斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂地理種群遺傳差異及早期快速檢測

辛 蓓, Atif MANZOOR, 曹亮明, 王小藝

(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所, 國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100091)

斑衣蠟蟬Lycormadelicatula分布于中國、日本、越南、韓國和美國，可危害柿屬Diospyrosspp.、葡萄屬Vitisspp.、獼猴桃Actinidiachinensis、香椿Toonasinensis、臭椿Ailanthusaltissima等70余種寄主植物(Barringeretal., 2015)。斑衣蠟蟬不僅直接吸食寄主植物汁液，造成寄主植物衰弱，還是柿屬植物柿瘋病的傳播媒介(俎顯詩, 1992; 宗學(xué)普和黎彥, 2005)。此外，其排泄的蜜露還可以引起煤污病影響寄主植物光合作用(Barringeretal., 2015)。近年來該害蟲對我國葡萄、獼猴桃等產(chǎn)業(yè)造成較大損失(Wangetal., 2018)，還對園林綠化產(chǎn)生不良影響(EPPO, 2017)。斑衣蠟蟬原產(chǎn)于中國、日本、越南等東南亞國家，2004年入侵韓國，現(xiàn)已擴(kuò)散至韓國全境(Kimetal., 2011);2014年傳入美國，并迅速蔓延，目前已在美國4個州發(fā)現(xiàn)且對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅(Leeetal., 2019)。歐洲和地中海植物保護(hù)組織(EPPO)于2017年對斑衣蠟蟬進(jìn)行了風(fēng)險評估，認(rèn)為該害蟲對歐洲具有中等入侵風(fēng)險，一旦傳入將對歐洲的葡萄產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失(EPPO, 2017)。斑衣蠟蟬在世界范圍內(nèi)的擴(kuò)散蔓延不僅增加了我國貨物出口的貿(mào)易壁壘，同時也增加了檢疫成本。

目前斑衣蠟蟬以化學(xué)防治為主，不利于保護(hù)生物多樣性和自然環(huán)境(Leachetal., 2019)。利用天敵進(jìn)行生物防治是控制斑衣蠟蟬種群密度，阻止柿瘋病進(jìn)一步傳播的重要途徑之一(李令軍, 2014)。斑衣蠟蟬天敵已報道4種寄生蜂和2種病原微生物(周堯, 1946; 閆家河等, 2008; Yangetal., 2015; Liu and Mottern, 2017; Cliftonetal., 2019)。目前報道的若蟲期天敵為螯蜂屬Dryinus的布氏螯蜂D.browni，對斑衣蠟蟬具有捕食和寄生雙重控制作用，分布區(qū)為北京、山東商河、河南駐馬店(楊集昆, 1994; 閆家河等, 2008; Xuetal., 2013)，而野外調(diào)查時發(fā)現(xiàn)陜西延安、江蘇南京和山東泰安等地也有寄生斑衣蠟蟬若蟲的螯蜂屬天敵，但尚未確定其種名。目前我國對斑衣蠟蟬若蟲期螯蜂屬天敵的研究集中于生物學(xué)特性及人工繁殖方法等方面，評估其對斑衣蠟蟬若蟲寄生率的方法有直接觀察法和飼養(yǎng)觀察法，即通過觀察斑衣蠟蟬翅芽下方是否存在螯蜂卵或幼蟲囊包(圖1: A, B, C)，或者將野外采集到的斑衣蠟蟬在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工飼養(yǎng)至天敵羽化統(tǒng)計寄生率(董景芳, 1987; 閆家河等, 2008)。但在寄生早期肉眼很難觀察到斑衣蠟蟬體表的螯蜂卵，而將斑衣蠟蟬若蟲采集帶回室內(nèi)飼養(yǎng)，可能會因?yàn)椴糠职咭孪炏s死亡造成統(tǒng)計的寄生率偏低。

本研究分別從北京、山東泰安、河南駐馬店和江蘇南京采集到斑衣蠟蟬若蟲期寄生蜂，其中江蘇南京并未采集到成蟲樣本。為明確不同地理種群斑衣蠟蟬寄生蜂種類以及其地理種群間的遺傳差異，開發(fā)寄生蜂快速檢測方法，準(zhǔn)確測定其對斑衣蠟蟬的寄生率，本研究利用DNA條形碼技術(shù)分別對北京、山東泰安、河南駐馬店和江蘇南京的斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂種群COI和28S rDNA序列進(jìn)行比對，基于COI序列分析各地理種群斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂的遺傳差異，并根據(jù)COI序列設(shè)計種特異性引物用于寄生蜂的快速檢測，測定其對斑衣蠟蟬的寄生率，明確該若蟲寄生蜂對斑衣蠟蟬的控害作用，為進(jìn)一步人工利用該天敵防治斑衣蠟蟬提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 斑衣蠟蟬若蟲及其寄生蜂Fig. 1 Lycorma delicatula nymphs and parasitoidA: 斑衣蠟蟬健康若蟲Healthy nymph of L. delicatula; B: 被寄生早期的斑衣蠟蟬若蟲(無明顯囊包)Parasitized L. delicatula nymph at the early stage (without visible thalacium); C: 被寄生晚期的斑衣蠟蟬若蟲(囊包明顯)Parasitized L. delicatula nymph at the late stage (with visible thalacia).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

1.1.1螯蜂屬天敵形態(tài)鑒定樣本采集：斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂樣本分別采集于北京、山東泰安和河南駐馬店(表1)，于2019年5月下旬-6月上旬分別在試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置黃板誘捕寄生蜂成蟲，選取形態(tài)特征完整的雌、雄成蟲各3頭，浸泡于75%酒精中用于形態(tài)鑒定。

1.1.2中華螯蜂不同地理種群遺傳差異樣本采集：分別于北京、山東泰安、江蘇南京和河南駐馬店(表1)各地理種群中選取5頭囊包明顯的斑衣蠟蟬若蟲將囊包解剖后獲得中華螯蜂幼蟲，提取DNA用于中華螯蜂不同地理種遺傳分化和種特異性PCR(species-specific PCR, SS-PCR)引物檢測效果的測定，在北京試驗(yàn)點(diǎn)選取5頭寄生蜂成蟲提取DNA作為對照。

表1 斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂樣本信息Table 1 Sample information of parasitoids of Lycorma delicatula nymphs

1.1.3SS-PCR引物特異性檢測樣本：為測定SS-PCR引物對不同蟲態(tài)中華螯蜂、未被寄生的斑衣蠟蟬若蟲和不同地理種群中華螯蜂幼蟲的擴(kuò)增作用，分別采集中華螯蜂幼蟲、被中華螯蜂寄生的斑衣蠟蟬若蟲、中華螯蜂成蟲和未被寄生的斑衣蠟蟬若蟲。其中，從在北京試驗(yàn)點(diǎn)采集的具明顯中華螯蜂囊包的斑衣蠟蟬若蟲(圖1: C)，取其中10頭保存于無水酒精中作為被中華螯蜂寄生的斑衣蠟蟬若蟲樣本備用；另20頭置于50 mL離心管中，提供臭椿新鮮小枝供斑衣蠟蟬取食，放置于25℃、相對濕度65%±5%、光周期12L∶12D的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每日更換臭椿枝條至寄生蜂幼蟲脫囊做繭，隨后分別將繭剖開取出寄生蜂老熟幼蟲，作為中華螯蜂幼蟲樣本。中華螯蜂成蟲為黃板誘集后保存?zhèn)溆?。未被寄生的斑衣蠟蟬若蟲為北京地區(qū)采集到的斑衣蠟蟬卵塊放置于相同條件的培養(yǎng)箱中，待其孵化后收集斑衣蠟蟬若蟲，以確保斑衣蠟蟬若蟲未被寄生。上述樣品均保存于無水乙醇中用于提取DNA。

1.1.4不同地理種群斑衣蠟蟬若蟲寄生率檢測樣本：分別在北京、山東泰安、江蘇南京和河南駐馬店采集2-4齡斑衣蠟蟬若蟲，每個采樣點(diǎn)隨機(jī)選擇兩個不同的種群，每個種群50～100頭，浸泡于無水乙醇中用于提取DNA。

1.2 斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂的鑒定

將1.1.1節(jié)所述的誘集到的斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，利用二氯甲烷溶解其體表粘蟲膠后，整姿制成標(biāo)本，在蔡司Stemi 2000-C體視顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并利用佳能70D照相機(jī)拍照，隨后根據(jù)其寄主和形態(tài)特征進(jìn)行鑒定,同時寄送螯蜂分類專家鑒定核實(shí)。

1.3 DNA提取

利用QIAGEN DNeasy? Blood and Tissues Kit試劑盒分別提取1.1節(jié)所采集的待測樣本總DNA。隨后利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的DNA的質(zhì)量，并利用NanoDrop Spectrophotometer (DS-11 Envivx)測定DNA濃度，檢測合格后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 COI和28S rDNA序列PCR擴(kuò)增和測序

COI和28S rDNA基因PCR擴(kuò)增引物為通用引物。COI引物(Folmeretal., 1994)， LCO1490: 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′; HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。28S rDNA引物(Campbelletal., 1993; Goolsbyetal., 2006)， D2-3549: 5′-AGTCGTGTTGCTTGATAGTGCA G-3′; D2-4068: 5′-TTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3′。PCR反應(yīng)體系(25 μL): GoTaq? Green Master Mix (Promega)預(yù)混液12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 1.3節(jié)提取的不同地理種群斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂DNA模板(25～150 ng/μL) 1 μL, 9.5 μL ddH2O。COI和28S rDNA序列的PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性10 s, 54℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 重復(fù)35個循環(huán)；72℃最終延伸5 min。所有PCR 反應(yīng)均使用Biometra TOne 96G(Analytikjena， 德國)進(jìn)行。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，選取目標(biāo)條帶清晰的樣品送樣至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司利用ABI 3730測序儀(Applied Biosystens, 美國)進(jìn)行雙向測序。

1.5 SS-PCR中華螯蜂快速鑒定

基于1.4節(jié)測序結(jié)果，利用Primer 3(http:∥bioinfo.ut.ee/primer3/)(Koressaaretal., 2018)和NCBI Primer Blast工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINKLOC=MultiSensor) (Yeetal., 2012)對COI序列設(shè)計SS-PCR特異性引物(表2)。隨后以1.3節(jié)提取的中華螯蜂幼蟲、被中華螯蜂寄生的斑衣蠟蟬若蟲、中華螯蜂成蟲和未被中華螯蜂寄生的斑衣蠟蟬若蟲DNA為模板，PCR反應(yīng)體系及條件同1.4節(jié)，每對引物重復(fù)5次。利用瓊脂糖凝膠電泳對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以確定引物的特異性，并隨機(jī)選擇10份PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以確定PCR產(chǎn)物為目標(biāo)COI序列部分片段。

選擇擴(kuò)增出明顯特異性條帶的引物用于SS-PCR引物種特異性的檢驗(yàn)，并根據(jù)引物退火溫度設(shè)置PCR反應(yīng)體系和條件(同1.4節(jié))。隨后將1.3節(jié)提取的中華螯蜂幼蟲DNA分別溶解于無核酸酶水和寄主斑衣蠟蟬若蟲DNA(50 ng/μL)中，中華螯蜂幼蟲DNA濃度梯度為50, 5, 0.5, 0.05, 0.005, 0.0005, 0.00005和0.000005 ng/μL，每個濃度重復(fù)5次，測定SS-PCR引物對中華螯蜂DNA的最低檢測閾值。

1.6 寄生蜂對斑衣蠟蟬若蟲寄生率的測定

肉眼觀察各個采樣點(diǎn)的斑衣蠟蟬若蟲翅芽下是否存在寄生蜂卵或幼蟲囊包(閆家河等, 2008)(圖1: C)，分別記錄目測法統(tǒng)計的被寄生斑衣蠟蟬若蟲總數(shù)和總樣本數(shù)，計算目測法斑衣蠟蟬若蟲的寄生率。隨后以1.3節(jié)提取的所有肉眼觀察過的斑衣蠟蟬若蟲單頭DNA為模板，利用SS-PCR引物進(jìn)行PCR(反應(yīng)體系和條件同1.4節(jié))，根據(jù)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果確定斑衣蠟蟬若蟲是否被寄生，計算寄生率。寄生率=被寄生斑衣蠟蟬若蟲總數(shù)/總樣本數(shù)×100%。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用BioEdit (v7.2.5) 對1.4節(jié)雙向測序結(jié)果進(jìn)行拼接、校對，排除假基因的可能后將序列提交至NCBI，獲得GenBank登錄號。隨后利用DNAMAN 8(Lynnon Biosoft, Quebec, 加拿大)軟件檢驗(yàn)所得序列能否正確翻譯蛋白質(zhì)以確保序列的正確性，在NCBI database(www.ncbi.nlm.nih.gov)中利用BLAST搜索確定其為螯蜂序列， 以排除其他物種干擾。使用MEGA 10.0.6(Kumaretal., 2018)對序列進(jìn)行多重比對。COI和28S rDNA序列分別利用DnaSP 5.1(Rozasetal., 2010)計算各序列多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量(S)、單倍型數(shù)量(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)和遺傳分化(Fst)，并進(jìn)行Tajima’sD檢驗(yàn)。在MEGA 10.0.6 中利用Clustal W序列校對后，分析各序列的堿基組成。隨后采用Network 4.1軟件繪制COI序列單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(Bandeltetal., 1999)，基于COI序列利用K2P模型(Kimura-2-parameter distance)(Kimura, 1980)分析各寄生蜂種群間的遺傳距離。以柯氏螯蜂Dryinuskoebelei(GenBank登錄號: JN306860)作為外群(NCBI database; Stahlhutetal., 2013)，利用鄰接(neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 基于中華螯蜂COI序列的SS-PCR引物信息Table 2 SS-PCR primer information based on the COI sequence of Dryinus sinicus

利用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同地理種群中華螯蜂的寄生率和不同檢測方法統(tǒng)計的寄生率間的差異顯著性利用χ2檢驗(yàn)(α=0.05)。

2 結(jié)果

2.1 斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂鑒定

斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂標(biāo)本寄給世界螯蜂科權(quán)威分類專家意大利圖西亞大學(xué)(Tuscia University)Massimo Olmi教授鑒定為中華螯蜂Dryinussinicus，Olmi教授為該蜂的命名人。形態(tài)描述及圖片可參考楊集昆(1994)、何俊華和許再福(2002)和Xu等(2013)文獻(xiàn)(圖2: A)，雌蜂前足螯的大爪上均具亞端齒(圖2: B)，且其觸角第3節(jié)極長，約等于第4和5節(jié)觸角之和(圖2: C)，與文獻(xiàn)中中華螯蜂的形態(tài)特征描述一致，因此本研究所采集的斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂為中華螯蜂。

2.2 中華螯蜂種群遺傳多樣性

PCR擴(kuò)增得到中華螯蜂種群643 bp的COI序列和614 bp的28S rDNA序列。其中，COI序列中A, T, C, G堿基占比分別為31.77%, 44.17%, 10.43%和31.77%，A+T含量為75.94%，含有保守位點(diǎn)624個，變異位點(diǎn)19個，簡約信息位點(diǎn)7個，自裔位點(diǎn)12個。28S rDNA序列中A, T, C, G堿基占比分別為20.82%, 22.22%, 26.50%和30.47%，A+T含量為43.04%。其中含有保守位點(diǎn)586個，變異位點(diǎn)28個，簡約信息位點(diǎn)16個，自裔位點(diǎn)12個。

COI序列中共檢測到16種單倍型，其中泰安種群(TA)中3個樣本共享單倍型為H15，其余單倍型均為樣本獨(dú)有的單倍型(圖3)。而28S rDNA序列中則檢測到4個單倍型，北京(BJ)、駐馬店(ZMD)和泰安(TA)種群中均為Hap1，南京種群(NJ)則包含4個不同的單倍型(表3)。COI序列核苷酸多樣性(Pi)最高為南京種群(NJ)(0.0099±0.0027)，泰安種群(TA)最低(0.0018±0.0000)；28SrDNA序列核苷酸多樣性最高為南京種群(NJ)(0.0245±0.0078)。北京種群(BJ)和南京種群(NJ)的COI序列的單倍型多樣性(Hd)高于其他兩個種群的，但除南京種群(NJ)外，其他3個種群28S rDNA序列的單倍型多樣性均為0。分子多樣性指數(shù)表明南京種群(NJ)遺傳多樣性最高。

圖2 中華螯蜂主要形態(tài)特征Fig. 2 Main morphological characteristics of Dryinus sinicusA: 中華螯蜂雌成蟲Dryinus sinicus female adult; B: 雌成蟲前足 Propodium of female adult; C: 雌成蟲觸角Antenna of female adult.

圖3 基于COI序列的中華螯蜂單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 Median-joining haplotype network of Dryinus sinicus based on COI sequenceH1-H16: 單倍型Haplotypes; mv1-mv3: 可能突變的位點(diǎn)Possible mutation sites.

表3 不同地理種群中華螯蜂單倍型多樣性Table 3 Haplotype diversity of different geographical populations of Dryinus sinicus

2.3 基于COⅠ的中華螯蜂遺傳距離及遺傳分化

利用K2P模型計算中華螯蜂不同地理種群間遺傳距離在0.00691～0.01310之間(表4)。駐馬店種群(ZMD)和泰安種群(TA)間遺傳距離最近(0.00691)，泰安種群(TA)與南京種群(NJ)間遺傳距離最遠(yuǎn)(0.01310)。在不同地理種群遺傳分化方面，種群間固定系數(shù)(Fst)在0.11111～0.60983之間，其中北京種群(BJ)和泰安種群(TA)Fst最高,為0.60983，表明北京種群和泰安種群間分化程度較高，而南京種群和駐馬店種群間Fst系數(shù)最低。

2.4 基于COI序列的不同地理種群中華螯蜂的系統(tǒng)發(fā)育分析

NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表明，本研究所采集的斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂樣本的COI序列均聚于一枝，而與外群柯氏螯蜂COI序列分離(圖4)，表明所選擇的外群COI序列所屬物種與斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂親緣關(guān)系遠(yuǎn)，而不同地理種群間斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂親緣關(guān)系較近，因此本研究所檢測斑衣蠟蟬若蟲寄生蜂均為同一物種。

表4 基于COI序列的中華螯蜂不同地理種群間遺傳距離(下三角)和固定系數(shù)Fst(上三角)Table 4 Pairwise genetic distance (below the diagonal) and Fst (above the diagonal) among different geographical populations of Dryinus sinicus based on COI sequence

圖4 基于COI序列用K2P模型構(gòu)建的中華螯蜂不同地理種群樣本鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Neighbor-joining tree of specimens from different geographical populations of Dryinus sinicus using Kimura-2-parameter based on COI sequences括號內(nèi)代碼為GenBank登錄號; 以柯氏螯蜂COI基因序列為外群。The codes in brackets are GenBank accession no. COI gene sequence of Dryinus koebulei was used as the outgroup.

2.5 應(yīng)用SS-PCR引物對中華螯蜂的快速檢測

根據(jù)COI序列設(shè)計10對SS-PCR引物(表2)，并以1.3節(jié)提取的中華螯蜂幼蟲和成蟲、未被寄生的斑衣蠟蟬若蟲和被寄生的斑衣蠟蟬若蟲DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，引物DS-54/DS-279(表2)對中華螯蜂幼蟲和成蟲及被寄生的斑衣蠟蟬若蟲均具有擴(kuò)增能力，但不能擴(kuò)增未被中華螯蜂寄生的斑衣蠟蟬若蟲DNA，且可以成功擴(kuò)增出各個地理種群中華螯蜂DNA，表明該引物為中華螯蜂的特異性引物(圖5)。SS-PCR最低檢測閾值測定表明，DS-54/DS-279可以擴(kuò)增出稀釋至0.000005 ng/μL的中華螯蜂DNA(圖6)。

圖5 SS-PCR引物DS-54/DS-279對不同蟲態(tài)中華螯蜂和斑衣蠟蟬若蟲DNA的擴(kuò)增能力Fig. 5 Amplification pattern of DNA from Dryinus sinicus at different developmental stages and Lycorma delicatula nymphs by SS-PCR primer DS-54/DS-279M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker; 1: 中華螯蜂幼蟲D. sinicus larva; 2: 被中華螯蜂寄生的斑衣蠟蟬若蟲L. delicatula nymph parasitized by D. sinicus; 3: 中華螯蜂成蟲D. sinicus adult; 4: 未被寄生的斑衣蠟蟬若蟲Un-parasitized L. delicatula nymph; 5-8: 分別為北京(BJ)、南京(NJ)、駐馬店(ZMD)、泰安(TA)中華螯蜂種群幼蟲D. sinicus larvae of Beijing (BJ), Nanjing (NJ), Zhumadian (ZMD), and Tai′an (TA) populations, respectively.

圖6 SS-PCR引物DS-54/DS-279對中華螯蜂DNA的最低檢測閾值Fig. 6 The detection threshold for Dryinus sinicus DNA using SS-PCR primer DS-54/DS-279M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker; 1-7: 以濃度分別為50, 5, 0.5, 0.05, 0.005, 0.0005, 0.00005和0.000005 ng/μL的中華螯蜂DNA為模板的PCR產(chǎn)物PCR products using D. sinicus DNA at the concentrations of 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005, 0.0005, 0.00005 and 0.000005 ng/μL, respectively, as the template; 8-14: 斑衣蠟蟬DNA (50 ng/μL)分別與50, 5, 0.5, 0.05, 0.005, 0.0005, 0.00005和0.000005 ng/μL中華螯蜂DNA的混合物為模板的PCR產(chǎn)物PCR products using DNA mixtures of 50 ng/μL L. delicatula DNA mixed with D. sinicus DNA at the concentrations of 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005, 0.0005, 0.00005 and 0.000005 ng/μL, respectively, as the template.

2.6 中華螯蜂對不同采樣點(diǎn)斑衣蠟蟬若蟲的寄生率

利用SS-PCR檢測中華螯蜂對斑衣蠟蟬若蟲的寄生率，結(jié)果表明該寄生蜂對斑衣蠟蟬若蟲寄生率較高(圖7)，其中駐馬店種群的寄生率高達(dá)60.00%，南京種群的寄生率僅為22.54%,顯著低于其他采樣點(diǎn)種群的寄生率(χ2=14.718,df=3,P=0.002)。而利用目測法觀察統(tǒng)計的寄生率范圍為5.63%～36.98%，南京種群的寄生率同樣顯著低于其他采樣點(diǎn)種群的寄生率(χ2=23.448,df=3,P<0.001)。使用SS-PCR檢測得到的中華螯蜂對各采樣點(diǎn)斑衣蠟蟬若蟲的寄生率均顯著高于使用目測法觀察得到的結(jié)果，兩種方法檢測中華螯蜂對北京斑衣蠟蟬若蟲的寄生率差異最顯著，可達(dá)40.43%(χ2=17.121,df=1,P<0.001)。

3 結(jié)論與討論

圖7中華螯蜂對不同采樣點(diǎn)斑衣蠟蟬若蟲的寄生率Fig. 7 Parasitism rate of Dryinus sinicus on Lycorma delicatula nymphs sampled from different sampling localities圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同大寫字母表示同一檢測方法所得寄生率在不同采樣點(diǎn)間差異顯著(χ2檢驗(yàn), α=0.05)，不同小寫字母表示相同采樣點(diǎn)的寄生率在不同檢測方法間差異顯著(χ2檢驗(yàn), α=0.05)。Data in the figure are mean±SE. Different capital letters above bars indicate significant differences in parasitism rates among different sampling localities using the same detection method (χ2 test, α=0.05), while different small letters indicate significant differences in parasitism rates in the same sampling locality analyzed by different detection methods (χ2 test, α=0.05).

本研究利用DNA條形碼技術(shù)明確了所采集的斑衣蠟蟬若蟲期天敵種群間沒有顯著的遺傳差異，為同一種中華螯蜂。并在此基礎(chǔ)上根據(jù)COI序列設(shè)計了中華螯蜂SS-PCR引物，該引物可以成功擴(kuò)增所有蟲態(tài)中華螯蜂的種特異性片段，最低檢測閾值可達(dá)0.000005 ng/μL DNA。利用不同方法對不同地理種群斑衣蠟蟬若蟲的中華螯蜂寄生率進(jìn)行了檢測，SS-PCR檢測寄生率的準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于目測法。

本研究基于COI序列的遺傳差異分析結(jié)果顯示中華螯蜂不同地理種群間遺傳多樣性較低，但在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時由于數(shù)據(jù)庫中螯蜂屬序列上傳較少，因此以螯蜂科其他昆蟲COI序列作為外群進(jìn)行分析，中華螯蜂所有地理種群COI序列均聚為一枝，而與外群柯氏螯蜂COI序列分離，這表明中華螯蜂與所選外群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。中華螯蜂種群間遺傳距離在0.00691～0.01310之間，Hebert等(2003)對動物線粒體COI序列進(jìn)行分析認(rèn)為98%物種種內(nèi)遺傳距離差異為0～2.00%,沒有出現(xiàn)種下分化，為同一種。寄生斑衣蠟蟬若蟲期螯蜂屬天敵還有史氏螯蜂Dryinusstantoni(Xuetal., 2013)，而本研究所采集的螯蜂屬天敵經(jīng)形態(tài)鑒定為中華螯蜂，且不同地理種群的樣本之間均沒有顯著的遺傳差異，因此目前采集到的北京、泰安、南京和駐馬店種群均為中華螯蜂。這兩種斑衣蠟蟬螯蜂屬天敵是否為同物異名有待進(jìn)一步研究。

目前常用的天敵控害作用評價方法除傳統(tǒng)的生態(tài)學(xué)方法外(劉樹生, 2004)，酶聯(lián)免疫(ELISA)、同位素標(biāo)記技術(shù)和SS-PCR等分子生物學(xué)方法在天敵控害作用的評價中應(yīng)用日益廣泛(Zhangetal., 2007)。本研究分別利用直接觀察法和SS-PCR技術(shù)對中華螯蜂對斑衣蠟蟬若蟲的寄生率進(jìn)行了檢測，SS-PCR檢測到的寄生率顯著高于采用目測法直接觀察的結(jié)果。這可能是由于在中華螯蜂寄生早期，其卵和囊包較小，不易發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致直接觀察到的寄生率偏低。若將斑衣蠟蟬帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室種群飼養(yǎng)觀察，同樣可能由于斑衣蠟蟬若蟲期死亡導(dǎo)致統(tǒng)計的寄生率偏低。雖然研究認(rèn)為有些寄生蜂在寄生后可能因寄主免疫導(dǎo)致其后代在寄主體內(nèi)死亡，特別是內(nèi)寄生性天敵，SS-PCR可以用于檢測寄生蜂寄生寄主的百分比。將SS-PCR與室內(nèi)人工飼養(yǎng)和傳統(tǒng)解剖相結(jié)合則能夠得到更準(zhǔn)確的寄生率(Gariepyetal., 2007)。目前SS-PCR廣泛應(yīng)用于繭蜂科(Braconidae)、姬蜂科(Ichneumonidae)、金小蜂科(Pteromalidae)等天敵的檢測(Haleetal., 2004; Douhovnikoffetal., 2006; Traugottetal., 2006)。而中華螯蜂作為斑衣蠟蟬若蟲的外寄生性天敵，其所受到的寄主免疫較內(nèi)寄生性天敵低，研究開發(fā)中華螯蜂不同發(fā)育階段的快速檢測鑒定技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確檢測出中華螯蜂寄生率，并結(jié)合室內(nèi)飼養(yǎng)明確中華螯蜂對斑衣蠟蟬的寄生成功率，可評估其對斑衣蠟蟬的控制作用，為利用中華螯蜂防治斑衣蠟蟬奠定基礎(chǔ)。

中華螯蜂在不同采樣點(diǎn)的寄生率存在顯著差異，駐馬店和北京種群的寄生率明顯高于南京種群，這可能是由于北京、駐馬店和泰安采集的樣本均為近自然環(huán)境，使用化學(xué)農(nóng)藥較少，而南京地區(qū)的采集于行道樹，為防治斑衣蠟蟬等園林害蟲通常會使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，導(dǎo)致天敵種群密度降低。此外采用兩種方法檢測的中華螯蜂對北京斑衣蠟蟬若蟲的寄生率差異最大，這可能是由于不同采樣點(diǎn)斑衣蠟蟬若蟲種群生活史存在一定差異，北京地區(qū)的中華螯蜂羽化較晚，使用目測法統(tǒng)計的中華螯蜂寄生率遠(yuǎn)低于實(shí)際寄生率。因此，本研究開發(fā)的快速檢測技術(shù)可以應(yīng)用于中華螯蜂寄生早期準(zhǔn)確、快速檢測。

此外，在往年調(diào)查過程中還在陜西延安、甘肅蘭州及山東煙臺和商河發(fā)現(xiàn)螯蜂繭或者被螯蜂寄生的斑衣蠟蟬若蟲，這表明中華螯蜂在我國分布范圍較廣，基本可以覆蓋斑衣蠟蟬的分布區(qū)。雖然目前斑衣蠟蟬在我國并不屬于主要害蟲，但其不僅直接影響寄主植物樹勢，還可以作為媒介昆蟲傳播柿瘋病影響柿樹的產(chǎn)量，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致柿樹死亡(俎顯詩, 1992)。柿瘋病在我國廣泛分布，其中一些地區(qū)發(fā)病株率達(dá)70%以上，河北、山西、河南等區(qū)域斑衣蠟蟬危害也十分嚴(yán)重(王祈楷等, 1989; 俎顯詩, 1992; 宗學(xué)普和黎彥, 2005)。斑衣蠟蟬作為柿瘋病的媒介昆蟲之一，降低斑衣蠟蟬種群密度可以有效控制柿瘋病的傳播，避免柿瘋病的進(jìn)一步傳播擴(kuò)散(李令軍, 2014)。斑衣蠟蟬排泄的蜜露還會引發(fā)煤污病，影響其寄主植物及周圍其他植物光合作用(Barringeretal., 2015; EPPO, 2017)。自其入侵至韓國和美國等國家后嚴(yán)重危害葡萄，影響葡萄產(chǎn)業(yè)(Kimetal., 2011; Leeetal., 2019)。由于斑衣蠟蟬通常危害經(jīng)濟(jì)樹種和園林綠化樹種，而目前對斑衣蠟蟬通常采取施用大量化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，影響生態(tài)環(huán)境和人類健康(EPPO, 2017; Leeetal., 2019)。因此，研發(fā)中華螯蜂人工繁殖和釋放利用技術(shù)是斑衣蠟蟬綠色防控的重要手段之一。

致謝本研究螯蜂樣本由意大利圖西亞大學(xué)(Tuscia University)Massimo Olmi教授鑒定，山東省商河縣森林保護(hù)站閆家河高級工程師對螯蜂飼養(yǎng)技術(shù)給予了指導(dǎo)和幫助，謹(jǐn)致謝忱。