1,6-二磷酸果糖三鈉鹽的毒理學(xué)研究

郭婉，王穎艷，張彪

（張家港市華天藥業(yè)有限公司，江蘇 張家港）

0 引言

1,6-二磷酸果糖三鈉鹽（Fructose 1,6-diphosphate trisodium salt），簡(jiǎn)稱FDP，是糖酵解過(guò)程中一種重要的代謝產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)糖酵解中限速酶磷酸果糖激酶及丙酮酸酶活性的功效，可以從分子水平恢復(fù)、改善細(xì)胞代謝[1-2]。其口服制劑和注射液臨床上多用于治療心絞痛、心肌缺血、心肌梗死、休克或大面積燒傷等[3-4]。除了臨床應(yīng)用外，F(xiàn)DP還具有抗疲勞、耐缺氧的保健功能。關(guān)于FDP的安全性，已經(jīng)有注射毒性研究的報(bào)道[5-6]。本文針對(duì)1,6-二磷酸果糖三鈉鹽（FDP）的口服應(yīng)用，進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)和遺傳毒性試驗(yàn)，為口服用藥和保健食品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1,6-二磷酸果糖三鈉鹽，白色結(jié)晶粉末，純度≥96%，由國(guó)內(nèi)某企業(yè)提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康SPF級(jí)昆明種小鼠。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度20℃～24℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)（最大耐受量MTD試驗(yàn)）

健康昆明種小鼠20只，雌雄各占一半，體重為18～22g。取樣品10g，用蒸餾水溶解并定容至25mL，小鼠空腹16h后，每次間隔4h，以0.25mL/10g.bw容量灌胃2次，總劑量為20.0g/kg.bw，連續(xù)觀察14天并記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.3.2 遺傳毒性試驗(yàn)

1.3.2.1 Ames試驗(yàn)

采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗(yàn)菌進(jìn)行試驗(yàn)，多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿為體外代謝活化系統(tǒng)。試驗(yàn)組設(shè) 8、40、200、1000、5000μg/皿 5 個(gè)劑量，每個(gè)劑量做3個(gè)平行。稱取1.25g樣品，用蒸餾水溶解并定容至25mL，混勻，滅菌，4℃存放備用。臨用前將上述溶液依次用滅菌蒸餾水稀釋成：50000μg/mL（原液）、10000μg/mL、2000μg/mL、400μg/mL、80μg/mL。在頂層瓊脂中加入0.1mL試驗(yàn)菌液、0.1mL受試樣品溶液（溶劑對(duì)照組加0.1mL滅菌蒸餾水）和0.5mL S-9混合液（需要代謝活化時(shí)），混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板。設(shè)自發(fā)回變和陽(yáng)性對(duì)照。37℃培養(yǎng)48h并計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。受試物的回變菌落數(shù)達(dá)到自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系則為陽(yáng)性。試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)操作兩次。

1.3.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

篩選50只體重25g～30g小鼠，隨機(jī)分5組，每組10只，雌雄各半。受試物設(shè)2.50、5.00、10.00g/kg.bw三個(gè)劑量。以環(huán)磷酰胺（劑量為40mg/kg.bw）為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照。分別稱量受試物 2.50、5.00、10.00g，用蒸餾水溶解，定容至25mL，灌胃量為0.25mL/10g.bw。間隔24h，共灌胃2次，末次灌胃后6h，處死小鼠，取胸骨骨髓涂片并固定染色，在光學(xué)顯微鏡下，觀察200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞PCE并計(jì)數(shù)正染紅細(xì)胞NCE，計(jì)算PCE/NCE比值，每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，對(duì)微核率（以含微核的嗜多染紅細(xì)胞千分率計(jì)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

篩選25只體重30g-35g的性成熟雄性小鼠，隨機(jī)分5組，每組5只，受試物劑量分別為2.50、5.00、10.00g/kg.bw。以環(huán)磷酰胺（40mg/kg.bw）為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照。分別稱取受試物 2.50、5.00、10.00g，用蒸餾水溶解，定容至 25mL，灌胃量為0.25mL/10g.bw。每天灌胃，連續(xù)5天，末次灌胃后30天處死小鼠，取附睪制片，染色，每組統(tǒng)計(jì)5只動(dòng)物，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)精子，要求結(jié)構(gòu)完整，計(jì)算精子畸形率（以百分率計(jì)）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

由表1可見(jiàn)，將1，6-二磷酸果糖三鈉鹽以20.0g/kg.bw的劑量給小鼠灌胃后，部分小鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，易跌倒，約45min后癥狀消失，繼續(xù)觀察14天，無(wú)明顯的中毒癥狀，也無(wú)死亡。將小鼠處死后進(jìn)行解剖檢查，心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、胃、腸等主要器官，均未見(jiàn)明顯異常改變。受試樣品對(duì)雌雄小鼠的MTD均大于20.0g/kg.bw。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 Ames 試驗(yàn)

由表2、表3可見(jiàn)，1，6-二磷酸果糖三鈉鹽各劑量組回變菌落數(shù)均不超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，且無(wú)劑量-效應(yīng)關(guān)系，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌四株菌株，在加與不加S-9混合液時(shí)，均未呈現(xiàn)遺傳毒性。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表4可見(jiàn)，1，6-二磷酸果糖三鈉鹽各劑量組與陰性對(duì)照組相比微核率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；環(huán)磷酰胺組與陰性對(duì)照相比有顯著性差異（P＜0.01）。1,6-二磷酸果糖三鈉鹽對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率無(wú)影響。各組未見(jiàn)明顯細(xì)胞毒性。

表2 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽-Ames試驗(yàn)結(jié)果1

表3 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽-Ames試驗(yàn)結(jié)果2

表5 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽對(duì)小鼠精子畸形率的影響

2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

受試物各劑量組小鼠精子畸形率分別為1.84%、1.76%、1.90%，與陰性對(duì)照組1.82%相比差異不顯著性（P＞0.05），而環(huán)磷酰胺組精子畸形率5.18%與陰性對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.01）。1，6-二磷酸果糖三鈉鹽對(duì)小鼠精子畸形率無(wú)影響。

3 結(jié)論

表4 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽對(duì)小鼠骨髓微核率的影響

經(jīng)口給予小鼠1,6-二磷酸果糖三鈉鹽進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，兩種性別動(dòng)物的MTD均大于20.0g/kg.bw。按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）[7]中的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，1,6-二磷酸果糖三鈉鹽屬于無(wú)毒級(jí)。遺傳毒性試驗(yàn)中，1,6-二磷酸果糖三鈉鹽Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性，對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和小鼠精子畸形率均無(wú)影響，無(wú)遺傳毒性。

4 討論

1，6-二磷酸果糖三鈉鹽是以葡萄糖為原料，經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵制成的。據(jù)報(bào)道，口服1，6-二磷酸果糖三鈉鹽具有抗酒精中毒、抗疲勞、耐缺氧的功效[8-11]，作為保健食品原料有很好的應(yīng)用前景。馮美云等研究了1，6-二磷酸果糖營(yíng)養(yǎng)液對(duì)人體抗疲勞能力的影響，試驗(yàn)組服用1.8g/d，可加快運(yùn)動(dòng)后心率的恢復(fù)，增加血乳酸的消除速率，提高無(wú)氧代謝的輸出功率和總功[12]。Chen Hongnian等人研究了1,6-二磷酸果糖鈉鹽抗疲勞作用的藥效學(xué)，實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)員服用1，6-二磷酸果糖鈉鹽可加快消除血乳酸、降低訓(xùn)練后肌酸激酶水平，恢復(fù)磷酸果糖激酶活性，在厭氧訓(xùn)練后抗疲勞作用明顯[13]。上述文獻(xiàn)[8-13]中試驗(yàn)動(dòng)物和運(yùn)動(dòng)員均未出現(xiàn)不良反應(yīng)的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)1，6-二磷酸果糖三鈉鹽的安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，小鼠的最大耐受量大于20.0g/kg.bw，屬于無(wú)毒級(jí)且無(wú)遺傳毒性，為進(jìn)一步的安全論證和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。