不育男性患者Y染色體AZF區(qū)域微缺失及臨床表現

楊舒婷 周明連 湯欣欣 毛華芬 張璟璐 許天龍 顧 瑩 王雷雷

江蘇省連云港市婦幼保健院(222006)

相關統(tǒng)計表明不育中男性因素為30%～50%[1]。多種原因能夠導致男性不育，遺傳因素成為重要原因， Y染色體微缺失成為繼克氏綜合征后男性不育的第二大遺傳因素[2]。Y染色體微缺失的分子遺傳研究也越來越深入[3]。Y染色體長臂l區(qū)l帶(Yq11)上含有與精子發(fā)生有關基因，又稱之為無精子因子(AZF)。AZF被定位于Yq11遠端，從近到遠的3個非重疊區(qū)依次為AZFa、AZFb和AZFc[4]。各區(qū)域中囊括了若干AZF侯選基因。其中任何區(qū)域微小缺失都會誘發(fā)生精障礙，導致嚴重少精子癥、無精子癥，誘發(fā)男性不育[5-6]。AZF不同區(qū)域的缺失發(fā)生率和缺失的臨床表現不盡相同，以AZFc缺失最常見，患者常表現為少精子癥。AZF區(qū)域的缺失有自然遺傳或通過IVF、ICSI垂直傳遞給下一代男性的風險。所以對需進行輔助生育的男性進行AZF檢測非常有意義。本研究收集蘇北地區(qū)不育及正常生育男性，檢測并分析Y染色體微缺失分布及與不育關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2011年6月-2016年8月本院男科門診確診的不育癥男性920例(觀察組)，平均年齡31歲(20～46歲)；100例已育有至少1名子女的正常體檢男性為對照組。本研究經本院倫理委員會審批，患者均知情同意。

1.2 檢測方法

抽取兩組外周血抗凝，采用Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit取試劑盒(Cat#:51104) 提取 DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。對Y染色體AZF區(qū)內15個序列標簽位點(STS)檢測Y染色體微缺失基因(深圳亞能生物技術有限公司生產試劑盒)。STS位點包括AZFa(sY84、sY82、sY86)區(qū)，AZFb(sY143、sY124、sY133、sY128、sY134、sY127)區(qū)，AZFc(sY254、sY152、sY242、sY239、sY255)區(qū)，以及AZFb和AZFc交接區(qū)的sY145。以SRY為內參對照，分入4個多重PCR反應體系中進行擴增，分別為I、II、III、IV。各反應擴增體系中的STS位點及目的片段長度見表l。PCR反應體系：14 μl反應液+10 μl水+1μl DNA(20 ng/μl)，總反應體系為25μl。PCR反應條件：50℃孵育10 min，95℃預變性15 min，共35循環(huán)(94℃ 30 s、58℃ 60 s、72℃ 60 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳45 min(120V)， EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

表1 各反應體系中STS位點及電泳檢測中目的片段長度和位置

1.3 結果判讀

若樣本陰性對照、空白對照沒有出現擴增條帶，SRY中內參發(fā)現相應條帶，在多重PCR中未發(fā)現相應條帶，則該位點缺失；若檢測標本陽性對照、位點出現擴增條帶，且陰性對照與空白對照未發(fā)現擴增條帶，則為無缺失。

2 結果

2.1 臨床資料

觀察組920例中無精癥、少精癥、極少精癥、弱精癥和死精癥分別為134例(14.6%)、245例(26.6%)、254例(27.6%)、118例(12.8%)和169例(18.4%)，均為正常男性核型。對照組100例男性均為正常男性核型。

2.2 AZF區(qū)域微缺失

觀察組檢出AZF區(qū)域微缺失18例(1.96%)，其中AZFc區(qū)微缺失最高為12例(1.30%)，AZFb區(qū)微缺失4例(0.43%)，AZFa區(qū)微缺失和AZFb和c區(qū)均缺失各檢出1例(0.11%)。各類缺失中，AZFc區(qū)發(fā)生率最高為(13例)，其次AZFb區(qū)(5例)，AZFa區(qū)最低(1例)。共發(fā)現6種缺失類型：AZFa區(qū)缺失(1例)，AZFb區(qū)缺失(1例)，AZFb區(qū)sY143部分缺失(2例)，AZF b區(qū)sY143、sY134、sY133部分缺失(1例)，AZFb和c區(qū)均缺失(1例)，AZFc區(qū)缺失(12例)。各類缺失類型的電泳圖見圖1。各AZF缺失區(qū)域中，缺失區(qū)域變化最大的為AZFb區(qū)，該區(qū)域發(fā)生頻率最高的STS位點為sY143，缺失頻率見表2，對照組未發(fā)現AZF區(qū)域微缺失。

a：正常對照；b：AZFa區(qū)缺失；c：AZFc區(qū)缺失；d：AZFb和c區(qū)均缺失；e：AZFb區(qū)缺失；f：AZFb區(qū)sY143部分缺失；g：AZFb區(qū) sY143、sY134、sY133部分缺失

表2 AZF區(qū)域各區(qū)STS位點缺失情況

2.3 AZF區(qū)域微缺失臨床表現

AZF區(qū)域微缺失攜帶18例中，17例接受進一步臨床檢測，臨床及常規(guī)精液檢測均精液異常，各類型缺失者精液檢查的精子總數、精子濃度、精子活力、精子活率和形態(tài)正常率均為0，其中無精癥6例，弱精癥及少弱精癥9例，壞死精子癥2例；1例拒絕進一步檢查。

3 討論

Y染色體微缺失被認為是男性不育的重要遺傳因素,臨床AZF基因區(qū)域微缺失相關篩查主要在嚴重少精癥、原發(fā)性無精癥中輔助生育精子質量篩選與預后判斷。隨著原發(fā)性男性不育癥臨床診斷率的提升，臨床開展AZF基因微缺失檢測意義日益凸顯。然不同人群中男性Y染色體微缺失發(fā)生風險不一，可能有地域與種族差異。國外有報道指出各類男性不育人群AZF基因缺失率在1%～55%[7-9]，本研究為1.96%相對較低，可能與患者人群、種族差異有關。

Y染色體AZF基因區(qū)域涵蓋了很多與精子生成相關的重要基因，在男性生殖細胞不同發(fā)育周期起著不同作用，各位點微缺失將會誘發(fā)其功能喪失而導致男性精子發(fā)生障礙，臨床表現為無精子癥、少弱精子癥導致男性不育。臨床研究表明，AZFa區(qū)缺失會對Sertoli細胞、精原干細胞在精曲小管中的生成及分布造成重要影響，且與無精子癥的發(fā)生有著密切的關系[10]。AZFa缺失較為罕見，臨床上表現為唯支持細胞綜合征：精液無精子，睪丸組織病理診斷為生精上皮僅為支持細胞，生精細胞不足。AZFb區(qū)缺失可對精原干細胞在細胞減數分裂期發(fā)展造成影響，主要體現為生精阻滯，主要停留在精子細胞、精母細胞階段，臨床表現為多樣化[11]，發(fā)生缺失時多伴以其他區(qū)域同時缺失，在本研究中發(fā)現AZFb區(qū)缺失存在多種缺失方式，為各類AZF缺失中區(qū)域變化最大的，sY143為發(fā)生缺失頻率最高的STS位點。已有研究表明SY143的缺失會引起男性精子質量下降，由于目前發(fā)現病例數太少，累積數據量不夠，尚無明確診斷，故對AZF的微小部分缺失研究仍將繼續(xù)。AZFc區(qū)缺失會影響精原細胞向精子細胞轉化，造成精子生成不足。在本研究中，該區(qū)域缺失占比最高，是整個AZF缺失區(qū)域的熱點，另外AZFc區(qū)缺失人群的臨床表型最多樣化，可能與該區(qū)域內DAZ基因相關。DAZ基因是一個多拷貝基因家族，在生殖細胞分化的轉錄失活期具有后轉錄調控作用，其缺失導致的表現型呈多樣化，精子密度可正常，也可出現嚴重的少精或無精，復合缺失患者表現為少精子癥或無精子癥[12-14]。AZFb和AZFc交界區(qū)由于序列存在交疊，缺失表現兩區(qū)的缺失表型相似。

本研究結果表明，Y染色體微缺失是不育男性重要原因之一，Y染色體AZF區(qū)存在多種類型微缺失，主要以AZFc區(qū)缺失為主。檢測AZF微缺失從分子水平上明確精液質量病因，從而避免不必要治療，減少因應用ICSI而帶來男性子代臨床突變缺失率增加問題。同時本研究還提示，在不育男性的診斷或人工輔助生殖治療前，篩查Y染色體微缺失應作為常規(guī)檢查并給予足夠重視。