維生素D3對(duì)自發(fā)高血壓大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管內(nèi)皮依賴的收縮及舒張的影響機(jī)制研究

屈 晨 祝 巖

高血壓是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。高血壓會(huì)損害血管內(nèi)皮的功能, 同時(shí)血管內(nèi)皮的功能障礙反之也會(huì)加重并惡化高血壓愈后，因此血管內(nèi)皮收縮因子的增多與減少被認(rèn)為是高血壓病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要因素[1，2]。同時(shí)血管內(nèi)皮的功能異常在高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病及缺血-再灌注損傷、休克等許多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的意義[3～5]。研究表明，人體內(nèi)維生素D的水平與心力衰竭、心血管疾病的發(fā)生率呈反比[6～8]。人們發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期接受維生素D的治療后， 慢性腎功能不全患者的心血管事件的發(fā)生率以及病死率有明顯降低的趨勢(shì)，并且透析前死亡風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)降低[9，10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血液中的1，25二羥基維生素D的濃度越低，心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)越高[11]。維生素D3是維生素D族中有著最高生物代謝率的一種活性形式，與動(dòng)脈血壓呈負(fù)相關(guān)[12～14]。研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)體產(chǎn)生或者攝入維生素D不足會(huì)有更高的高血壓易患因素[15～17]。

雖然維生素D3在降壓方面的研究很多，但涉及血管內(nèi)皮收縮與舒張的作用及機(jī)制的研究尚少。本研究旨在探討維生素D3對(duì)高血壓狀態(tài)下血管內(nèi)皮舒張與收縮的影響及環(huán)氧化酶(COX)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)制研究，以探討維生素D3的抗血管收縮及抗高血壓保護(hù)作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:選擇雄性自發(fā)性高血壓病大鼠(spontaneously hypertensive rats SHR)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，38～42周齡，體質(zhì)量600～800g，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)量老鼠血壓≥160/90mmHg(1mmHg=0.133kPa)可以入組。將大鼠分為維生素D3治療組和對(duì)照組，每組20只。維生素D3治療組給予維生素D310ng/(100g·d)灌胃，持續(xù)3周治療；對(duì)照組給予蒸餾水1ml/(kg·d)灌胃，療程3周。所有大鼠給予正常喂食及飲水，每日喂藥前測(cè)量體質(zhì)量。3周的治療結(jié)束后，測(cè)量血壓，給予自發(fā)性高血壓病大鼠苯巴比妥70mg/kg腹膜下麻醉，留取血樣，離取主動(dòng)脈環(huán)用于實(shí)驗(yàn)。

2.試劑與儀器：換能器(美國(guó)Assay Designs公司)，放大器(Powerlab model ML785 and ML119)，多導(dǎo)生理記錄儀(美國(guó)AD Instruments公司)，Bio-Rad蛋白分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；一氧化氮合成酶抗體及環(huán)氧化酶-1抗體(美國(guó)R&D公司)，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體(美國(guó)R&D公司)。ELISA試劑盒 (美國(guó)Caymen Chemical公司) 測(cè)量?jī)?nèi)皮收縮因子的釋放。

3.實(shí)驗(yàn)方法：(1)對(duì)自發(fā)性高血壓病大鼠每日測(cè)量體質(zhì)量。直到實(shí)驗(yàn)前記錄并比較兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量變化。(2)經(jīng)給藥3周后，對(duì)比維生素D3治療組及對(duì)照組自發(fā)性高血壓病大鼠血壓的變化。采用Tail-cuff方法測(cè)量鼠尾的血壓。(3)血管張力的測(cè)定：離取大鼠的主動(dòng)脈，阻斷血流，離斷血管后10min內(nèi)獲得靶血管，保存在4℃克-林二氏重碳酸鹽緩沖液中。觀察靶血管管壁有無(wú)肉眼可見(jiàn)病變或是動(dòng)脈粥樣硬化性改變。取得的血管環(huán)用兩根鋼絲牽引，操作在10ml的組織水浴槽(37℃、pH 7.4、95% O2、5% CO2)中進(jìn)行。拉力傳感器、換能器、放大器及多導(dǎo)生理記錄儀等檢測(cè)設(shè)備連接鋼絲的一端上，用以記錄等長(zhǎng)張力的變化；鋼絲另一端則固定于可以精細(xì)調(diào)節(jié)的裝置上用以調(diào)節(jié)被動(dòng)張力。組織水浴槽需要用緩沖液沖洗，間隔15min，直至平衡至少90min。在此期間，讓實(shí)驗(yàn)血管環(huán)逐漸達(dá)到最佳靜息張力狀態(tài)?？山o予2.5g血管環(huán)靜止的持續(xù)性張力，該狀態(tài)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，即所有實(shí)驗(yàn)均在此狀態(tài)/實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上完成。部分實(shí)驗(yàn)中通過(guò)浸泡血管環(huán)于triton溶液中(0.1%)30s，從而去除血管內(nèi)皮，用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。(4)一氧化氮(NO)測(cè)定：給藥3周后，維生素D3治療組及對(duì)照組自發(fā)性高血壓病大鼠給予戊巴比妥100mg/kg皮下注射麻醉后，留取血液樣本。購(gòu)買ELISA試劑盒，測(cè)量NO含量。(5)一氧化氮合成酶、環(huán)氧化酶-1(COX-1)蛋白表達(dá)：將血管組織冷凍于提取緩沖液(1∶3wt/vol)，主要成分為140mmol/L NaCl，10mmol/L Tris HCl, pH 7.5，1mmol/L EDTA,25%甘油, 0.5% SDS, 0.5% 已基苯基聚乙二醇(Nonident P-40), 0.1mmol/L PMSF, 100ng/ml 蛋白酶混合抑制劑；然后行均質(zhì)化處理(30s、2000r/min)。離心(4℃、10min、14000r/min), 采用Western blot法來(lái)測(cè)量上清液蛋白濃度，采用Bio-Rad蛋白分析儀，-80℃液氮冷凍保存。在十二烷基磺酸鈉中加入血管胞質(zhì)蛋白40μg,95～100℃ 5min。然后行10%十二烷基磷酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜,置于5%脫脂奶粉溶于TBST中2h。將山羊抗人一氧化氮合成酶及環(huán)氧化酶-1抗體以1∶400比例稀釋于TBST(含5%牛血清白蛋白)中，4℃過(guò)夜。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體1∶2000稀釋于TBST(含5%脫脂奶粉)中,室溫孵育1.5～2.0h，再次洗膜。然后與1∶20稀釋的LumiGLOTM發(fā)光劑及過(guò)氧化物反應(yīng)1min,自顯影。(6)血管內(nèi)皮收縮因子測(cè)定：離體血管環(huán)經(jīng)過(guò)收縮實(shí)驗(yàn)后前列腺素釋放內(nèi)皮依賴性收縮因子，主要包括(PG)F1α(PGF1α)、PGF2α和血栓素A2，收集浴槽內(nèi)液體通過(guò)ELISA法進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.體質(zhì)量及血壓改變：經(jīng)過(guò)維生素D3長(zhǎng)期應(yīng)用，治療組體質(zhì)量保持上升，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量在20天時(shí)開(kāi)始呈下降趨勢(shì)(圖1A)，治療組血壓較對(duì)照組血壓明顯下降(圖1B)。

圖1 維生素D3對(duì)體質(zhì)量及血壓的影響A.體質(zhì)量；B.血壓;與對(duì)照組比較,*P<0.05

2.離體主動(dòng)脈血管張力測(cè)定結(jié)果：給予維生素D3治療3周后，比較主動(dòng)脈環(huán)(有血管內(nèi)皮)的藥物濃度舒張曲線。維生素D3治療組血管環(huán)的藥物濃度舒張曲線較對(duì)照組降增加達(dá)43.0%±2.3%。隨之繼發(fā)性血管收縮(圖2A)。給予維生素D3治療3周后，比較主動(dòng)脈環(huán)(無(wú)血管內(nèi)皮)對(duì)硝普鈉的藥物濃度舒張曲線。維生素D3治療組血管環(huán)的藥物濃度舒張曲線較對(duì)照組無(wú)改變(圖2B)。給予維生素D3治療3周后，比較主動(dòng)脈環(huán)的藥物濃度收縮曲線。維生素D3治療組主動(dòng)脈環(huán)的藥物濃度收縮曲線較對(duì)照組降低血管收縮達(dá)24.0%±1.5%。無(wú)血管內(nèi)皮組，無(wú)明顯血管收縮(圖2C)。

圖2 維生素D3對(duì)血管張力的影響A.血管舒張；B.血管舒張；C.血管收縮；與其他3組比較，*P=0.001；與對(duì)照組(有血管內(nèi)皮)比較，#P=0.007;與對(duì)照組(無(wú)血管內(nèi)皮)比較，ΔP=0.021

3.NO含量測(cè)定：經(jīng)過(guò)維生素D3長(zhǎng)期給藥，維生素D3治療組一氧化氮釋放較對(duì)照組明顯上升，詳見(jiàn)圖3。

4.血管內(nèi)皮一氧化氮合成酶的蛋白表達(dá)：在自發(fā)性高血壓病大鼠經(jīng)過(guò)3周維生素D3給藥后，在有血管內(nèi)皮存在的基礎(chǔ)上，一氧化氮合成酶表達(dá)明顯增加，詳見(jiàn)圖4。

5.血管內(nèi)皮環(huán)氧化酶-1蛋白表達(dá)：在自發(fā)性高血壓病大鼠中，給予維生素D3藥物治療3周后，在有血管內(nèi)皮存在的基礎(chǔ)上，環(huán)氧化酶-1表達(dá)明顯減少，無(wú)血管內(nèi)皮的存在，環(huán)氧化酶-1的表達(dá)無(wú)區(qū)別，詳見(jiàn)圖5。

圖3 一氧化氮的表達(dá)與對(duì)照組比較，*P=0.001

6.血管內(nèi)皮收縮因子的釋放：血管內(nèi)皮收縮因子的釋放主要依賴測(cè)定其代謝產(chǎn)物的表達(dá)。與對(duì)照組比較，維生素D3可以明顯減少6-keto prostaglandin F1α(PGF1α, 前列環(huán)素的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物)、PGF2α和thromboxane B2(血栓素A2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物)的釋放，與對(duì)照組釋放相似，詳見(jiàn)圖6。

討 論

血管內(nèi)皮可以通過(guò)釋放血管活性物質(zhì)控制內(nèi)皮下平滑肌細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)血管緊張性的作用[18]。本研究應(yīng)用乙酰膽堿激發(fā)的血管舒張實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在有血管內(nèi)皮的情況下，長(zhǎng)期維生素D3治療可以增加內(nèi)皮依賴的血管舒張作用；在沒(méi)有血管內(nèi)皮的情況下，血管不產(chǎn)生舒張，治療組和對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，在應(yīng)用A23187激發(fā)的血管收縮實(shí)驗(yàn)中，也獲得了與乙酰膽堿舒張實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的趨勢(shì)，即有血管內(nèi)皮存在可增加收縮作用，無(wú)血管內(nèi)皮則無(wú)效果。應(yīng)用硝普鈉進(jìn)行管舒張實(shí)驗(yàn)顯示，維生素D3治療組與對(duì)照組比較，血管舒張程度一致，既不受有無(wú)血管內(nèi)皮的影響，也不受藥物治療影響。這些現(xiàn)象證明了長(zhǎng)期維生素D3治療影響血管的收縮與舒張沒(méi)有改變自發(fā)高血壓大鼠的主動(dòng)脈血管平滑肌的生物活性，只對(duì)血管內(nèi)皮起到有效的作用。與此同時(shí)，血管內(nèi)皮依賴的血管張力實(shí)驗(yàn)證明，血管舒張?jiān)陂L(zhǎng)期治療給藥后可以得到明顯修復(fù)；血管的收縮明顯降低，證明了血管舒張與血管內(nèi)皮收縮存在一種平衡機(jī)制，相互協(xié)調(diào)與制約。這也說(shuō)明在疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中血管內(nèi)皮的活性變化是制約血管收縮與舒張的先決條件。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中一氧化氮及收縮因子的測(cè)定更進(jìn)一步證明了該結(jié)論。

圖4 一氧化氮合成酶的蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，*P=0.021

圖5 環(huán)氧化酶-1蛋白表達(dá)

圖6 血管內(nèi)皮收縮因子的測(cè)定A.6-酮前列腺素 F1α(PGF1α)；B.前列腺素F2α(PGF2α)；C.血栓素 B2；與對(duì)照組比較，*P=0.017,#P=0.013,ΔP=0.012

在眾多血管內(nèi)皮釋放因子中，由一氧化氮合成酶合成的一氧化氮在內(nèi)皮依賴性血管舒張因子中起到最為重要的作用[19～21]。血管內(nèi)皮的損傷通常發(fā)生在一氧化氮合成酶表達(dá)降低，一氧化氮合成減少，如高血壓[22]。維生素D3對(duì)血管內(nèi)皮有良好的保護(hù)作用，同時(shí)可以增加一氧化氮合成酶的活性作用[23]。除了釋放一氧化氮之外，血管內(nèi)皮可以在一氧化氮合成減少的情況下，釋放血管收縮活性物質(zhì)，如前列腺素類，從而導(dǎo)致血管收縮更加嚴(yán)重[24]。本研究旨在證明在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)期應(yīng)用維生素D3是否可以影響血管內(nèi)皮的收縮。血管內(nèi)皮收縮因子的產(chǎn)生是通過(guò)環(huán)氧化酶(COX)介導(dǎo)的。環(huán)氧化酶-1被證實(shí)是介導(dǎo)血管內(nèi)皮收縮因子產(chǎn)生的關(guān)鍵酶[25]。本研究中，自發(fā)高血壓大鼠經(jīng)過(guò)3周維生素D3治療后，環(huán)氧化酶-1的表達(dá)明顯降低，環(huán)氧化酶-2無(wú)改變(該組數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。因此環(huán)氧化酶-1被證實(shí)是在自發(fā)高血壓大鼠中介導(dǎo)血管內(nèi)皮收縮因子產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。當(dāng)考慮到血管內(nèi)皮收縮時(shí)，很多實(shí)驗(yàn)主要考慮到的影響血管內(nèi)皮收縮因子合成的酶即為環(huán)氧化酶-1。有研究證明，在自發(fā)高血壓大鼠中，環(huán)氧化酶-1的表達(dá)是增高的。維生素D3長(zhǎng)時(shí)間干預(yù)后，自發(fā)性高血壓病大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的收縮較對(duì)照組明顯減低，收縮狀態(tài)得到明顯改善，結(jié)果提示維生素D3是血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)性修復(fù)因素。綜上所述，環(huán)氧化酶-1蛋白的表達(dá)在維生素D3長(zhǎng)期給藥后明顯減少，證明維生素D3可以改變環(huán)氧化酶-1的表達(dá)在有疾患的血管，并且可以減少環(huán)氧化酶-1的過(guò)度表達(dá)。

維生素D3是維生素D主要活化形式，其血清濃度與動(dòng)脈血壓的數(shù)值呈反比關(guān)系[12]。在大鼠中維生素D的缺乏已被證實(shí)與心肌纖維化和心肌肥厚明顯相關(guān)。日前可以系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的方法并不多見(jiàn)，而維生素D3可以做到。這是一種修復(fù)心血管系統(tǒng)的非常廉價(jià)的措施。維生素D3可通過(guò)刺激一氧化氮產(chǎn)生，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度，從而改善血流，起到保護(hù)血管的作用。曬太陽(yáng)會(huì)使身體自然產(chǎn)生維生素D3，但僅通過(guò)這一途徑難以獲取足夠的維生素D3，并且在陽(yáng)光中過(guò)多暴曬會(huì)增高皮膚癌等患病風(fēng)險(xiǎn)。而口服補(bǔ)充外源性的維生素D3就更容易實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，長(zhǎng)期持續(xù)給予維生素D3治療可以減少自發(fā)高血壓大鼠主動(dòng)脈的血管內(nèi)皮收縮，這種抑制效應(yīng)伴隨著血壓的下降、一氧化氮合成酶的升高及環(huán)氧化酶-1的合成減少。受研究條件和動(dòng)物數(shù)量所限，本研究仍然存在一定局限性，如只研究了一個(gè)劑量的維生素D3治療組，未能進(jìn)行不同治療劑量之間效果差異的對(duì)比；未能進(jìn)行不同給藥時(shí)間情況下各項(xiàng)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。后續(xù)研究筆者將增加劑量和時(shí)間點(diǎn)的設(shè)置，并采用蛋白組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量檢測(cè)手段，在基因調(diào)控和蛋白表達(dá)的水平上對(duì)該機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步闡明。