瓜類褪綠黃化病毒快速檢測(cè)技術(shù)的引物篩選與體系優(yōu)化

王 克, 何艷艷, 張友軍, 吳青君, 王少麗

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)

煙粉虱Bemisiatabaci屬半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，是世界性重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。煙粉虱是由30多個(gè)生物型(隱種)組成的復(fù)合種(De Barroetal., 2011)，其中B和Q型煙粉虱是入侵我國(guó)為害最嚴(yán)重的兩個(gè)生物型。自入侵我國(guó)以來(lái)，不同程度地對(duì)本地種煙粉虱有種群替代現(xiàn)象(Jiuetal., 2017)，且Q型煙粉虱在我國(guó)大部分地區(qū)取代了B型煙粉虱成為優(yōu)勢(shì)為害生物型(Panetal., 2011)。由于Q型煙粉虱抗藥性強(qiáng)、寄主適應(yīng)性廣泛及傳播病毒能力高(Ningetal., 2015)，導(dǎo)致這種演替加速了煙粉虱在田間的發(fā)生和為害。

煙粉虱以成蟲(chóng)和若蟲(chóng)通過(guò)直接刺吸植物汁液、分泌蜜露誘發(fā)煤污病，減弱植物光合作用。同時(shí)，煙粉虱還可通過(guò)傳播植物病毒病給作物造成間接為害，帶來(lái)更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，煙粉虱傳播的病毒種類至少200種(Polstonetal., 2014)，而且新的經(jīng)由煙粉虱傳播的植物病毒仍在不斷產(chǎn)生或逐漸被發(fā)現(xiàn)(Boykin, 2014)。瓜類褪綠黃化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)是由煙粉虱以半持久性方式特異性傳播的一種RNA植物病毒，屬于長(zhǎng)線形病毒科(Closteroviridae)的毛形病毒屬Crinivirus，由兩條正義單鏈 RNA 組成，RNA1 編碼病毒復(fù)制所需蛋白，RNA2包含與病毒組裝、侵染植物、介體傳播有關(guān)的開(kāi)放閱讀框(劉珊珊, 2013; Shietal., 2016; Sunetal., 2017)，其主要侵染西瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科作物(劉珊珊, 2013)。

CCYV病毒2009年在日本被發(fā)現(xiàn)(Gyoutokuetal., 2009)，后逐漸蔓延擴(kuò)散到其他國(guó)家(Wintermanteletal., 2019)。在我國(guó)，CCYV最初在浙江寧波、上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)(Guetal., 2011)，隨后在河南、海南、北京、山東等其他多個(gè)省份陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道(Huangetal., 2010; Guetal., 2011; 張汝楠等, 2012; 劉珊珊等, 2013; 曾蓉等, 2014; 彭斌等, 2017; 楊世安等, 2017; 干射香等, 2019)，給我國(guó)瓜類作物健康生產(chǎn)帶來(lái)了極大的威脅。

CCYV侵染植物初期通常不表現(xiàn)癥狀，因此快速檢測(cè)技術(shù)的建立對(duì)于及時(shí)阻止該病毒傳播及傳播介體防控極為重要。目前已報(bào)道的對(duì)CCYV檢測(cè)方法有PCR擴(kuò)增法(Huangetal., 2010)、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, DAS-ELISA)(Kubotaetal., 2011)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)(Wangetal., 2014)等。在不同的檢測(cè)技術(shù)中，快速、低成本、易于操作的技術(shù)為PCR擴(kuò)增法。以往研究已報(bào)道了不同的CCYV檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法(Gyoutokuetal., 2009; Huangetal., 2010; Guetal., 2011; Hamedetal., 2011; 袁媛等, 2012; Abrahamianetal., 2013; 劉珊珊等, 2013; Keshavarzetal., 2014; Orfanidouetal., 2014; Wintermanteletal., 2019)，然而在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用和試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同引物對(duì)及其配套檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果不盡相同，檢測(cè)的穩(wěn)定性不強(qiáng)、重復(fù)性不足，部分檢測(cè)體系由于檢測(cè)靶標(biāo)的不同或出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果(黎銘等, 2008; 林亞玉等, 2012)。因此，篩選優(yōu)化可用于介體昆蟲(chóng)煙粉虱和寄主植物的CCYV快速、穩(wěn)定檢測(cè)的引物及方法，對(duì)于該病毒的早期診斷、識(shí)別及介體煙粉虱防控具有重要理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 供試煙粉虱及植物葉片

煙粉虱試蟲(chóng)為采自田間的甜瓜、黃瓜、絲瓜、番茄和茄子等作物上的煙粉虱成蟲(chóng)，經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)其生物型(隱種)為Q型(褚棟等, 2005)；檢測(cè)葉片為葉片發(fā)黃、疑似攜帶CCYV的作物葉片。煙粉虱及植物葉片檢測(cè)樣本共計(jì)13份，采集時(shí)間和地點(diǎn)等相關(guān)信息詳見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑

用于CCYV侵染的根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101菌株(分別帶有CCYV RNAl和RNA2的重組表達(dá)載體)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)施艷教授惠贈(zèng)。EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司，PCR擴(kuò)增液2×Es Taq MasterMix和DNA純化試劑盒DNA Clean-up Kit購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)分子量DL5000 Marker購(gòu)自TakaRa公司。其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 引物篩選和條件優(yōu)化

基于已發(fā)表文獻(xiàn)，選出14對(duì)用于檢測(cè)CCYV的特異性擴(kuò)增引物，引物序列及其文獻(xiàn)來(lái)源等信息見(jiàn)表2。檢測(cè)引物委托上海生物工程公司合成。

表1 田間煙粉虱成蟲(chóng)及其寄主植物葉片中CCYV的感染狀況Table 1 CCYV infection in Bemisia tabaci and the host plant leaves in the field

表2 引物序列及其文獻(xiàn)來(lái)源Table 2 Primer sequences and the reference sources

采用已鑒定的攜帶CCYV的根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101制備陽(yáng)性菌液(Shietal., 2016)，注射黃瓜子葉，具體方法參照文獻(xiàn)報(bào)道(Shietal., 2016)，30 d后黃瓜植株出現(xiàn)褪綠癥狀。對(duì)顯現(xiàn)癥狀的黃瓜提取葉片總RNA，使用 PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)中PrimeScript RT Reagent Kit中20 μL體系進(jìn)行。采用NanoDropTM2000c分光光度計(jì)(美國(guó))測(cè)定其濃度，保存反轉(zhuǎn)錄的cDNA原液采用CCYV-HSP-Fa和CCYV-HSP-Ra引物(Gyoutokuetal., 2009)進(jìn)行RCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系: 2×Es Taq MasterMix 10 μL, CCYV-HSP-Fa(10 μmol/L)1 μL, CCYV-HSP-Ra(10 μmol/L)1 μL, cDNA模板1 μL。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增條帶回收純化并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)確定是目標(biāo)條帶后，將該陽(yáng)性cDNA作為后續(xù)引物篩選的陽(yáng)性植株模板。

用PCR鑒定的攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液及其成功侵染的黃瓜葉片的陽(yáng)性cDNA為模板，對(duì)備選的14對(duì)引物進(jìn)行PCR篩選。使用2×Es Taq MasterMix預(yù)混體系(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系: 2×Es Taq MasterMix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液或其侵染的黃瓜葉片的陽(yáng)性cDNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足到總體積20 μL。篩選標(biāo)準(zhǔn)為可以同時(shí)在陽(yáng)性菌液和陽(yáng)性cDNA模板中檢測(cè)出CCYV的引物對(duì)，作為優(yōu)選引物對(duì)。PCR擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s, 退火30 s, 72℃延伸60 s, 35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5 min。鑒于PCR擴(kuò)增采用的是擴(kuò)增預(yù)混Mix體系，因此本研究重點(diǎn)對(duì)擴(kuò)增體系中退火溫度進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增的優(yōu)化(Bio-Rad C1000，美國(guó))，設(shè)置的溫度梯度詳見(jiàn)表3，同時(shí)設(shè)置雙蒸水為模板的陰性對(duì)照，并從梯度擴(kuò)增中優(yōu)選擴(kuò)增條帶明顯、特異性強(qiáng)的退火溫度作為優(yōu)選引物擴(kuò)增體系中的最適退火溫度。每對(duì)引物設(shè)置10次重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證。

表3 各引物對(duì)梯度溫度設(shè)置Table 3 Gradient temperatures for different primer pairs

1.4 優(yōu)選擴(kuò)增引物的擴(kuò)增穩(wěn)定性和靈敏度檢測(cè)

采用4對(duì)優(yōu)選引物及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增體系，以1.3節(jié)中攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液侵染的黃瓜葉片陽(yáng)性cDNA原液為模板，進(jìn)行引物及體系的擴(kuò)增穩(wěn)定性檢測(cè)，每對(duì)引物擴(kuò)增設(shè)置10次重復(fù)。同時(shí)，將該cDNA模板原液(1 021.64 ng/μL)按照梯度1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1 024, 2 048, 4 096和8 192倍稀釋，然后用1.3節(jié)篩選出來(lái)的優(yōu)選引物及其擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增靈敏度檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系: 2×Es Taq MasterMix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 陽(yáng)性cDNA模板1 μL, 用ddH2O補(bǔ)足到總體積20 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣6 μL進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，確定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)所能檢測(cè)到的最低的cDNA模板濃度，即檢測(cè)引物特異性擴(kuò)增的靈敏度。

1.5 優(yōu)選引物對(duì)田間樣本的檢測(cè)

對(duì)采自全國(guó)不同地區(qū)的13份包括蔬菜和瓜類作物上的疑似感染CCYV的帶有癥狀的葉片和不同作物上的煙粉虱成蟲(chóng)的田間樣本(表1)，葉片及煙粉虱成蟲(chóng)的RNA提取、cDNA合成均參照1.3節(jié)所述。田間樣本的cDNA分別采用篩選的4對(duì)優(yōu)選引物及其對(duì)應(yīng)的最優(yōu)退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同1.4節(jié)。同時(shí)設(shè)置雙蒸水作為模板的陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物取6 μL在凝膠電泳上檢測(cè)明確田間煙粉虱種群及植物對(duì)CCYV的感染狀況，由計(jì)算公式(陽(yáng)性樣本數(shù)/檢測(cè)總樣本數(shù))×100%，計(jì)算CCYV的攜帶率，同時(shí)驗(yàn)證所篩選出特異性引物對(duì)田間樣本檢測(cè)的適合性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 最優(yōu)引物的篩選及退火溫度的優(yōu)化

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，引物對(duì)1, 5, 8, 12和13均可從攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液及其侵染的黃瓜葉片的陽(yáng)性cDNA模板中擴(kuò)增到預(yù)期的目標(biāo)條帶；進(jìn)一步考慮擴(kuò)增條帶的特異性和亮度，選取了引物對(duì)5, 8, 12和13擴(kuò)增的目標(biāo)條帶回收純化后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物序列為CCYV的DNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長(zhǎng)度分別為709, 1 515, 152和343 bp(圖1)。

對(duì)篩選獲得的4對(duì)引物對(duì)進(jìn)行PCR退火溫度的優(yōu)化，引物對(duì)5, 8, 12和13的優(yōu)化退火溫度均為56℃。在上述優(yōu)化溫度條件下，各引物對(duì)擴(kuò)增特異性和重復(fù)性強(qiáng)(圖1)，適合用于CCYV的穩(wěn)定檢測(cè)。

2.2 優(yōu)選引物及擴(kuò)增條件的穩(wěn)定性檢測(cè)

在獲得優(yōu)選引物及其優(yōu)化的CCYV擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上，對(duì)引物及其擴(kuò)增穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4對(duì)引物在其優(yōu)化的擴(kuò)增程序下，對(duì)攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液侵染的黃瓜葉片陽(yáng)性cDNA模板均可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增，且擴(kuò)增條帶特異性強(qiáng)(圖2)。

2.3 優(yōu)選引物對(duì)CCYV的擴(kuò)增靈敏度檢測(cè)

在獲得優(yōu)化的CCYV擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上，對(duì)4對(duì)優(yōu)選引物的擴(kuò)增靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，4對(duì)優(yōu)選引物對(duì)稀釋4 096倍的攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液侵染的黃瓜葉片陽(yáng)性cDNA模板仍可擴(kuò)增到微弱條帶(圖3)，檢測(cè)濃度為0. 25 ng/μL，在大于此濃度范圍內(nèi)4對(duì)優(yōu)選引物均可擴(kuò)增到目標(biāo)條帶，而引物對(duì)5, 12和13可以達(dá)到檢測(cè)模板濃度低至0.125 ng/μL(稀釋8 192倍)的靈敏度，說(shuō)明所篩選的4對(duì)引物及其對(duì)應(yīng)的檢測(cè)體系，對(duì)最低cDNA模板濃度為0.25 ng/μL的測(cè)試樣本均可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定檢測(cè)。

2.4 田間寄主植物葉片及煙粉虱的CCYV感染率

采集田間的13份疑似感染CCYV的瓜類植物葉片及田間的煙粉虱成蟲(chóng)， 分別采用上述 4對(duì)優(yōu)選引物及其優(yōu)化的擴(kuò)增體系進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，引物對(duì)5, 8, 12和13對(duì)葉片或煙粉虱成蟲(chóng)樣本是否攜帶CCYV病毒的檢測(cè)結(jié)果是完全一致的；對(duì)于擴(kuò)增到陽(yáng)性條帶的樣本，擴(kuò)增條帶同時(shí)采用直接測(cè)序法確認(rèn)了其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)果說(shuō)明這4對(duì)優(yōu)選引物及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增體系均可用于田間CCYV的快速檢測(cè)。

圖1 不同引物對(duì)攜帶CCYV的根癌農(nóng)桿菌GV3101菌液(A, B, C)及其侵染的黃瓜葉片的陽(yáng)性cDNA (D, E, F)的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplifications of bacterial solution of Agrobacterium tumefaciens carrying CCYV (A, B, C) and cDNAs from CCYV-infected cucumber leaves (D, E, F) using different primer pairsM: DNA Marker DL5000; 1-14: 分別為以陽(yáng)性cDNA為模板用表2中的引物對(duì)1～14的擴(kuò)增產(chǎn)物Amplification products using positive cDNA as the template with primer pairs 1-14 in Table 2, respectively; N: 以雙蒸水為模板, 陰性對(duì)照H2O as the template (negative control).

圖2 4對(duì)優(yōu)選引物對(duì)攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液侵染的黃瓜葉片的陽(yáng)性cDNA模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification of positive cDNA template from the cucumber leaves infected by Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying CCYV using four primer pairs selectedA-D: 分別為優(yōu)選引物對(duì)5, 8, 12和13(見(jiàn)表2)的PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR amplification results with the primer pairs 5, 8, 12, and 13 (see Table 2), respectively. M: DNA Marker DL5000; N: 以雙蒸水為模板, 陰性對(duì)照 H2O as the template (negative control); 1-10: 以陽(yáng)性cDNA為模板的10次重復(fù)擴(kuò)增結(jié)果10 replicates of amplification with positive cDNA as the template.

圖3 4對(duì)優(yōu)選引物對(duì)CCYV的PCR擴(kuò)增靈敏度檢測(cè)Fig. 3 Sensitivity of PCR amplification of CCYV with four pairs of primers selectedA, B, C, D: 分別為引物對(duì)5, 8, 12和13(見(jiàn)表2)的PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR amplification results with the primer pairs 5, 8, 12, and 13 (see Table 2), respectively. M: DNA Marker DL5000; N: 以雙蒸水為模板, 陰性對(duì)照H2O as the template (negative control); 1-14: 分別為攜帶CCYV的GV3101根癌農(nóng)桿菌菌液侵染的黃瓜葉片陽(yáng)性cDNA模板(1 021.64 ng/μL)依次稀釋1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1 024, 2 048, 4 096和8 192倍的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR amplification product of the positive cDNA templates (1 021.64 ng/μL) from cucumber leaves infected by Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying CCYV in 1-, 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 128-, 256-, 512-, 1 024-, 2 048-, 4 096-, and 8 192-fold dilution, respectively.

田間13份樣本檢測(cè)結(jié)果表明，2019年在新疆和田、河南武陟、山東壽光、天津武清、陜西安康、海南海口、海南三亞、湖南長(zhǎng)沙、北京海淀等地區(qū)的9份煙粉虱種群及其疑似帶毒葉片中感染了CCYV，田間樣本的CCYV陽(yáng)性率69.23%。5-7月份采集自北京海淀、湖南長(zhǎng)沙、江西贛州的煙粉虱及其植株葉片中對(duì)CCYV的檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明未攜帶CCYV。除了5月份采集自海南煙粉虱測(cè)試種群外，其他檢測(cè)到CCYV陽(yáng)性的新疆和田、河南武陟、山東壽光、湖南長(zhǎng)沙和北京海淀的煙粉虱及其取食的植株葉片均采集于秋季(表1)，說(shuō)明除海南地區(qū)外，我國(guó)華中、華北等北方地區(qū)的秋季均為CCYV易感期。

3 討論

CCYV是由近年來(lái)發(fā)生的、由煙粉虱半持久性傳播的植物病毒病(Guetal., 2011; Lietal., 2016)，逐漸在中國(guó)擴(kuò)散蔓延和為害(王青等, 2018)。植物感染病毒病初期，其癥狀表現(xiàn)不易識(shí)別，需采用分子生物學(xué)方法和技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)才能明確其感染情況。在對(duì)CCYV的相關(guān)研究中，不同文獻(xiàn)中采用的引物序列及其擴(kuò)增條件各不相同，而本文作者在前期預(yù)備試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同文獻(xiàn)中的引物和擴(kuò)增條件對(duì)同一靶標(biāo)生物的檢測(cè)結(jié)果不一致，分析可能與有些擴(kuò)增引物的篩選和應(yīng)用具有靶標(biāo)生物的特定性有關(guān)。例如，大部分基于CCYV病毒的外殼蛋白設(shè)計(jì)引物對(duì)通過(guò)根癌農(nóng)桿菌注射法獲得的CCYV陽(yáng)性植株的早期檢測(cè)相對(duì)困難，但對(duì)田間的攜毒植物或煙粉虱種群則可成功擴(kuò)增，且擴(kuò)增特異性強(qiáng)(數(shù)據(jù)未示)，可能是由于注射法獲得的植株病毒CP蛋白表達(dá)含量比較低、不足以成功檢測(cè)到。因此，篩選獲得可以從不同途徑感染的CCYV靶標(biāo)對(duì)于該病毒的快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)和防控意義重大。

為了能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)根癌農(nóng)桿菌侵染獲得的陽(yáng)性菌株和田間自然染毒樣品的同時(shí)穩(wěn)定擴(kuò)增，本文建立了基于此的引物篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得的4對(duì)優(yōu)選引物(引物對(duì)5, 8, 12和13)可用于CCYV的穩(wěn)定檢測(cè)，無(wú)論是對(duì)陽(yáng)性菌液，或?qū)τ谔镩g攜毒植株、田間煙粉虱試蟲(chóng)等靶標(biāo)，均可實(shí)現(xiàn)對(duì)CCYV的穩(wěn)定、特異性擴(kuò)增及快速檢測(cè)，且能夠成功擴(kuò)增到的最低cDNA模板濃度為0.25 ng/μL，與以往研究中寄生蜂識(shí)別鑒定時(shí)的最低檢測(cè)濃度7.812 ng/μL(張銳銳等, 2012)相比，濃度還低至少30倍。本研究所建立的體系的最低檢測(cè)劑量雖然高于熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)靈敏度或其他植物病毒種類的檢測(cè)最低劑量(宋震等, 2017)，但選擇這些優(yōu)選引物中的任何一對(duì)及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增程序均可以實(shí)現(xiàn)對(duì)田間植物感染CCYV或其媒介昆蟲(chóng)煙粉虱的攜毒性和攜毒率檢測(cè)，進(jìn)而針對(duì)性制定對(duì)煙粉虱及其傳毒為害的早期防控。

本研究采用優(yōu)選引物對(duì)采集自我國(guó)11個(gè)地區(qū)的共計(jì)13份煙粉虱及疑似帶毒植株葉片進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)全年溫度較暖的海南地區(qū)5月份采集的煙粉虱及其取食的植物葉片均感染了CCYV，這可能與5月份海南溫度高、煙粉虱適合發(fā)生有關(guān)(王原等, 2018)。根據(jù)以往報(bào)道，2016年海南番茄和黃瓜上的Q型煙粉虱攜帶CCYV的比例分別達(dá)到了65.0%和55.0%(Tangetal., 2017)，說(shuō)明近年來(lái)海南省的CCYV發(fā)生率高，生產(chǎn)上需要引起極大重視，做好預(yù)防措施。然而，其他采樣地區(qū)不同，春季瓜類作物上CCYV發(fā)生率極低或不發(fā)生，而秋季瓜類作物上發(fā)生CCYV的感染率很高，說(shuō)明秋季瓜類作物感染CCYV的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于春季，這可能與此時(shí)煙粉虱種群的高發(fā)生數(shù)量及其種群密度密切相關(guān)(劉珊珊等, 2013)。對(duì)于采集于番茄植株上的煙粉虱我們也檢測(cè)到CCYV病毒，我們猜測(cè)可能是煙粉虱從其他寄主植物上帶毒。本研究中，新疆和田地區(qū)檢測(cè)的甜瓜上煙粉虱攜帶有CCYV病毒，結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)(彭斌等, 2017)，說(shuō)明新疆和田及吐魯番地區(qū)8-9月份哈密瓜上該病毒病高發(fā)，發(fā)病率可高達(dá)80%。因此，秋季應(yīng)特別警惕煙粉虱及其傳播的CCYV的發(fā)生危害，防控措施上需首先降低煙粉虱種群數(shù)量。本研究中還發(fā)現(xiàn)，山東壽光和海南三亞地區(qū)的煙粉虱種群分別采自番茄和茄子作物，但該兩種作物上的煙粉虱種群仍被檢測(cè)到攜帶CCYV病毒，與以往報(bào)道(Tangetal., 2017)類似，說(shuō)明不感染CCYV的植物上的煙粉虱仍然有攜毒風(fēng)險(xiǎn)，如果此類煙粉虱種群擴(kuò)散到瓜類作物或其他可感毒寄主植物上，由帶毒煙粉虱傳播導(dǎo)致植物感染病毒病的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)很高。從瓜類作物種類上來(lái)看，目前國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道該病毒在黃瓜上的侵染(Bananejetal., 2013; 干射香等, 2019)。本研究檢測(cè)到甜瓜和黃瓜葉片上均有CCYV的感染，而在生產(chǎn)實(shí)踐及以往報(bào)道中，田間甜瓜上出現(xiàn)疑似CCYV感染癥狀的比例更高(喬寧等, 2015; 彭斌等, 2017)，表明甜瓜可能更易于感染該病毒，但CCYV在甜瓜、西瓜、絲瓜、黃瓜等不同瓜類作物上的感染效率比較研究需要進(jìn)一步試驗(yàn)和明確。除了瓜類作物，值得關(guān)注的是我國(guó)海南三亞地區(qū)崖城鎮(zhèn)和天涯鎮(zhèn)的空心蓮子草Alternantheraphiloxeroides也檢測(cè)到感染了CCYV(Tangetal., 2017)，說(shuō)明該病毒的染毒植物譜可能還在擴(kuò)大。

我國(guó)最初于2011年報(bào)道CCYV的發(fā)生(Guetal., 2011)，這與Q型煙粉虱被發(fā)現(xiàn)大范圍、快速取代B型煙粉虱而成為優(yōu)勢(shì)種類的報(bào)道時(shí)間基本一致(Panetal., 2011)。本研究所檢測(cè)的煙粉虱均為Q型煙粉虱。研究發(fā)現(xiàn)，CCYV可以直接或間接地影響煙粉虱的取食偏好性，并且能夠增強(qiáng)煙粉虱的取食效率(盧少華等, 2015)；Q型煙粉虱比B型煙粉虱對(duì)植物非韌皮部探查和韌皮部唾液分泌增多(Luetal., 2019)，且Q型煙粉虱的傳毒能力更強(qiáng)(Luetal., 2017)。因此，目前在我國(guó)Q型煙粉虱替代B型煙粉虱而占優(yōu)勢(shì)為害種類可能是導(dǎo)致CCYV病毒在我國(guó)發(fā)生和擴(kuò)散蔓延的主要原因之一，煙粉虱攜毒的早期發(fā)現(xiàn)及防控對(duì)于阻斷CCYV病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散為害極為重要。