鴉膽子油乳灌腸抗?jié)冃越Y(jié)腸炎大鼠結(jié)腸粘膜損傷的作用及機理研究

王建波，路士華，王偉，王偉明

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011）

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是全球性疾病，由于其發(fā)病原因及機制尚不完全清楚，臨床尚缺乏令人滿意的治療手段，該病纏綿難愈，易復(fù)發(fā)，且有癌變傾向，已被WHO 列為現(xiàn)代難治病之一[1-3]。大量文獻資料及臨床實踐證實中醫(yī)藥治療本病具有獨特的優(yōu)勢[3-5]，所以深入探索中醫(yī)有效方藥，具有十分重要的理論及實踐價值。課題組通過前期大量的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者，特別是處于活動期的患者，多表現(xiàn)為熱毒內(nèi)盛的證候，基于此種臨床現(xiàn)象，我們應(yīng)用鴉膽子油乳保留灌腸治療，在臨床應(yīng)用中取得了顯著的效果。本研究旨在前期臨床工作的基礎(chǔ)上，進一步通過實驗研究，觀察鴉膽子油乳對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織損傷的修復(fù)，以及對結(jié)腸組織中IL-6、IL-10 及對TNF-α 含量的影響，以探討鴉膽子油乳治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料。清潔級Wistar 雄性大鼠60 只，鼠齡12 周，體重（280±25）g。購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，實驗動物合格證 SCXK（魯）2016-0001。

1.2 受試藥物。鴉膽子油乳注射液，生產(chǎn)企業(yè)：廣州白云山明興制藥有限公司，批準文號：國藥準字12054324Z，規(guī)格10 mL/支。美沙拉嗪腸溶片，生產(chǎn)企業(yè)：由佳木斯鹿靈制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準字H19980148，規(guī)格0.25 g/粒。

1.3 試劑與儀器。2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS） 溶液（美國Sigma 公司），購于上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司；大鼠TNF-α、IL-6、IL-10 檢測試劑盒，均購自濟南森艾狄生物科技有限公司；Allegra X-15R 離心機（美國Beckman Coulter Inc.）；DY89-II 電動玻璃勻漿機，（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UV1902PC 紫外可見分光光度計：（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；ELx808 吸收光酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與造模：適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1 周后隨機分為6 組：正常對照組，UC 模型對照組，鴉膽子油乳低、中、高劑量組和西藥對照美沙拉嗪組（以下簡稱正常組、模型組、鴉膽子油乳低劑量組、鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組）），每組10 只。造模前禁食24 h，留取10 只作為正常組，其余大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，用雙豬尾管從肛門插入，深度為8 cm，推入TNBS 溶液（含2.5% TNBS、50%乙醇）4 mL/kg 體重，捏緊肛門平放5 min 即可[6]。

1.4.2 給藥方法：鴉膽子油乳注射液給藥量：大鼠低、中、高劑量分別按成人用量的5 倍、10 倍、20 倍計算，即2.5 mL/kg，5 mL/kg，10 mL/kg 藥物，用生理鹽水配成250 mL/L，500 mL/L，1000 mL/L。西藥組：大鼠劑量按成人10倍用藥劑量，即0.5 g/kg，美沙拉嗪用生理鹽水配成50g/L。造模成功后第3 天，將UC 模型動物分為模型組、鴉膽子油乳低劑量組、鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組，開始灌腸給藥，給藥量為l0 mL/kg 體重。正常組，模型組給等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)干預(yù)18 天。

1.4.3 標(biāo)本采集：實驗結(jié)束后各組小鼠禁食不禁水24 小時稱體重后，均以頸椎脫臼法處死，取出肛門至盲腸末端的整個結(jié)腸和直腸段，剖開腸管，用冷生理鹽水將結(jié)腸沖洗干凈，用濾紙吸干后，觀察各組大鼠結(jié)腸的大體改變；在病變最明顯處取3 段長約1 cm 的小鼠結(jié)腸組織，福爾馬林浸泡固定，以備制作病理切片；其余結(jié)腸剪短后置于1.5 mL 離心管中，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 病理切片制作及組織學(xué)評分：結(jié)腸組織標(biāo)本用10%福爾馬林溶液浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，中性樹脂膠封片，光鏡下觀察病理改變并進行組織學(xué)評分。組織學(xué)評分標(biāo)準[7]：無損傷為0 分；腸壁粘膜少量炎細胞浸潤，黏膜下充血或出血；為1 分；上皮覆蓋不全或不成熟，黏膜層及黏膜下層大量慢性炎性細胞浸潤為2 分；明顯充血水腫，黏膜層及黏膜下層大量中性粒細胞浸潤，隱窩腫壞死及潰瘍形成為3 分。

1.4.5 檢測指標(biāo)：采用ELISA 法檢測結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α 含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，差異比較用均值±標(biāo)準差表示，組間比較采用t 檢驗法，P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 提示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸粘膜損傷情況。結(jié)果顯示，模型組評分明顯高于空白組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明造模成功。鴉膽子油乳中、高劑量組及西藥組評分均不同程度降低（P＜0.01 或P＜0.05），其中，高劑量組明顯優(yōu)于中劑量組及西藥組，但與西藥組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明，各組均可減輕粘膜組織損傷，作用效果依次為高劑量組、中劑量組、西藥組、低劑量組，結(jié)果見表1。

表1 各組組織評分比較

表1 各組組織評分比較

注：與正常組比較：●P＜0.01。與模型組比較：△P＜0.05，▲P＜0.01，＃P＞0.05。與美沙拉嗪組比較：￡P(guān)＜0.05，■P＜0.01，※P＞0.05。

組別 組織評分正常組 0.20±0.42模型組 2.90±0.57●鴉膽子油乳低劑量組 2.50±0.71●?！犋f膽子油乳中劑量組 2.20±0.79●△※鴉膽子油乳高劑量組 1.80±0.63●▲※西藥組 2.00±0.67●△

2.2 結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α 含量測定結(jié)果。IL-6比較：與模型組比較，鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組差異特別顯著（P＜0.01）。但與西藥組比較，鴉膽子油乳中劑量組、高劑量組無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果說明，各組均能有效降低IL-6 的表達，其中鴉膽子油乳低、中、高劑量組均能降低IL-6 的表達，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，高劑量組作用最為顯著，優(yōu)于西藥對照組，但與西藥組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IL-8 比較：與模型組比較，鴉膽子油乳低劑量組差異顯著（P＜0.05），鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組差異特別顯著（P＜0.01）。與西藥組比較，低劑量組、中劑量組差異顯著（P＜0.05），而高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明，各組均能有效增加IL-8 的表達，尤以中劑量組、高劑量組作用顯著，其中高劑量組與西藥組作用相當(dāng)。TNF-α 比較：與模型組比較，鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組差異特別顯著（P＜0.01）。與西藥組比較，低劑量組、中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明，各組均能有效降低TNF-α 的表達，以中劑量組、高劑量組、西藥組尤為顯著，高劑量組與西藥組作用相當(dāng)，結(jié)果見表2。

表2 各組炎性指標(biāo)比較，pg/mL）

表2 各組炎性指標(biāo)比較，pg/mL）

注：與正常組比較：◎P＜0.05，●P＜0.01，＆P＞0.05。與模型組比較：△P＜0.05，▲P＜0.01。與西藥組比較：￡P(guān)＜0.05， ■P＜0.01，※P＞0.05。

組別/指標(biāo) IL-6 IL-8 TNF-α正常組 117.61±1.49 296.25±28.24 36.27±2.72模型組 200.95±4.18● 91.25±12.66● 80.22±4.31●低劑量組 178.71±1.84●△□ 126.25±14.92●△￡ 62.38±3.95●△￡中劑量組 147.71±3.02◎▲※ 206.25±11.45◎▲￡ 42.61±5.01◎▲￡高劑量組 131.98±2.16◎▲※ 257.50±18.52＆▲※ 49.11±4.44◎▲※西藥組 141.28±3.91◎▲ 260.25±17.56＆▲ 52.38±3.13◎▲

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）為炎癥性腸病，目前對本病的發(fā)病原因及機制尚不明確，多認為主要涉及免疫、感染、遺傳等因素有關(guān)。中醫(yī)學(xué)中并無潰瘍性結(jié)腸炎此病名，從其臨床表現(xiàn)特征來看，應(yīng)歸屬中醫(yī)學(xué)“休息痢”、“腸風(fēng)”、“臟毒”等范疇，而其病因多與稟賦不足、飲食失節(jié)與情志內(nèi)傷等有關(guān)[8]。其病機課題組從多年臨床實踐觀察中總結(jié)認為，脾氣虧虛為其始動因素，而濕、熱、瘀、毒既是病理產(chǎn)物，又是本病反復(fù)發(fā)作，纏綿不愈的重要致病因素。依據(jù)此理論，我們針對潰瘍性結(jié)腸炎活動期以熱、毒等標(biāo)實為突出矛盾的臨床特點，我們采用鴉膽子油乳灌腸治療取得了良好的臨床效果。鴉膽子味苦、性寒涼，鴉膽子具有清熱解毒、止痢的功效，切合病機，由于其具有腐蝕贅疣的作用，尤其適用于伴有炎性息肉的UC 患者。

中藥鴉膽子為苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子（Brucea j avanica L.Merr.）的干燥成熟果實，該藥材原植物主產(chǎn)于我國南方沿海熱帶和亞熱帶地區(qū)[9]。鴉膽子始載于清代趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》，具有清熱解毒、截瘧止痢、腐蝕贅疣的功效[10]。歷史上我國民間廣泛應(yīng)用鴉膽子治療痢疾等疾病，如張錫純提倡用鴉膽子治療痢疾，其在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》謂其“味極苦，性涼，為涼血解毒之要藥，善治熱性赤痢……最能清血分之熱及腸中之熱，防腐生肌，誠有奇效”[11]。鴉膽子油乳為鴉膽子果實中提取得到的脂肪油乳化制成，主要有效成分為油酸和亞油酸[10]，有研究表明具有抗腫瘤、提高機體免疫功能、抑菌、抗炎等多方面的生物活性，其油乳劑優(yōu)點在于可以提高藥物對皮膚 以及黏膜的穿透性并減輕藥物對生理組織的刺激性[12-14]。

免疫機制在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的作用己得到醫(yī)學(xué)界公認，其中細胞因子在腸道免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，腫瘤壞死因子、IL-6 和IL-8 等促炎癥細胞因子被認為是的能介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的細胞因子，而一些細胞因子IL-4、IL-10 等則具有抗炎作用[15]。促炎與抗炎因子的平衡狀態(tài)在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病及發(fā)展過程中起到了非常重要的作用，并且與病情嚴重程度有關(guān)。檢測TNF-a 的水平對UC 的診斷、活動情況及預(yù)后判定均具有重要意義，并可通過減少TNF-a、IL-6、IL-10 的表達或抑制生物學(xué)功能來治療潰瘍性結(jié)腸炎。

本項研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳注射液具有明確治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用，不僅可使?jié)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠的結(jié)腸黏膜得到明顯修復(fù)與改善，并可升高結(jié)腸組織中細胞因子IL-10的含量，降低結(jié)腸組織中細胞因子IL-6 的含量，同時還能明顯降低結(jié)腸組織中 TNF-a 的表達。由此推測，鴉膽子油乳注射液可能是通過抑制TNF-a 的表達，減弱了其作為啟動因子的級聯(lián)炎性反應(yīng)鏈的擴大，減少促炎癥介質(zhì)的釋放，增加保護因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用，從而發(fā)揮其治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。