番茄褪綠病毒TaqMan熒光定量PCR快速檢測方法的建立與應(yīng)用

王吉成, 李 潔, 丁天波, 褚 棟

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室, 山東青島 266109)

番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)是一種植物RNA病毒，屬長線病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬Crinivirus。1998年首次在美國佛羅里達州的番茄上發(fā)現(xiàn)了ToCV (Wisleretal., 1998)。ToCV寄主廣泛，可侵染15屬30多種植物，侵染植株后造成葉片脈間褪綠黃化，到后期整株黃化枯萎甚至死亡(Wintermantel and Wisler, 2006)。目前，ToCV在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)對作物均造成危害，已成為一種世界性作物病毒(Barbosaetal., 2008; Dart and Weeda, 2011; Fiallo-olivéetal., 2011)。在我國，2004年ToCV首次在臺灣被報道(Tsaietal., 2004)，2012年后相繼在北京、江蘇、山東等地發(fā)現(xiàn)，對當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失(魏可可等, 2018)。

ToCV無法通過種子、汁液等方法進行傳播，僅依靠介體煙粉虱Bemisiatabaci、溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum、紋翅粉虱Trialeurodesabutilonea等粉虱進行傳播(Navas-Castilloetal., 2000)。在我國，煙粉虱MED隱種是ToCV傳播的主要媒介昆蟲(劉永光等, 2014)，與該病毒病的傳播與暴發(fā)密切相關(guān)(代惠潔等, 2016)。傳統(tǒng)的檢測方式是采集田間已有癥狀植株進行檢測，而ToCV初侵染植株4周內(nèi)并無明顯癥狀，檢測到病毒時往往已延誤防治(Fontetal., 2004)。煙粉虱作為ToCV天然的“儲存器”與“注射器”(李潔等, 2015)，通過煙粉虱進行攜毒檢測可及時發(fā)現(xiàn)田間的ToCV，這對該病毒的及時防控具有重要意義。

現(xiàn)有的病毒檢測技術(shù)中，常用的方法有血清學(xué)檢測法、RT-PCR法與逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法等，但這些方法也存在一些不足。例如，在微量模板上用血清學(xué)檢測法常出現(xiàn)漏檢或誤檢的情況(陶源和吳興泉, 2017)；常規(guī)PCR檢測方法與逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)法檢測靈敏度較高(Karwithaetal., 2014)，但也極易造成樣品的交叉污染(Kiletal., 2015)。近年來，由于TaqMan探針實時熒光定量PCR方法(TaqMan RT-qPCR)特異性強、靈敏度高等特點(姚晶等, 2013)，該方法在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)科學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前，還沒有利用TaqMan RT-qPCR方法檢測單頭煙粉虱體內(nèi)ToCV的報道。

本研究根據(jù)ToCV基因外殼蛋白保守區(qū)域設(shè)計特異引物與探針，建立了能快速檢測ToCV的TaqMan RT-qPCR方法，并應(yīng)用該方法對溫室接種以及田間溫室大棚內(nèi)單頭煙粉虱體內(nèi)ToCV攜毒情況進行了檢測，以期為田間ToCV的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試毒源與供試蟲源

供試毒源包括ToCV侵染植株、番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)侵染植株與和番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)侵染植株。ToCV侵染番茄植株與TYLCV侵染番茄植株于2014年在山東省青島市城陽區(qū)上馬鎮(zhèn)采集，利用介體煙粉虱對健康番茄植株進行接種，鑒定后在本實驗室溫室內(nèi)長期培養(yǎng)。TSWV侵染番茄植株樣品于2015年在云南采集，鑒定為TSWV之后于-80℃保存。供試蟲源包括實驗室溫室內(nèi)ToCV侵染番茄植株上長期飼養(yǎng)的煙粉虱種群和青島市城陽區(qū)上馬鎮(zhèn)番茄溫室大棚內(nèi)疑似攜毒煙粉虱種群。供試植株培養(yǎng)和煙粉虱飼養(yǎng)條件：溫度27±1℃，相對濕度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 TaqMan探針與特異引物設(shè)計

根據(jù)GenBank公布的ToCV序列(GenBank登錄號: KC709510.1)，選取ToCV外殼蛋白基因高度保守區(qū)域，使用軟件Primer Express3.0設(shè)計1對特異引物和1條TaqMan探針，通過BLAST對比分析確定其特異性后交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.3 ToCV標準質(zhì)粒的構(gòu)建

采用TRIzol提取法(TRIzol試劑購于Thermo Fisher Scientific公司)提取1.1節(jié)中ToCV侵染植株葉片總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script TaqMan RT Reagent Kit with gDNA Eraser, TaKaRa公司)進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；以cDNA為模板，使用ToCV-F和ToCV-R引物(表1)進行常規(guī)PCR擴增，PCR反應(yīng)體系: cDNA模板2.0 μL, rTaq 0.2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, 10×Buffer 2.0 μL, 上下游引物ToCV-F/ToCV-R(10 mmol/L)各0.3 μL, ddH2O 補足20 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性4 min; 94℃變性40 s, 55℃退火40 s, 72℃延伸50 s, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min。

表1 本研究中所用引物信息Table 1 Information of primers used in this study

將上述PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇切下約680 bp處的目的條帶，使用凝膠回收試劑盒(TaKaRa Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit, TaKaRa公司)進行目的條帶的回收純化，純化后產(chǎn)物連接到pMDTM18-T Vector(TaKaRa公司)，并轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細胞JM109(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，篩選并提取陽性克隆的質(zhì)粒，送至上海生工生物有限公司進行測序。將測序正確的質(zhì)粒使用核酸蛋白濃度測定儀測定濃度，置于-20℃保存?zhèn)溆?。運用如下公式(Shirimaetal., 2017)計算該質(zhì)粒含有的ToCV片段拷貝數(shù)：質(zhì)?？截悢?shù)/μL=(阿氏常數(shù)×C×109)/(重組質(zhì)粒堿基數(shù)×660 dalton/bp)。其中，C為質(zhì)粒濃度；阿氏常數(shù)為6.02×1023。最終計算得到重組ToCV質(zhì)粒濃度為8.3×1010copies/μL。

1.4 標準曲線的建立

以1.3節(jié)獲得的ToCV陽性質(zhì)粒為初始模板，按10倍梯度稀釋出9個質(zhì)粒標準品，濃度依次為8.3×109, 8.3×108, 8.3×107, 8.3×106, 8.3×105, 8.3×104, 8.3×103, 8.3×102和8.3×10 copies/μL。以上述9個梯度質(zhì)粒標準品為模板，在實時熒光定量PCR儀(qTOWER 2.2 Real-time PCR Thermal Cycler, Analytik Jena, 德國耶拿公司)上進行TaqMan RT-qPCR擴增，得到動力學(xué)擴增曲線，然后以PCR擴增循環(huán)閾值(Ct值)為縱坐標、以質(zhì)?？截悢?shù)的10為底的對數(shù)值為橫坐標做出標準曲線，獲得回歸直線方程。TaqMan RT-qPCR反應(yīng)體系: 模板2.0 μL, 2×Premix ExTaq (Probe qPCR) 10.0 μL, 上下游定量引物ToCV-F6680/ToCV-R6799(10 mmol/L)各0.4 μL, ToCV-probe6724(10 mmol/L) 0.8 μL, ddH2O 補足20 μL。 TaqMan RT-qPCR反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 57℃ 30 s, 40個循環(huán)。

1.5 常規(guī)PCR的靈敏度檢測

以1.4節(jié)中9個濃度梯度ToCV質(zhì)粒標準品為模板，使用ToCV-F6680和ToCV-R6799引物進行常規(guī)PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物后經(jīng)電泳檢測，通過與標準曲線定量結(jié)果的比較，分析TaqMan RT-qPCR與常規(guī)PCR的靈敏度，同時使用ToCV陽性模板與ddH2O分別作為陽性和陰性對照。PCR反應(yīng)體系: 模板 2.0 μL, rTaq 0.2 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL; 10×Buffer 2.0 μL, ToCV-F6680(10 mmol/L)0.4 μL, ToCV-R6799(10 mmol/L) 0.4 μL, ddH2O 補足20 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性4 min; 94℃變性40 s, 55℃退火40 s, 72℃延伸30 s, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min。

1.6 引物的特異性檢測

選取ToCV cDNA及TYLCV和TSWV的DNA和cDNA為模板，用ToCV的TaqMan RT-qPCR特異引物(ToCV-F6680/ToCV-R6799)進行常規(guī)PCR擴增(方法同1.5節(jié))與TaqMan RT-qPCR擴增(方法同1.4節(jié))，均設(shè)置ddH2O陰性對照，常規(guī)PCR產(chǎn)物進行電泳分析鑒定，TaqMan RT-qPCR結(jié)果根據(jù)其擴增曲線分析鑒定，基于二者結(jié)果共同分析引物特異性。其中，TYLCV病毒模板使用天根植物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取獲得，TSWV病毒模板與ToCV病毒提取方法相同，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法同1.3節(jié)),模板使用前已經(jīng)經(jīng)過常規(guī)PCR擴增并測序，之后在NCBI上BLAST對比鑒定，TYLCV病毒 GenBank登錄號為GU199587.1，TSWV病毒GenBank登錄號為ANQ91902.1。

1.7 單頭煙粉虱體內(nèi)ToCV檢測

從1.1節(jié)中溫室內(nèi)ToCV侵染植株上煙粉虱種群和田間煙粉虱種群中，分別隨機選取50頭煙粉虱成蟲，單頭置于1.5 mL無RNase離心管中，在液氮中使用研磨棒將煙粉虱研磨成粉，按照1/5體積TRIzol法提取其RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法同1.3節(jié))，用于TaqMan RT-qPCR擴增得到相應(yīng)Ct值，根據(jù)1.4節(jié)建立的標準曲線計算單頭煙粉虱體內(nèi)的ToCV的病毒拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ToCV質(zhì)粒模板的克隆

如圖1所示，以ToCV cDNA為模板，以ToCV-F和ToCV-R為引物進行常規(guī)PCR擴增，得到680 bp左右擴增片段，經(jīng)上海生工測序，NCBI核酸數(shù)據(jù)庫比對，與已報道的ToCV序列(GenBank登錄號: KC709510.1)一致性100%。

2.2 標準曲線建立

以8.3×101～9copies/μL濃度梯度的標準質(zhì)粒ToCV-pMD18-T為模板進行PCR擴增，得到不同濃度標準質(zhì)粒擴增曲線(圖2)，Ct值與拷貝對數(shù)所構(gòu)建的標準曲線(圖3)。結(jié)果表明，標準質(zhì)粒濃度與Ct值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9957，回歸曲線斜率為-3.1232，截距為40.265，擴增效率為98%。標準曲線的線性回歸方程為y=-3.1232x+40.265，其中y為Ct值，x為以10為底的標準質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)。

圖1 ToCV常規(guī)PCR擴增Fig. 1 Conventional PCR of ToCVM: DNA分子量標準 DNA Marker (DL2000); 1: ToCV模板ToCV template.

圖2 TaqMan RT-qPCR標準質(zhì)粒ToCV-pMD18-T擴增曲線Fig. 2 Amplification curve of standard plasmid ToCV-pMD18-T by TaqMan RT-qPCRA-I: 分別為8.3×109, 8.3×108, 8.3×107, 8.3×106, 8.3×105, 8.3×104, 8.3×103, 8.3×102和8.3×10 copies/μL的ToCV-pMD18-T質(zhì)粒標準品8.3×109, 8.3×108, 8.3×107, 8.3×106, 8.3×105, 8.3×104, 8.3×103, 8.3×102 and 8.3×10 copies/μL standard plasmid ToCV-pMD18-T, respectively.

圖3 ToCV的TaqMan RT-qPCR標準曲線Fig. 3 Standard curve of TaqMan RT-qPCR for ToCVEff.: 擴增效率Amplification efficiency. 圖中各點從左到右分別表示為8.3×101～9 copies/μL的ToCV-pMD18-T質(zhì)粒標準品Each point from left to right in the figure is 8.3×101-9 copies/μL standard plasmid ToCV-pMD18-T, respectively.

2.3 常規(guī)PCR與TaqMan RT-qPCR的靈敏度比較

TaqMan RT-qPCR與常規(guī)PCR的靈敏度檢測結(jié)果比對表明，基于TaqMan RT-qPCR的ToCV檢測方法最低可檢出8.3×10 copies/μL 的病毒質(zhì)粒樣品(圖2)，而常規(guī)PCR最低僅能檢測到8.3×104copies/μL的病毒質(zhì)粒樣品(圖4)，TaqMan RT-qPCR檢測ToCV的靈敏度是常規(guī)RT-PCR的1 000倍。

圖4 常規(guī)PCR檢測ToCV的靈敏度Fig. 4 Sensitivity of conventional PCR in detection of ToCVM: DNA分子量標準 DNA Marker (DL2000); 1-9: 分別為8.3×109, 8.3×108, 8.3×107, 8.3×106, 8.3×105, 8.3×104, 8.3×103, 8.3×102和8.3×10 copies/μL ToCV質(zhì)粒標準品8.3×109, 8.3×108, 8.3×107, 8.3×106, 8.3×105, 8.3×104, 8.3×103, 8.3×102 and 8.3×10 copies/μL standard plasmid ToCV-pMD18-T, respectively; 10: ToCV, 陽性對照ToCV as the positive control; 11: ddH2O, 陰性對照ddH2O as the negative control.

2.4 常規(guī)PCR與TaqMan RT-qPCR特異性比較

常規(guī)PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅ToCV模板出現(xiàn)119 bp的擴增條帶，其他2種供試病毒TYLCV和TSWV的模板均未出現(xiàn)擴增條帶(圖5)，表明所設(shè)計引物的特異性好。同時利用TaqMan RT-qPCR檢測ToCV, TYLCV和TSWV，只有ToCV檢測出較強的熒光信號，Ct值為22.17，檢測結(jié)果為陽性，通過標準曲線可計算出樣品中的ToCV的拷貝數(shù)為6.21×105copies/μL，而TYLCV和TSWV未檢出熒光信號，與ddH2O為模板的擴增曲線相同，顯示為0，重疊在一起(圖6)，表明該方法具有很高的特異性。

圖5 常規(guī)PCR檢測ToCV的特異性Fig. 5 Specificity of conventional PCR in detection of ToCVM: DNA分子量標準 DNA Marker (DL2000); 1-2: ToCV模板ToCV template; 3-4: TYLCV模板TYLCV template; 5-6: TSWV模板TSWV template; 7-8: ddH2O, 陰性對照ddH2O as the negative control.

2.5 單頭煙粉虱體內(nèi)ToCV的TaqMan RT-qPCR檢測

應(yīng)用TaqMan RT-qPCR方法對實驗室溫室內(nèi)攜帶ToCV的煙粉虱種群和青島市田間大棚內(nèi)疑似ToCV感染的煙粉虱種群進行單頭定量檢測，各隨機取50頭煙粉虱成蟲，結(jié)果如表2所示，溫室內(nèi)煙粉虱種群的ToCV攜毒率為100%，田間煙粉虱種群的攜毒率為30%；所有陽性檢測結(jié)果的Ct值均低于35；所檢測的單頭煙粉虱最高攜帶ToCV的量為4.9×105copies/μL，最低攜帶ToCV的量為1.4×103copies/μL。

3 討論

當(dāng)前對于ToCV的傳統(tǒng)檢測方法多數(shù)針對感病植物組織，主要是常規(guī)PCR法、血清學(xué)鑒定法和逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，這幾種方法耗時耗力，在實際檢測工作中也不夠敏感(Kiletal., 2015; Larrea-Sarmientoetal., 2019)，雖然RT-PCR方法與逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法靈敏度較高，但不能對病毒模板進行定量，這也使其難以符合現(xiàn)在更高標準的檢測要求(陳旭等, 2010; Verweij and Stensvold, 2014)。本研究以其傳播介體煙粉虱為切入點，基于TaqMan RT-qPCR設(shè)計了一種快速、靈敏的檢測方法，通過對煙粉虱體內(nèi)ToCV檢測可以對ToCV的流行趨勢進行監(jiān)測。

圖6 TaqMan RT-qPCR檢測ToCV特異性Fig. 6 Specificity of TaqMan RT-qPCR in detection of ToCV1: ToCV模板ToCV template; 2: TYLCV模板TYLCV template; 3: TSWV模板TSWV template; 4: ddH2O, 陰性對照ddH2O as the negative control.

表2 單頭煙粉虱成蟲體內(nèi)ToCV的TaqMan RT-qPCR檢測Table 2 Detection of ToCV in a single adult of Bemisia tabaci using TaqMan RT-qPCR

本研究依據(jù)ToCV外殼蛋白基因高度保守區(qū)域設(shè)計的特異引物及TaqMan探針，建立了一種更為精準更為靈敏的熒光定量分析技術(shù)，能夠?qū)煼凼w內(nèi)的微量病毒模板進行有效地定量檢測，靈敏度達到8.3×10 copies/μL，是本研究中常規(guī)PCR檢測的1 000倍，也是丁天波等(2018)對ToCV熒光定量檢測靈敏度的約30倍。該方法利用上下游引物及中間探針使反應(yīng)的特異性具有雙重保證，熒光信號與PCR擴增完全同步，不易造成交叉污染，有著更高的檢測靈敏度(蔡驍垚等, 2017; Shahetal., 2017; Ahmad-Nizaretal., 2019)。本研究的引物特異性檢測結(jié)果亦表明，ToCV的TaqMan RT-qPCR引物對TYLCV與TSWV不表現(xiàn)任何擴增，引物特異性強，可以滿足ToCV精準、快速的檢測需求。

本研究所建立的TaqMan RT-qPCR方法與常規(guī)PCR檢測技術(shù)相比，從RNA的提取到得到最終檢測結(jié)果，因無需進行電泳檢測而大大縮短了時間。除此之外，本研究所建立的方法還具有高度特異性和靈敏度，因探針可與病毒分子特異性結(jié)合而結(jié)果可靠，能靈敏地檢測出微量模板中的病毒分子，為ToCV病毒植株及介體昆蟲的病毒監(jiān)測與防控提供了可靠依據(jù)，填補了國內(nèi)利用TaqMan探針實時熒光定量方法檢測介體煙粉虱體內(nèi)ToCV的技術(shù)空白。

本研究所建立方法對單頭煙粉虱攜毒檢測結(jié)果表明這些煙粉虱樣品個體攜毒量均在103數(shù)量級，相較于TaqMan探針可檢測到的最低值仍有較大的空間，證明在本研究中涉及的TaqMan RT-qPCR方法具有較好的應(yīng)用前景，可為ToCV快速診斷、早期預(yù)測預(yù)報及科學(xué)防控提供技術(shù)支撐。

致謝感謝青島農(nóng)業(yè)大學(xué)Michael Anthony Keller教授幫助修改英文摘要。