響應面法優(yōu)化紅曲霉高產(chǎn)酯化酶發(fā)酵工藝

郭晉田，荊 旭，張 麗，暢盼盼，韓 英，蔡逸安，甄曉君，賈麗艷，3*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030801；3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032209；4.山西圣堂食品科技有限公司，山西 潞城 047500）

酯類物質是我國白酒及食醋等發(fā)酵類產(chǎn)品中重要的風味物質，如清香型白酒中的乙酸乙酯和乳酸乙酯[1]，濃香型白酒中的己酸乙酯[2]等，這些物質的含量及在風味物質中所占比例影響著白酒的風格[3]。而酯類物質在發(fā)酵食品中的重要來源之一是由有機酸和醇類物質在酯化酶的催化作用下合成的[4]。為此，酯化酶的有無、酶活力的大小及對不同底物種類的催化能力，影響著發(fā)酵產(chǎn)物中的酯類物質的種類、含量[5-6]。獲得高產(chǎn)酯化酶的菌株并應用于傳統(tǒng)白酒、食醋釀造食品中，對于提升該類產(chǎn)品的品質具有重要意義[7-8]。張磊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉可以產(chǎn)生酯化酶，可應用于白酒生產(chǎn)用大曲、窖泥、糟醅中，以提升白酒的酯類含量，改善白酒風味、縮短發(fā)酵周期、提升酒質。此外，有研究報道紅曲霉不僅可產(chǎn)生酯化酶[10]，還可以產(chǎn)生多種胞外酶，如蛋白酶[11]、糖化酶、液化酶[12]，且具有耐高溫[13]、耐酸、耐酒精[14]等特性，具有應用前景。本課題組前期以山西酒醅為研究對象，分離篩選獲得了一株高產(chǎn)酯化酶且具有上述生物學特征的菌株Hm。本試驗在此基礎上以紅曲霉Hm為研究對象，小米為固態(tài)發(fā)酵基質，酯化力為測定指標，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗篩選顯著因子，運用響應面Box-Benhnken試驗設計建立數(shù)學模型，優(yōu)化工藝條件，為該菌株在白酒、食醋及其他傳統(tǒng)釀造類產(chǎn)品中的應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和原料

紅曲霉（Monascus purpureus）Hm：分離自山西某清香型白酒廠新鮮酒醅中。小米：市售。

1.1.2 試劑

己酸、硫酸（分析純）：成都科龍化工試劑廠；無水乙醇（分析純）：天津市化學試劑三廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市大陸化學試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：10%發(fā)酵專用麥芽浸粉，2%瓊脂。

小米固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：將蒸熟的小米45 g裝入250 mL的錐形瓶中，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

pHSJ-4A pH計：美國奧立龍公司；85-2A磁力攪拌器：精鑿科技（上海）有限公司；DL-1萬用電爐：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BS2010S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分析檢測

酯化力、糖化力及液化力采用QB/T 5188—2017《釀造紅曲》規(guī)定的方法測定[15]。

酯化力單位定義為1 g樣品在35 ℃，經(jīng)過7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)（U/g）。

糖化力單位定義為1 g樣品于35 ℃、pH4.6條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖（U/g）。

液化力單位定義為1 g樣品在35 ℃、pH4.6條件下，1 h能液化淀粉的克數(shù)（U/g）。

1.3.2 孢子菌懸液的制備

將紅曲霉Hm接種于麥芽汁培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d后，加入無菌水，使用移液槍反復吸打，將得到的孢子懸液置于無菌有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，使用渦旋攪拌器至孢子充分打散，利用血球計數(shù)板將孢子懸液稀釋至1×107個孢子/mL[16]。

1.3.3 單因素試驗

以酯化力為評價指標，研究接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始pH、水分含量對紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的影響。

將紅曲霉Hm孢子懸液，分別以不同接種量（6%、8%、10%、12%、14%）接入不同初始pH值（4、5、6、7、8）、水分含量（55%、60%、65%、70%、75%）的小米固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在不同發(fā)酵溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）條件下培養(yǎng)不同時間（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d），測定其酯化力，研究接種量對紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的影響。

1.3.4 Plackett-Burman（PB）法篩選試驗

在單因素試驗的基礎上，對影響紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的5個因子（接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始pH值、水分含量）進行PB試驗篩選因子，試驗設計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests

1.3.5 運用響應面法優(yōu)化紅曲霉高產(chǎn)酯化酶發(fā)酵工藝條件

根據(jù)PB試驗篩選的顯著因子的影響順序，確定發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、水分含量（C）為主要的3個影響因子，以這3個影響因子為變量，酯化力（Y）為響應值，設計3因素3水平的響應面試驗（見表2），確定紅曲霉高產(chǎn)酯化酶發(fā)酵最優(yōu)工藝條件。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種量對紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的影響

圖1 接種量對酯化力的影響Fig.1 Effect of inoculum on esterification power

由圖1可知，隨著接種量的增加，酯化力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當接種量為10%時，酯化力最高可達到（14.61±0.10）U/g；造成以上現(xiàn)象的原因，可能是由于當接種量為6%～8%時，紅曲霉Hm菌體數(shù)量較少，代謝緩慢，產(chǎn)生的酯化酶含量低，使得酯化力較低；當接種量為12%～14%時，大量的孢子萌發(fā)，快速消耗了培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，降低了紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶的能力[17]。因此，選擇適宜的接種量為10%。

2.1.2 發(fā)酵溫度對紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的影響

圖2 發(fā)酵溫度對酯化力的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on esterification power

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酯化力呈現(xiàn)快速上升后緩慢降低的趨勢。在30 ℃時，酯化力最高可達到（14.65±0.07）U/g。以上結果表明，隨著溫度的升高，紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力逐漸升高；當溫度高于30 ℃時，較高的溫度會使紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力降低[18]。因此，選擇適宜的發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時間對紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的影響

圖3 發(fā)酵時間對酯化力的影響Fig.3 Effect of fermentation time on esterification power

由圖3可知，發(fā)酵初期，酯化力快速上升；發(fā)酵7 d時，酯化力最高可達到（14.53±0.07）U/g；7 d后，酯化力呈現(xiàn)大幅度降低的趨勢。以上結果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶的能力逐漸升高，發(fā)酵7 d后，產(chǎn)酯化酶能力降低，推測造成以上現(xiàn)象的原因是，發(fā)酵前期紅曲霉Hm處于對數(shù)生長期，生長代謝旺盛，產(chǎn)生酯化酶的能力強；當發(fā)酵7 d后，生產(chǎn)代謝變緩，產(chǎn)生酯化酶能力降低，產(chǎn)生的酯化酶由于受發(fā)酵體系中代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的影響，活力受到影響，使得酯化力大幅度降低[19]。因此，選擇發(fā)酵時間為7 d。

2.1.4 初始pH對紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的影響

由圖4可知，隨著初始pH的升高，酯化力呈現(xiàn)快速上升后大幅度降低的趨勢。酸性條件下，隨著pH的逐漸升高，紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶的能力逐漸提高。在初始pH為6時，酯化力最高可達到（14.75±0.08）U/g。以上結果表明，紅曲霉Hm在偏酸性的條件下酯化酶的能力較強。因此，選擇產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為6。

圖4 初始pH對酯化力的影響Fig.4 Effect of initial pH on esterification power

2.1.5 水分含量對紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶能力的影響

圖5 水分含量對酯化力的影響Fig.5 Effect of water content on esterification power

由圖5可知，隨著水分含量的逐漸升高，紅曲霉Hm酶制劑的的酯化力逐漸下降，當水分含量達到60%時，酯化力最高達到（14.59±0.07）U/g。當高于60%時，酯化力逐漸降低。以上結果表明，水分含量對于Hm產(chǎn)酯化酶的能力影響較大，造成以上現(xiàn)象的原因，可能是因為當水分含量低于60%時，小米固態(tài)培養(yǎng)基水分不足，造成紅曲霉Hm生長緩慢[20]；當水分含量達到60%時，小米固態(tài)培養(yǎng)基小米顆粒飽滿，水分充足，紅曲霉Hm生長良好；當水分含量達到65%～75%時，小米固態(tài)培養(yǎng)基出現(xiàn)結塊現(xiàn)象，不利于紅曲霉的有氧呼吸，影響該菌株產(chǎn)生酯化酶的能力。因此，選擇培養(yǎng)基含水量為60%。

2.2 Plackett-Burman（PB）法篩選試驗

在單因素的基礎上，利用PB試驗對接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始pH、水分含量5個因素進行顯著因子的篩選，分組為12組。PB試驗設計見表3。

根據(jù)試驗設計結果得到方程：Y=11.850 0+2.083 3A+0.056 7B-0.163 3C-0.303 3D-0.016 7E。再經(jīng)過Minitab17軟件進行方差分析得知，R=99.85%，在研究的整體回歸區(qū)域內(nèi)，該模型的擬合性較好，試驗結果準確。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman tests

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman tests

由表4可知，P（A/發(fā)酵時間）=0.000，P（C/發(fā)酵溫度）=0.002，P（D/水分含量）=0.000，其P值均小于0.05。即選擇顯著因素發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、水分含量進行下一步的響應面優(yōu)化試驗設計。

2.3 響應面法工藝優(yōu)化結果

2.3.1 響應面法工藝優(yōu)化結果及方差分析

響應面軟件分析得知，發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、水分含量（C）對酯化力的影響回歸擬合后得到二次多項回歸模型，Y=14.70+0.82A+0.10B-0.52C+0.81AB+0.63AC+1.45BC-3.16A2-2.58B2-4.98C2，模型回歸系數(shù)R2=99.71%，調(diào)整后R2=99.35%，由此可知，此項回歸擬合度較好，引起響應值酯化力變化的原因有99.71%的可能性是因為發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、水分含量3個因素的變化，由表6可知，整體模型P＜0.01，代表極顯著，表明該二次方程模型達到極顯著，失擬項P=0.051 5＞0.05，表明方程失擬不顯著。說明該方程對試驗擬合性較好，模型能夠真實的試驗數(shù)據(jù)。

由表6可知，發(fā)酵時間二次項、發(fā)酵溫度二次項、水分含量二次項、交互項BC對酯化力的影響均達到極顯著水平（P＜0.01），這4種均對酯化力為負效應，表明發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、水分含量是最終測定酯化力的3個關鍵控制點因素；發(fā)酵時間一次項、水分含量一次項、交互項AB、交互項AC對酯化力的影響均達到顯著水平（P＜0.05），發(fā)酵時間A、AB、AC對酯化力均為正效應，水分含量C對酯化力為負效應。

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Design and results of response surface tests

表6 響應面試驗結果方差分析Table 6 Results and variance analysis of response surface tests

根據(jù)響應面軟件分析可得出發(fā)酵最佳工藝條件為發(fā)酵時間為7 d，發(fā)酵溫度為30 ℃，水分含量為60%，在此條件下酯化力預測值為14.76 U/g。

2.3.2 響應面結果及其等高線分析

圖6 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和水分含量交互作用對酯化力影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and water content on esterification power

由圖6可知，AB、AC、BC都有明顯的交互作用，特別是BC交互作用較顯著，響應面曲線走勢較陡，有明顯的最高點和最優(yōu)水平。

2.4 響應面驗證試驗

根據(jù)響應面軟件分析可得出最佳工藝條件為發(fā)酵時間為7 d，發(fā)酵溫度為30 ℃，水分含量為60%，以此為條件做3個平行試驗得到酯化力實際值為（14.75±0.08）U/g，與預測值14.76 U/g相比基本保持一致，即響應面試驗具有現(xiàn)實可靠的意義。

2.5 紅曲霉Hm的酶活力

將紅曲霉Hm以10%的接種量接種到水分含量為60%，pH6的小米固態(tài)發(fā)酵基質中，30 ℃發(fā)酵7 d。由表7可知，紅曲霉Hm的酯化酶活力為（14.75±0.08）U/g，高于清香型白酒生產(chǎn)用大曲的酯化酶活力，表明紅曲霉Hm可以高產(chǎn)酯化酶強化發(fā)酵應用于白酒的生產(chǎn)。

表7 清香型白酒生產(chǎn)用大曲與紅曲霉Hm酶活力的比較Table 7 Comparison of enzyme activities between Daqu for the production of Fen-flavor Baijiu and Monascus Hm

3 結論

本試驗以紅曲霉Hm為研究對象，酯化力為測定指標，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、Box-Benhnken試驗優(yōu)化紅曲霉高產(chǎn)酯化酶發(fā)酵工藝。最佳工藝條件為發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量10%、初始pH值為6、水分含量60%。以此條件生產(chǎn)紅曲霉Hm的酯化力為（14.75±0.08）U/g，糖化力為（480±42.43）U/g，液化力為（22.4±0.62）U/g。該紅曲霉Hm產(chǎn)酯化酶活力較高，且具有糖化和液化酶活力，可應用于白酒、食醋及其他傳統(tǒng)性釀造產(chǎn)品的生產(chǎn)中。