的分離性能且靈敏度高,但存在儀器昂貴、測(cè)定成本高等缺點(diǎn)。磁固相萃取(MSPE)是近年來快速發(fā)展起來的一種樣品前處理方法[8-10]。該處理技術(shù)操作簡(jiǎn)便,材料易于制備且易于分散與分離[11]。石墨烯材料具有優(yōu)秀的吸附性能[12],氧化石墨烯表面基團(tuán)的存在使其易于修飾[13],非常適合用來制備磁固相萃取材料[14-16]。季翔等[17]用十二胺修飾石墨烯得到了氨基化的氧化石墨烯(A-GO),將其與尼龍6熔融共混以提高其力學(xué)性能。參考十二胺改性石墨烯的制備方法[18],本研究將氧化石墨烯進(jìn)行磁化,得到磁性氧化石墨烯(magnetic graphene oxide, MGO)。為進(jìn)一步提高材料對(duì)目標(biāo)EDCs的萃取效率,用十二胺(dodecylamine, DDA)對(duì)磁性石墨烯進(jìn)行修飾。將得到的磁固相萃取材料用于環(huán)境水樣中7種EDCs測(cè)定的樣品前處理。采用十二胺對(duì)磁性石墨烯進(jìn)行修飾可增加磁性石墨烯表面的疏水性,而這7種內(nèi)分泌干擾物是強(qiáng)疏水性物質(zhì),根據(jù)相似相溶原理,可以改善改性磁性石墨烯對(duì)這7種內(nèi)分泌干擾物的吸附性能,從而提高磁固相萃取材料對(duì)目標(biāo)分析物的萃取效率。將磁固相萃取與HPLC-UV結(jié)合,測(cè)定環(huán)境樣品中的EDCs濃度。該法簡(jiǎn)便快速,富集高效,可實(shí)現(xiàn)常規(guī)儀器分析,分析成本較低。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nicolet AVA TAR370傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司); X-pert Power X射線衍射儀(荷蘭PANalytical B. V.公司); MPMS-XL-5低溫磁場(chǎng)測(cè)試(美國(guó)量子設(shè)計(jì)儀器公司); Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)。

雌三醇、雙酚A、β-雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、雌酮、己烷雌酚和雄烯二酮均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,純度在98%以上。水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、氨水、濃硫酸、硝酸鈉、鹽酸、乙醇、丙酮、乙酸、石墨粉均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其中石墨粉純度為CP級(jí),其余均為AR級(jí)。高錳酸鉀購(gòu)于濟(jì)南蕭試化工有限公司,雙氧水購(gòu)于杭州高晶精細(xì)化工有限公司,純度均為AR級(jí)。十二胺、氯化亞鐵、甲醇和乙腈購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司,其中十二烷胺和氯化亞鐵為AR級(jí),甲醇和乙腈均為色譜級(jí)。

1.2 MGO-DDA材料的制備

在冰水浴中將23 mL濃H2SO4、1 g碳粉和0.5 g NaNO3攪拌0.5～1 h,使其充分混合均勻;緩慢加入3 g KMnO4,將溫度調(diào)節(jié)至10～15 ℃,攪拌0.5～1 h;升溫至35 ℃,繼續(xù)攪拌5 h后再加入3 g KMnO4, 35 ℃下繼續(xù)攪拌12 h;加入140 mL超純水?dāng)嚢?0 min,然后加入1.0 mL 30% H2O2,得到亮黃色溶液,終止反應(yīng)。將反應(yīng)得到的溶液在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心,用200 mL 30%鹽酸和超純水將其反復(fù)清洗至上清液的pH為4～5為止,收集下層沉淀,置于30 ℃真空干燥箱中干燥24 h,得到GO。

稱取0.3 g GO固體溶于100 mL超純水中,超聲1 h得到分散均勻的黃色GO溶液;取0.01 mol FeCl2·4H2O與0.02 mol FeCl3·6H2O溶于10 mL超純水中,超聲10 min,通氮?dú)?0 min后將其逐滴加入到GO溶液中,在氮?dú)鈿夥毡Ｗo(hù)下攪拌2 h;將體系升溫至65 ℃,以10滴/min的速度加入28%的氨水,將體系pH調(diào)節(jié)至11,攪拌2 h。反應(yīng)停止后,收集得到黑色沉淀,用乙醇和超純水進(jìn)行多次洗滌,然后將其置于40 ℃真空干燥箱中干燥12 h,得到MGO。

稱取0.4 g按照上述方法合成的MGO,分散于10 mL超純水中。取0.3 g DDA溶于10 mL乙醇中,將MGO和DDA兩種溶液在錐形瓶中混合,室溫下攪拌20 h。得到的固體用乙醇、超純水和丙酮反復(fù)洗滌后,置于40 ℃真空干燥箱中干燥,即可得到MGO-DDA。

1.3 磁固相萃取實(shí)驗(yàn)

稱取80 mg MGO-DDA加入200 mL待測(cè)水樣中,將樣品瓶置于轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫振蕩器中振蕩搖勻30 min后取出,置于外加磁場(chǎng)中,待吸附了EDCs的MGO-DDA與水樣分離完全后,將上清液倒出。用不多于50 mL的超純水將MGO-DDA轉(zhuǎn)移至50 mL燒杯中,在外加磁場(chǎng)作用下將MGO-DDA與水分離,棄去上清液后放置片刻。依次加入5 mL丙酮與5 mL含1%乙酸的丙酮將EDCs從MGO-DDA上洗脫下來,收集洗脫液,緩慢氮吹至干,最后加入乙腈和水的混合液(體積比57∶43),定容至0.5 mL,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC分析。

環(huán)境水樣采集后先用0.45 μm的混合纖維素酯濾膜過濾,除去水樣中懸浮雜質(zhì)和微生物,然后在4 ℃下避光保存,用于樣品分析。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的環(huán)境水樣,如醫(yī)院排放的廢水,在MSPE過程中,將凈化溶劑從超純水改為甲醇和水(體積比1∶1)的混合溶液,以去除雜質(zhì)干擾。

圖2 (a)MGO和MGO-DDA的傅里葉紅外光譜圖和(b)MGO-DDA的磁滯回線Fig. 2 (a) FTIR spectrum of MGO and MGO-DDA and (b) the magnetic hysteresis loop of MGO-DDA

1.4 液相色譜條件

HPLC分析所采用的色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),溫度為35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm,進(jìn)樣體積20 μL,流動(dòng)相為乙腈和水(體積比57∶43),流速0.7 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 MGO-DDA材料的表征

用XRD表征合成的MGO-DDA材料,結(jié)果如圖1所示。2θ=30.18°(220)、35.56°(311)、42.86°(400)、57.16°(511)、62.92°(440)處的峰與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS card No.19-0629)一致,這表明MGO-DDA材料中存在磁性組分Fe3O4。

圖1 MGO-DDA材料的X射線衍射圖及與Fe3O4準(zhǔn)卡片的對(duì)比Fig. 1 XRD spectrum of the synthesized MGO-DDA and the comparison with standard JCPDS card of Fe3O4 MGO: magnetic graphene oxide; DDA: dodecylamine; JCPDS: Joint Committee on Powder Diffraction Standards.

對(duì)合成的MGO和MGO-DDA進(jìn)行FTIR表征,結(jié)果如圖2a所示。MGO的FTIR圖譜中,3 379 cm-1處的寬峰為-COOH中的O-H鍵,1 633 cm-1處的峰為芳香環(huán)中的C=C鍵伸縮振動(dòng)所致,1 775 cm-1處的峰為羧基中C=O鍵的吸收峰,峰1 405 cm-1也歸屬于羧基-COOH,峰1 162 cm-1為環(huán)氧基中的C-O鍵伸縮振動(dòng)所致,峰566 cm-1則歸屬于Fe-O鍵。從MGO-DDA的FTIR圖譜可以看出,1 775 cm-1和1 405 cm-1處的峰消失,說明-COOH與-NH2發(fā)生了反應(yīng),表明DDA成功修飾在MGO表面。MGO-DDA材料的磁滯回線如圖2b所示,結(jié)果表明合成的MGO-DDA材料具有超順磁性,其飽和磁化強(qiáng)度為30.91 emu/g,足以在外加磁場(chǎng)作用下從200 mL水樣中分離回收。

圖3 MGO-DDA中MGO和DDA質(zhì)量比對(duì)EDCs萃取效率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of MGO/DDA mass ratios in MGO-DDA on the extraction efficiencies of EDCs (n=3) EDCs: endocrine-disrupting chemicals; E1: estrone; E2: β-estradiol; E3: estriol; EE2: 17α-ethynylestradiol; HEX: hexoestrol; AND: androstendione; BPA: bisphenol A.

2.2 磁固相萃取條件的優(yōu)化

以200 mL超純水配制水樣,各目標(biāo)分析物濃度均為5.0×10-8mol/L。將合成的MGO和MGO-DDA分別作為吸附劑,對(duì)水樣中的EDCs進(jìn)行磁固相萃取,7種目標(biāo)物的回收率如圖3所示。修飾了DDA的磁石墨烯納米材料對(duì)目標(biāo)物的吸附效果明顯好于MGO, 7種EDCs的回收率分布在74.47%～91.32%之間。這是由于DDA的修飾增強(qiáng)了MGO表面的疏水性,使疏水性的目標(biāo)物EDCs更易吸附在MGO-DDA材料表面。MGO-DDA材料中MGO/DDA組分的變化對(duì)EDCs回收率的影響如圖3所示。MGO-DDA材料合成過程中,當(dāng)MGO與DDA的質(zhì)量比為1∶1.5、1∶0.75和1∶0.5時(shí),EDCs的回收率無明顯的變化,表明DDA的修飾量已滿足需求,材料合成時(shí)MGO與DDA的質(zhì)量比選擇1∶0.75?？疾炝薓GO-DDA材料用量對(duì)于200 mL水樣磁固相萃取的影響,EDCs回收率的變化情況如圖4所示。80 mg MGO-DDA材料可以滿足EDCs的磁固相萃取需求。

圖4 MGO-DDA材料用量對(duì)EDCs萃取效率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of the dosage of MGO-DDA on the extraction efficiencies of EDCs (n=3)

磁固相萃取過程中,水樣的pH、吸附時(shí)間、洗脫液的種類和體積都會(huì)對(duì)萃取效率產(chǎn)生影響,圖5顯示了不同的萃取條件對(duì)7種目標(biāo)分析物萃取效率的影響。實(shí)驗(yàn)表明,水樣的pH在3～9之間變化時(shí),MGO-DDA對(duì)EDCs的萃取效率不會(huì)受到影響。MGO-DDA材料吸附時(shí)間為20 min時(shí),MGO-DDA對(duì)目標(biāo)分析物有較好的吸附效果。洗脫液采用四氫呋喃、乙酸乙酯和氯仿時(shí),MGO-DDA易發(fā)生團(tuán)聚,不能與洗脫溶劑充分接觸;使用甲醇或乙腈進(jìn)行洗脫時(shí),洗脫效果不如丙酮;在丙酮中加入一定量的乙酸,回收效果進(jìn)一步提高;丙酮中乙酸含量為1%與5%時(shí),洗脫效果無太大的差異。含1%乙酸的丙酮被用作第二次洗脫的洗脫劑,丙酮作為第一次洗脫的洗脫劑,兩次洗脫可以達(dá)到理想的洗脫效果。洗脫劑的體積為2、4、6、8 mL時(shí),隨著洗脫液體積的增大,EDCs的回收效果逐步提高。為快速富集和充分洗脫目標(biāo)分析物,磁固相萃取過程中,吸附時(shí)間選擇20 min,洗脫過程中先用5 mL丙酮進(jìn)行一次洗脫,再用5 mL含1%乙酸的丙酮進(jìn)行二次洗脫。

2.3 方法的線性范圍與檢出限

在最佳的磁固相萃取條件和液相色譜條件下,MSPE-HPLC-UVD方法的線性范圍和檢出限如表1所示。通過MSPE 400倍的富集,EDCs的檢出限低至0.10～0.23 nmol/L,在1.0～100.0 nmol/L的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,7種EDCs的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。同時(shí)進(jìn)行了精密度試驗(yàn),同一天內(nèi)重復(fù)5次測(cè)定的保留時(shí)間和回收率的日內(nèi)RSD,以及重復(fù)5天得到的日間RSD均小于5%。

2.4 環(huán)境樣品的測(cè)定

分別采集了杭州某醫(yī)院的廢水樣品與杭州某湖水樣品,水樣用濾膜過濾,去除其中的懸浮雜質(zhì),然后用MGO-DDA材料進(jìn)行MSPE處理,最后用HPLC-UV測(cè)定,采集的水樣中均未檢出7種EDCs。

表 1 方法的線性范圍與檢出限

y: peak area;x: concentration, nmol/L.

圖6 (a)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 μmol/L)與加標(biāo)50.0 nmol/L的(b)廢水和(c)湖水樣品的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of (a) standard solution (0.2 μmol/L) and spiked samples of (b) sewage water and (c) lake water at 50.0 nmol/L

在采集的廢水和湖水樣品中進(jìn)行2個(gè)不同濃度水平(5.0、50.0 nmol/L)的加標(biāo),對(duì)加標(biāo)的水樣用上述同樣的步驟進(jìn)行樣品處理,最后用HPLC-UV進(jìn)行測(cè)定,標(biāo)樣與加標(biāo)廢水與湖水水樣的色譜圖見圖6。7種目標(biāo)分析物EDCs的回收率見表2,加標(biāo)廢水樣品的EDCs回收率在73.9%～112.9%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～11.8%之間;加標(biāo)湖水樣品的EDCs回收率在74.9%～114.7%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～5.6%之間。

表 2 水樣中EDCs的加標(biāo)回收率

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3 結(jié)論

本研究合成了一種十二胺修飾的磁性氧化石墨烯材料,并結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測(cè)建立了一種對(duì)環(huán)境水樣中7種內(nèi)分泌干擾物的分析方法,并將其應(yīng)用于環(huán)境水樣中內(nèi)分泌干擾物的測(cè)定,取得令人滿意的結(jié)果。該法操作簡(jiǎn)便,快速,富集高效,可靈敏檢測(cè)環(huán)境樣品中的內(nèi)分泌干擾物,有助于在普通實(shí)驗(yàn)室用低成本與常規(guī)儀器對(duì)環(huán)境樣品中內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行分析研究。