基于電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析不同品種蘋果酒香氣物質(zhì)

曹有芳，劉 丹，徐俊南，趙 寧，魏新元，樊明濤

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

蘋果是我國具有明顯國際競爭力的農(nóng)產(chǎn)品之一，根據(jù)國家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)測算，2015至2020年期間，我國每年市場約有1 000萬t以上的鮮果剩額，鮮果銷售存在一定的問題[1-2]。由此可見，我國蘋果產(chǎn)量大，蘋果深加工產(chǎn)業(yè)有待發(fā)展。蘋果酒是世界上僅次于葡萄酒的第二大發(fā)酵果酒，其含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)及多酚等活性物質(zhì)，具有軟化血管、降血脂、降血壓、調(diào)節(jié)新陳代謝、抗衰老和抗癌等作用，豐富的營養(yǎng)成分和較高的保健價值，使其受到廣大消費者的喜愛[3-4]。

就目前蘋果酒發(fā)酵技術(shù)的研究深度和發(fā)展程度而言，因蘋果原料和發(fā)酵工藝等不同，直接導(dǎo)致了蘋果酒品質(zhì)的差異性。而目前單純利用感官評定方法評價、鑒別蘋果酒的品質(zhì)往往不夠客觀，因此尋找一種快速、靈敏的檢測方法尤為重要。風(fēng)味特性是影響蘋果酒品質(zhì)的重要因素，分析蘋果酒中的揮發(fā)性香氣成分，可作為鑒別蘋果酒品質(zhì)的一種方法[5]。電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（gas chromatog raphy mass spectrometry，GC-MS）是目前食品風(fēng)味分析的重要研究手段[6]。電子鼻通過對產(chǎn)品風(fēng)味輪廓信息進行綜合分析，已經(jīng)應(yīng)用于白酒、葡萄酒、黃酒及啤酒的品牌區(qū)分[7-8]、風(fēng)味分析[9-10]、香型分析[11-12]、產(chǎn)地辨別[13-14]、品種辨別[15]、酒齡辨別[16-18]、真?zhèn)舞b別[19]以及發(fā)酵過程中的動態(tài)監(jiān)測[20]等方面。GC-MS技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)待測樣品具體風(fēng)味化合物的定性、定量，檢測靈敏度高、操作便捷、結(jié)果準確。而通過GC-MS和電子鼻與多變量數(shù)據(jù)分析區(qū)分鑒別不同品種蘋果酒的研究鮮有報道。

因此，本實驗分別以嘎啦、紅星、瑞雪、瑞陽4種蘋果為原料釀造蘋果酒，采用電子鼻和固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solidphase microextraction-gas chromatography-mass，SPMEGC-MS）技術(shù)相結(jié)合的方法檢測其揮發(fā)性香氣物質(zhì)，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）探索4種蘋果酒香氣特性的差異，并找出4種蘋果酒的特征香氣成分，旨在為蘋果酒種類鑒別、品質(zhì)研究以及瑞陽、瑞雪兩個國審的蘋果新品種的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嘎啦、紅星、瑞雪、瑞陽：陜西白水蘋果試驗站；安琪果酒專用酵母SY：市售；果膠酶Macerozyme R-10（酶活40 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司。

氯化鈉（純度≥99.5%）：四川西隴科學(xué)有限公司；2-辛醇（純度≥98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PEN3型便攜式電子鼻：德國Airsense公司；GCMS-QP 2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；手動固相微萃?。?0/30 μm DVB/CAR/SPME）進樣器：美國Supelco公司；DB-17MS毛細管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：選擇成熟度好，無腐爛變質(zhì)的蘋果，進行清洗、榨汁，將得到的蘋果清汁倒入經(jīng)SO2熏蒸過的發(fā)酵罐，并加入60 mg/L SO2。按50 mg/L的量添加果膠酶室溫酶解12 h后，加入安琪果酒專用酵母SY于20 ℃條件下發(fā)酵7 d，所有蘋果酒的發(fā)酵工藝相同。取發(fā)酵結(jié)束的新鮮酒樣，離心冷凍置-20 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.3.2 電子鼻檢測

表1為PEN3 型電子鼻10個金屬氧化物傳感器的敏感物質(zhì)及其檢測限。準確量取5 mL稀釋了30倍的蘋果酒酒樣置于30 mL樣品瓶中，加蓋密封，室溫富集5 min后進行測試。電子鼻參數(shù)設(shè)置：檢測時間60 s，預(yù)進樣5 s，清洗時間300 s，進樣流量和載氣流速均為300 mL/min[21]。

表1 PEN3電子鼻傳感器陣列及其性能描述Table 1 Sensor arrays and performance specification of electronic nose PEN3

1.3.3 SPME-GC-MS檢測[22]

香氣成分萃?。簻蚀_吸取各酒樣5 mL至15 mL的固相微萃取專用萃取瓶中，添加6 μL質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL的2-辛醇作為內(nèi)標，加入1.5 g NaCl后，密封后于40 ℃下平衡15min，插入已老化的萃取頭萃取30 min。萃取完畢后，迅速取下萃取器，插入氣相色譜儀進樣口于260 ℃條件下解吸3 min。

GC-MS條件：程序升溫至40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min速率升溫至80 ℃，再按10 ℃/min升至250 ℃；進樣口溫度260 ℃，載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；不分流進樣。離子源溫度為230 ℃，掃描范圍是35～400 amu，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV。

香氣物質(zhì)的定性定量方法：根據(jù)檢測出的未知化合物經(jīng)計算機檢索與美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）library、Wileylibrary相匹配，選擇匹配度＞85%的物質(zhì)作為有效香氣成分，結(jié)合文獻中的保留指數(shù)進行香氣物質(zhì)的定性；以2-辛醇為內(nèi)標（質(zhì)量濃度0.45 mg/mL），按內(nèi)標法計算各成分質(zhì)量濃度實現(xiàn)定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行顯著性分析，電子鼻所測數(shù)據(jù)用其自帶的Winmuster 軟件進行主成分分析和線性判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻對不同蘋果酒香氣物質(zhì)的分析

2.1.1 蘋果酒香氣物質(zhì)電子鼻檢測結(jié)合主成分分析

4種蘋果酒揮發(fā)性成分PCA結(jié)果如圖1所示，PCA分析結(jié)果中第一主成分（PC1）占比93.29%，第二主成分（PC2）占比6.21%，這兩個主成分總貢獻率占比99.5%，能充分的代表原始數(shù)據(jù)信息。說明PCA方法適用于不同品種蘋果酒揮發(fā)性成分分析，且這兩個主成分可以代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。此外，每組樣品的測定數(shù)據(jù)均能聚集成團，說明電子鼻數(shù)據(jù)穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。4種蘋果酒樣的香氣成分無交叉區(qū)域，通過比較各組數(shù)據(jù)的橫縱坐標發(fā)現(xiàn)紅星酒和嘎啦酒的兩個主成分差別不大，說明這兩種酒的風(fēng)味比較接近，而瑞雪酒、瑞陽酒的兩個主成分差別較大，說明瑞雪酒、瑞陽酒的風(fēng)味差異較大。

圖1 不同蘋果酒的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of different apple wines

2.1.2 蘋果酒香氣成分電子鼻檢測結(jié)合線性判別分析

與PCA相比，LDA能通過擴大不同類別間數(shù)據(jù)點的距離、縮小同一類別數(shù)據(jù)點的距離，進一步分析電子鼻傳感器響應(yīng)值，獲得更精確的分類[23]，從而更好地揭示樣品間揮發(fā)性物質(zhì)的差異情況[24]。由圖2可以看出，LDA分析結(jié)果中第一主成分占比72.57%，第二主成分占比26.88%，這兩個主成分總貢獻率占比99.45%，很好的反映了樣品的總體信息，且4種蘋果酒樣品簇間距較遠，區(qū)別明顯。從樣品簇之間的分布距離來看，嘎啦酒和紅星酒的距離較為接近，瑞雪酒和瑞陽酒的距離較大，說明嘎啦酒和紅星酒的風(fēng)味差異較小，瑞雪酒、瑞陽酒的風(fēng)味差異較大。LDA與PCA方法的分析結(jié)果一致。

圖2 不同蘋果酒的線性判別分析Fig.2 Linear discriminant analysis of different apple wines

2.2 SPME-GC-MS分析不同蘋果酒的香氣物質(zhì)

電子鼻可以對蘋果酒樣品的整體風(fēng)味進行分析，能直觀地鑒別不同蘋果酒的差異，但不能檢測出蘋果酒香氣物質(zhì)的具體種類和含量[25]。為進一步分析不同品種蘋果酒的香氣物質(zhì)，采用SPME-GC-MS對4種蘋果酒的揮發(fā)性香氣成分進行檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，在嘎啦、紅星、瑞雪、瑞陽4種蘋果酒中共檢測出76種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類11種、酯類43種、醛類7種、酮類3種、酸類7種、萜烯和其他類5種，其中酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)對蘋果酒整體香氣貢獻較大，蘋果酒是以酯香為主并富含醇香的果酒。如表3所示，不同蘋果酒各類揮發(fā)性香氣物質(zhì)的數(shù)量及含量均存在較大差異，嘎啦、紅星、瑞雪、瑞陽4種蘋果酒的香氣數(shù)量分別是66種、43種、45種、47種，總含量分別為7.17 mg/L、7.08 mg/L、6.64 mg/L和7.56 mg/L。

表2 不同蘋果酒中揮發(fā)性香氣成分測定結(jié)果Table 2 Determination results of volatile aroma components in different apple wines

續(xù)表

續(xù)表

表3 不同蘋果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量Table 3 Types and contents of volatile flavor substances in different apple wines

2.2.1 不同蘋果酒中醇類香氣物質(zhì)比較

醇類是形成發(fā)酵酒風(fēng)味的主要物質(zhì)，多為氨基酸或糖類經(jīng)酵母代謝產(chǎn)生[26]。本實驗各酒樣中含量相對較高醇類香氣物質(zhì)有異戊醇、苯乙醇、正己醇、正辛醇。不同品種蘋果酒的醇類物質(zhì)含量顯著不同，且嘎啦酒醇類化合物質(zhì)量濃度最高（2.12 mg/L），紅星酒最低（1.96 mg/L）。4種酒中共檢測出11種醇類物質(zhì)，共有的有6種，分別是正丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、正己醇、正辛醇和苯乙醇。異丁醇和正戊醇分別只在嘎啦酒和瑞陽酒中檢出，說明這兩種酒更具醇香。異戊醇是4種蘋果酒中含量最高的醇類物質(zhì)，它是雜醇油的主要成分，賦予蘋果酒白蘭地香氣和辛辣味[27]。苯乙醇是莽草酸類衍生物，具有一定的殺菌作用和誘人的玫瑰香味[28]。正己醇和正辛醇分別表現(xiàn)出青草味和玫瑰花香、甜草藥味[29]。

2.2.2 不同蘋果酒中酯類香氣物質(zhì)比較

酯類物質(zhì)是蘋果酒中最重要的香氣成分，主要來源于果實和酒精發(fā)酵，富含花香、果香和酒香[30]。嘎啦、紅星、瑞雪、瑞陽4種蘋果酒中共檢測出43種酯，分別檢測出39種、28種、24種、25種，共有成分有18種，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯的含量較高，賦予了蘋果酒水果香、花香、青蘋果香、香蕉味。在本研究中，瑞陽酒酯類物質(zhì)含量（5.05 mg/L）顯著高于紅星酒（4.88 mg/L）、嘎啦酒（4.48 mg/L）和瑞雪酒（4.40 mg/L）中的（P＜0.05），且瑞陽酒中的辛酸乙酯含量也顯著高于其他三種酒的（P＜0.05），具有更濃郁的果香和花香。

2.2.3 不同蘋果酒中醛、酮、酸類香氣物質(zhì)比較

醛酮類物質(zhì)主要來源于發(fā)酵過程中的各類代謝途徑，如糖、氨基酸和脂肪酸代謝等，能夠增加果酒的水果香[31]。4種蘋果酒中共有的醛類物質(zhì)有乙醛、異戊醛和正己醛，賦予了蘋果酒果香、蘋果香、清香和草香。苯乙醛和壬醛僅在嘎啦酒中檢測出，表明嘎啦酒具有更濃郁的甜芳香味、花香和柑橘味。此外，檢測出3種酮類物質(zhì)，分別為1-庚酮、2-辛酮和2-壬酮，三種物質(zhì)在瑞雪酒和瑞陽酒均有檢出，嘎啦酒中檢測出了2-庚酮和2-壬酮，紅星酒中僅檢測出了2-辛酮。

在酒中，酸類物質(zhì)主要來源于酒精發(fā)酵，其含量受發(fā)酵條件、營養(yǎng)物質(zhì)含量和酵母類型影響，酸類物質(zhì)濃度較低時呈奶酪香，較高時則會產(chǎn)生腐臭味，其可與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成酯，提高酒體的協(xié)調(diào)性和平衡性[31-32]。4種蘋果酒中共檢測出7種酸，其中具有愉快脂肪氣味的癸酸在4種酒中均有檢出；瑞雪酒中癸酸含量最高，為272.98 μg/L，紅星酒中癸酸含量最低，為107.75 μg/L。

2.2.4 不同蘋果酒中萜烯及其他物質(zhì)比較

萜烯類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物，多與花香及檸檬香有關(guān)，其香氣閾值較低，即使在濃度較低時對酒體香氣風(fēng)格也有較大貢獻[33]。本實驗共檢測出1,3,5,7-環(huán)辛四烯、d-檸檬烯和香茅醇3種萜烯類物質(zhì)，其中1,3,5,7-環(huán)辛四烯僅在瑞雪酒中檢出，含量為4.97 μg/L，d-檸檬烯僅在嘎啦酒中檢出，含量為11.64 μg/L。4種酒中均檢測出香茅醇，含量在12～15 μg/L之間，香茅醇具有檸檬味、青草味、丁香花香和薔薇香。其他類化合物盡管種類和含量較少，但也有一定的貢獻作用，本實驗在嘎啦酒中檢測出了異丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚，能夠賦予嘎啦酒丁香味和果香味。

2.3 不同蘋果酒特征香氣物質(zhì)的分析

利用已報道的感覺閾值及香氣描述相關(guān)文獻計算香氣物質(zhì)的香氣值[21，34-36]，據(jù)此確定樣品的特征香氣成分。香氣值（odor activity value，OAV）是香氣物質(zhì)濃度與其香氣閾值之比。香氣值≥1的香氣物質(zhì)可被認定為特征香氣成分，香氣值越大，對整體香氣的貢獻也就越大；但香氣值＜1的物質(zhì)也不容忽略，其同樣能夠增加酒體的香氣及協(xié)調(diào)性。如表4所示，本實驗共得到13種特征香氣物質(zhì)，嘎啦、紅星、瑞雪、瑞陽酒分別有11種、8種、7種、7種。4種蘋果酒共有的特征香氣物質(zhì)有6種，包括丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯。李記明等[37]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯及癸酸乙酯是蘋果酒區(qū)別于其他酒的特征香味成分，與本實驗研究結(jié)果一致。庚酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、壬醛僅在嘎啦酒中的OAV值＞1，說明這三種物質(zhì)是嘎啦酒區(qū)別于其他三種酒的特征香氣物質(zhì)。乙酸己酯僅在紅星酒中OAV值＞1，說明紅星酒和其他三種酒相比具有更濃郁的果香。辛酸-3-甲基丁酯僅在瑞陽酒中OAV值＞1，說明瑞陽酒和其他三種酒相比其具有濃郁的梨香。

表4 不同蘋果酒特征香氣成分的香氣值Table 4 Odor activity value of characteristic aroma of different apple wines

3 結(jié)論

蘋果酒含有豐富的香氣物質(zhì)，且不同品種的蘋果酒香氣特性差異較大。電子鼻技術(shù)結(jié)合PCA和LDA方法，能夠很好地區(qū)分陜西白水嘎啦、紅星、瑞雪和瑞陽4個品種的蘋果酒。采用SPME-GC-MS對4種蘋果酒中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行分析檢測，共檢測出76種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括醇類11種、酯類43種、醛類7種、酮類3種、酸類7種、萜烯和其他5種，香氣物質(zhì)總量從高到低依次為瑞陽酒、嘎啦酒、紅星酒和瑞雪酒。通過計算香氣值得出丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯為4種蘋果酒共有的特征香氣物質(zhì)。通過電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜兩種技術(shù)的結(jié)合，從宏觀和微觀上研究蘋果酒的香氣物質(zhì)，可為不同蘋果酒的快速鑒別、釀造原料的選擇及香氣特性的綜合評價提供參考。