福白菊總黃酮的微波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

田明杰，譚宏淵，葉帆宇，周勁杰，胡 婷，占劍峰，王蔚新，向 福，李士明，吳 鵬

（黃岡師范學院 生物與農業(yè)資源學院 經(jīng)濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

福白菊（Chrysanthemum morifolium）是以湖北麻城福田河鎮(zhèn)為中心、大別山地區(qū)種植的地方菊花品種，培育歷史悠久，具有朵大肉厚、花瓣玉白、湯液清澈等品質特征。麻城福白菊主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、有機酸類等化學成分，具有抑菌、抗氧化、抗衰老等藥理作用[1]。麻城福白菊中含有豐富的黃酮，達8.19%[2]，為藥食兼用型中藥材[3]，但目前對麻城福白菊的研究主要集中在栽培技術、初級產品加工等方面，而對其功能性分析及深加工方面的研究鮮有報道。

目前，提取菊花中黃酮的方法主要有有機溶劑提取法、微波輔助萃取、超聲波提取法等。LIU Y H等[4]利用超聲波提取技術對菊花中黃酮進行提取，最優(yōu)條件下總黃酮提取率為5.24%，但耗時30 min。陳婷[5]采用乙醇提取法，優(yōu)選菊花進行總黃酮的提取，最優(yōu)提取工藝下，總黃酮的浸提量為28.11 mg/g。微波輔助萃取技術是在有機溶劑浸提的同時加入微波，與前兩者相比，具有操作時間短，有效成分收率高等特點[6]，近年來廣泛用于天然產物的提取。楊浩等[7]利用微波輔助萃取法提取菊花中總黃酮，最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)70%，時間為100 s，料液比為1∶20（g∶mL），此時提取率為8.97%。

為進一步挖掘麻城福白菊的綜合利用價值，本研究以麻城福白菊為原料，采用微波輔助乙醇進行提取的方法，通過單因素及響應面試驗設計[8]對總黃酮的提取工藝條件進行了優(yōu)化，確定其最佳提取工藝條件，并測定了福白菊總黃酮的還原能力以及對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率，以此對其抗氧化活性進行探究，旨在為麻城福白菊總黃酮的深加工及合理開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻城福白菊：湖北新奇益科技有限公司；蘆丁標準品（純度＞98%）：中國藥品生物制品檢定所；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、DPPH、磷酸鹽、鐵氰化鉀、三氯乙酸、抗壞血酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DFT-200C 高速萬能粉碎機：上海比朗儀器制造有限公司；WBFY-201微波化學反應器：鞏義市予華儀器有限責任公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；723型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；H/T18MM臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麻城福白菊總黃酮的提取工藝流程

麻城福白菊→粉碎成粉→過80目篩→稱質量→按1∶40（g∶mL）的料液比加入體積分數(shù)為70%乙醇→設置微波功率240 W，微波提取時間2 min（20 s微波一次，分六次微波）條件下進行微波輔助提取→真空抽濾（真空度為0.04 MPa）→總黃酮粗提液

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制及總黃酮含量測定[9-11]

以吸光度值A（y）為縱坐標，蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線，得標準曲線回歸方程y=0.1547x+0.0059，相關系數(shù)R2=0.999 2。按照回歸方程計算樣品中總黃酮含量。福白菊總黃酮得率計算公式[12]如下：

式中：X為福白菊中總黃酮的提取率，%；c為總黃酮的質量濃度，g/L；V為樣品溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為麻城福白菊粉末的質量，g。

1.3.3 提取條件優(yōu)化單因素試驗[13-14]

準確稱取1.00 g麻城福白菊粉末，分別在不同微波提取時間（5 s、30 s、60 s、90 s、120 s）、不同料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL））、不同微波功率（80 W、240 W、400 W、640 W、800 W）條件下進行提取，分別考察提取時間、料液比、微波功率對麻城福白菊總黃酮得率的影響。

1.3.4 提取條件優(yōu)化響應面優(yōu)化試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，以料液比（A）、微波功率（B）、微波提取時間（C）3個因素為自變量，總黃酮得率（Y）為響應值，利用Box-Behnken design法設計3因素3水平的試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 抗氧化活性研究

（1）DPPH自由基清除能力的測定

參照騰昭玉等[15-17]的方法并加以修改。配制福白菊總黃酮溶液質量濃度分別為0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L，以相同質量濃度的維生素C溶液為對照，分別準確移取2 mL樣品溶液與2 mL 0.15 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液于試管中混勻，避光靜置30 min，以無水乙醇作為參比液在波長517 nm處測定吸光度值，記為Ax；同時以2 mL無水乙醇替代樣品溶液，測定吸光度值Ao。以及2 mL等濃度的待測樣品與等體積無水乙醇混合，測定其本底吸光度值Axo。DPPH自由基清除率（Y）計算公式如下：

（2）還原能力的測定[18]

分別吸取2.5 mL不同濃度的樣品，依次加入0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）2.5 mL和1%K3Fe（CN）62.5 mL，混合均勻，放置于50 ℃恒溫水浴中反應20 min后取出，急速冷卻，再加入10%三氯乙酸2.5 mL并于3 000 r/min條件下離心10 min。取上清液5.0 mL，加入5.0 mL蒸餾水和1.0 mL 1 mg/L FeCl3，混勻后靜置10 min，在波長700 nm處測定吸光度值A，同時蒸餾水替代樣品，測定空白組的吸光度值A0，再得出還原力。ΔA越大，反映出還原能力越強，抗氧化性也就越強。還原力計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對總黃酮得率的影響

圖1 料液比對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of total flavonoids

如圖1所示，當料液比為1∶20～1∶40（g∶mL）時，總黃酮的得率隨料液比的減小而增加；在料液比為1∶40（g∶mL）時，總黃酮的得率達到峰值為6.18%；料液比為1∶40～1∶60（g∶mL）時，總黃酮得率減小。這是因為，隨著料液比的變化，即提取單位質量福白菊中總黃酮所用的溶劑量在增加，福白菊溶劑體系的總黃酮平衡濃度變小，更多總黃酮溶解于溶劑中，得率不斷上升，而隨著料液比的增加，單位時間內，物料溫度降低，細胞結構破壞不夠，從而影響總黃酮得率[19]。因此，最適料液比為1∶40（g∶mL）。

2.1.2 微波功率對總黃酮得率的影響

圖2 微波功率對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids

如圖2所示，隨微波功率在80～240 W增加時，總黃酮的得率隨之增大；微波功率為240 W時，總黃酮的得率達到最高，為6.07%；隨微波功率在240～800 W范圍內增加，總黃酮得率逐漸下降。這是因為隨著微波功率的提高，促使分子進行無規(guī)則運動，使其運動速率增加，隨之物質滲透、擴散和溶解速度加快，溶解的總黃酮的含量增加；但當微波功率＞240 W之后，隨著微波功率的增大，溫度升高，使乙醇的揮發(fā)加快，影響試驗效果；此外微波功率過高，導致提取液乙醇的溫度過高，破壞了黃酮類化合物的結構，從而影響總黃酮的得率[20-21]。因此，最適微波功率為240 W。

2.1.3 微波提取時間對黃酮得率的影響

圖3 微波輔助提取時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of microwave-assisted extraction time on the yield of total flavonoids

如圖3所示，微波提取時間在5～60 s內，總黃酮的得率隨之呈上升趨勢；微波時間為60 s時，總黃酮得率最大，為6.21%；微波提取時間＞60 s之后，總黃酮的得率隨之下降這是由于微波提取時間過長，微波輻射使黃酮降解，從而破壞黃酮類化合物的結構，影響總黃酮得率。此外，提取液的溫度過高，乙醇蒸發(fā)嚴重[22]，導致總黃酮得率下降。因此，最適微波提取時間為60 s。

2.2 提取條件優(yōu)化響應面試驗結果及分析

2.2.1 Box-Behnken試驗設計結果

根據(jù)單因素試驗結果，以料液比（A）、微波功率（B）、微波提取時間（C）為影響因素，得率（Y）為響應值，利用Box-Behnken法設計優(yōu)化試驗，響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 回歸模型的建立與分析[23]

通過Design-Expert分析軟件對表2結果進行回歸擬合分析，得到總黃酮得率對料液比、微波功率、微波時間的二次回歸方程：

響應面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗結果如表3所示。由表3可知，回歸模型中P＜0.000 1，說明回歸模型極顯著，失擬項P=0.465 9＞0.05，說明影響不顯著，該方程合理可行，且決定系數(shù)R2=0.939 2，校正決定系數(shù)R2Adj=0.982 4，表明這個回歸模型可以解釋98.24%的響應值的變化，回歸方程對試驗的擬合性比較好，所以用此模型和方程來探究提取福白菊中總黃酮的最適條件是可行的。交互項BC、二次項B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），二次項A2對結果影響顯著（P＜0.05）。

通過比較F值的大小可得，料液比、微波提取時間、微波功率三者對福白菊總黃酮得率的影響由大到小為微波功率（B）＞料液比（A）＞微波提取時間（C）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應面分析及驗證[24]

料液比、微波功率與微波提取時間3個因素之間的交互作用對麻城福白菊總黃酮得率影響的響應面及等高線如圖4所示。

從圖4a可以看出，三維圖較平緩，說明微波功率和料液比兩個因素對總黃酮得率的影響較為接近，兩因素的交互作用不顯著[25]（P＞0.05）。從圖4b可以看出，三維圖較平緩，說明微波時間和料液比兩個因素的交互作用不顯著（P＞0.05）。從圖4c可以看出，三維圖較陡，且從其等高線圖可以看出，等高線為較扁的橢圓形，說明微波功率和微波時間兩個因素對福白菊總黃酮的得率影響極顯著（P＜0.05）。綜合分析發(fā)現(xiàn)，微波功率和微波時間兩個因素對福白菊總黃酮的得率影響的交互作用最為顯著。

利用軟件Design-Expert 8.0優(yōu)化模型，得到的最佳工藝條件為：微波功率266.44 W、料液比1∶41.36（g∶mL）、微波提取時間58.47 s，總黃酮的得率預測值為7.20%。考慮到實際操作的方便性和可行性，修正提取工藝條件為微波功率240 W、料液比1∶40（g∶mL）、微波提取時間60 s，此條件下進行試驗3次取平均值，得到總黃酮得率實際值為7.18%，與模型預測的理論值相差0.02%，證明該模型預測結果有效可靠。

圖4 微波功率、微波提取時間及料液比交互作用對福白菊中總黃酮得率影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between microwave power,extraction time and material to liquid ratio on total flavonoids yield from Chrysanthemum morifolium

2.3 抗氧化活性試驗結果與分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定結果

圖5 福白菊總黃酮對DPPH自由基清除率測定結果Fig.5 Determination results of DPPH free radical scavenging rate of total flavonoids from Chrysanthemum morifolium

如圖5可知，福白菊中總黃酮在質量濃度0.1～0.5 g/L范圍內，對DPPH自由基有較好的清除能力，且隨總黃酮質量濃度的增大其清除能力逐漸增強，當總黃酮質量濃度為0.5 g/L時，清除率達到最高，為77%。福白菊中總黃酮的DPPH自由基清除率均低于維生素C。

2.3.2 還原能力的測定結果

由圖6可以看出，不同質量濃度的福白菊總黃酮均表現(xiàn)出一定的還原能力，且還原力隨其質量濃度的增大而增強?？傸S酮質量濃度在0.002 g/L、0.006 g/L、0.008 g/L時，其還原能力高于維生素C，而總黃酮質量濃度在0.004 g/L、0.010 g/L時，福白菊中總黃酮的還原能力略低于VC，因此，可以得出結論，福白菊中的總黃酮具有較好的抗氧化能力。

圖6 福白菊總黃酮總還原能力測定結果Fig.6 Determination results of total reduction ability of total flavonoids from Chrysanthemum morifolium

3 結論

以福白菊為原料，福白菊中總黃酮的得率為指標，在單因素的實驗基礎上，利用響應面優(yōu)化分析，得出微波輔助提取福白菊總黃酮的最優(yōu)工藝為微波功率400 W，微波提取時間60 s，料液比1∶40（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，福白菊總黃酮得率為7.31%。本研究優(yōu)化了微波輔助提取福白菊總黃酮的工藝條件，以期為福白菊中總黃酮的研究提供參考數(shù)據(jù)。

體外抗氧化活性研究表明，隨著福白菊總黃酮質量濃度的增大，其對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，在質量濃度為0.50 g/L時最強，為77%；當質量濃度為0.010 g/L時，還原能力最高，表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性。以上結果，為深入開發(fā)福白菊中總黃酮資源，提供了重要的理論依據(jù)。