高通量基因測序技術(shù)檢測早期流產(chǎn)絨毛染色體異常及相關(guān)因素分析

許展，程東凱，于洪君，李寶山，劉雙

（沈陽東方菁華醫(yī)院有限公司，遼寧 沈陽）

0 引言

妊娠早期流產(chǎn)是通過輔助生殖治療(ART)懷孕最常見的并發(fā)癥，胚胎染色體異常約占這些損失的50%[1]。據(jù)報道，與自然受孕相比，ART所用的技術(shù)可能會增加懷孕產(chǎn)生染色體異常的風(fēng)險，并導(dǎo)致早期妊娠損失[2]。G顯帶核型分析是染色體分析的傳統(tǒng)方法，對探討自然流產(chǎn)的原因具有重要意義。然而，G顯帶的核型分析受到染色體準備不良、培養(yǎng)失敗和母體細胞污染的等因素的限制。分子核型方法，如多重?zé)晒庠浑s交(mFISH)，多重連接依賴探針擴增(MLPA)，定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)，克服了傳統(tǒng)細胞遺傳學(xué)技術(shù)固有的一些缺點[3,4]。然而，他們因其分辨率有限和/或整個基因組覆蓋范圍有限而受到質(zhì)疑。在本研究中，我們應(yīng)用高通量測序技術(shù)來檢測早期自發(fā)性流產(chǎn)的女性絨毛樣本，分析流產(chǎn)可能發(fā)生的原因，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本收集和DNA提取

本研究經(jīng)沈陽東方菁華醫(yī)院機構(gòu)審查委員會批準。在知情同意的情況下，收集了2015年1月至2018年12月189例自發(fā)性流產(chǎn)婦女的絨毛樣本（ART共166例，自然妊娠組共23例）。每個樣品在生理鹽水中漂洗三次。然后用DNA提取試劑盒提取10mg組織以提取基因組DNA（天根生化科技（北京）有限公司）。

1.2 高通量測序技術(shù)進行染色體拷貝數(shù)分析和驗證

使用Ion torrent PGM試劑盒(ThermoFisher，美國)將絨毛樣本基因組DNA剪切至250-300 bp片段。使用Ion Plus片段庫工具包(ThermoFisher，美國)構(gòu)建離子種子條形碼庫。使用IonPGM模板OT2 200試劑盒（美國ThermoFisher）用于模板擴增和靶序列富集。使用Ion OneTouch ES（ThermoFisher，美國）回收離子球顆粒（ISP）并富集模板陽性ISPs。使用Ion PGM Sequencing 200 Kit v2（ThermoFisher，USA）在'318'測序芯片上進行測序，共有500個核苷酸流，平均讀取長度為220-230 bp。10個DNA樣本匯集在一起，并在“318”芯片上標記不同的條形碼。全基因組序列平均深度為～0.02×，平均讀數(shù)為～500k。主要測序BAM數(shù)據(jù)提交到Celloud cloud服務(wù)器(http://www.celloud.org/)，該服務(wù)器由第三方公司(JBRH，中國)提供，用于分析染色體拷貝數(shù)變異(CNVs)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用χ2檢驗，當(dāng)1≤理論頻數(shù)＜5，用校正χ2檢驗比較P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異常核型情況

189例絨毛組織中染色體異常124例，正常65例，染色體異常率65.61%（124/189）。流產(chǎn)組織染色體非整倍性發(fā)生率為65.61%（124/189），其中三倍體占37.10%（46/124）。三倍體中發(fā)生頻次以16三體占比最高，可達23.91%（11/46）、其次是22三體占21.74%（10/46）以及Turner綜合征占8.70%（4/46）。見表1。

表1 異常核型情況

2.2 孕婦年齡與絨毛染色體異常發(fā)生率

孕婦年齡大于35歲組染色體異常發(fā)生率明顯高于年齡小于35歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 孕婦年齡與染色體異常發(fā)生率

2.3 初次自然流產(chǎn)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛染色體異常發(fā)生率比較

既往有2次及2次以上自然流產(chǎn)病史的孕婦染色體異常68%（17/25）雖高于首次發(fā)生自然流產(chǎn)患者65.24%（107/164），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。見表3。

表3 自然流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常發(fā)生率

2.4 自然妊娠和ART妊娠絨毛染色體異常發(fā)生率比較

ART組與NC（自然妊娠）染色體異常率分別為64.46%（107/166）、73.91%（17/23），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 自然妊娠與ART妊娠絨毛染色體異常發(fā)生率

2.5 孕周與絨毛染色體異常發(fā)生率

孕周大于9周的患者染色體異常率73.24%（52/71）也略高于孕周小于9周的患者61.02（72/118），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 5。

表5 孕周與染色體異常發(fā)生率

3 討論

輔助生殖技術(shù)已成為許多不孕不育夫婦的重要治療手段和基本技術(shù)。雖然多個不孕不育治療中心ART妊娠率穩(wěn)定在40%左右，但帶回家的嬰兒率仍為20-30%，其中一個重要原因是早期自然流產(chǎn)率較高的[5]。妊娠早期流產(chǎn)在所有臨床診斷的妊娠中占10%-15%，其中胚胎染色體異常是自發(fā)性流產(chǎn)最常見的原因，約占60%。然而，ART術(shù)后患者的早期自然流產(chǎn)率在22%-63%之間。ART治療的失敗與許多因素有關(guān)，遺傳缺陷尤其是胚胎染色體異常是導(dǎo)致妊娠早期自發(fā)性流產(chǎn)的主要原因之一[6]。

妊娠產(chǎn)物的細胞遺傳學(xué)分析是探討自然流產(chǎn)原因的基礎(chǔ)。多重細胞遺傳學(xué)分析表明，在不同的人群中，妊娠早期流產(chǎn)的非整倍率在50%-80%之間[7]。細胞遺傳學(xué)的異常核型包括常染色體三體、性染色體單體、三倍體、雙三體、多倍體以及結(jié)構(gòu)重排。其中常染色體三體是最常見的染色體異常。

常規(guī)g顯帶染色體分型是檢測染色體非整倍性和不平衡的金標準方法。但總體檢測失敗率約為20%，有時由于母體細胞相對于胎兒細胞過度生長而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。最近，高通量測序技術(shù)被證實能夠可靠地檢測絨毛樣本中的CNVs[8]。Array CGH和NGS都是高通量的基因檢測平臺，對傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)產(chǎn)生了革命性的影響[4,9]。本研究采用NGS方法檢測染色體拷貝數(shù)分析異常，對流產(chǎn)胚胎染色體異常檢出率65.24%。本研究分析了流產(chǎn)組織染色體非整倍性發(fā)生率，其中三倍體占37.10%，三倍體中發(fā)生頻次以16三體占比最高，可達23.91%。

母體高齡、核型改變、多種輔助生殖技術(shù)(ART)失敗、多次流產(chǎn)、Mesa-Tese獲得精子等不良因素導(dǎo)致胚胎染色體異常風(fēng)險增加[10]。在ART中，孕婦年齡可能被認為是影響妊娠結(jié)局的最重要因素。對于不育夫婦，流產(chǎn)的風(fēng)險和非整倍體率已知會隨著產(chǎn)婦年齡的增長而高度增加[11]。本研究結(jié)果指出孕婦年齡大于35歲組染色體異常發(fā)生率明顯高于年齡小于35歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。盡管尚未完全理解年齡效應(yīng)的發(fā)病機理，但認為它是由卵母細胞中第一減數(shù)分裂產(chǎn)生的錯誤引起的[12]。隨著年齡的增長，女性的卵母細胞減數(shù)分裂錯誤的發(fā)生率增加，這是由于卵子在排卵前被阻滯在第一減數(shù)分裂中的時間延長。而減數(shù)分裂紡錘體形態(tài)也被發(fā)現(xiàn)隨著母體年齡的增加而發(fā)生有害地改變。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)次數(shù)對胚胎染色體異常無顯著影響，ART也并沒有增加胚胎染色體異常率。

綜上，染色體異常是胚胎早期停止發(fā)育流產(chǎn)的重要原因，其中孕婦高齡可能使胚胎染色體異常發(fā)生的幾率增高，高齡人群應(yīng)更注重孕早期胎兒染色體檢查；與NC相比ART不會增加胚胎染色體異常的發(fā)生率。