余 俊,賈 靜,曾 宇,張婧怡,韋麗杰,王少帥,馮 玲
(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖北 武漢 430030)
妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指孕婦既往無明確糖尿病病史,在妊娠期間首次發(fā)生的糖代謝障礙,是妊娠期常見的并發(fā)癥。全世界約15%的孕婦會合并糖尿病,其中87.5%是GDM[1]。GDM給母胎和新生兒帶來了嚴重的不良影響,不僅增加了孕婦子癇前期、自身代謝紊亂、剖宮產(chǎn)的發(fā)生率,還增加了流產(chǎn)、早產(chǎn)、難產(chǎn)、巨大兒、胎兒宮內(nèi)窘迫/死亡、新生兒窒息、新生兒肺發(fā)育不成熟、新生兒死亡、新生兒低血糖癥等風險,其中新生兒肺發(fā)育不成熟是導致新生兒窒息甚至死亡的主要原因之一[2]。大多數(shù)患有GDM的婦女在分娩后可恢復正常的糖代謝,但在以后的生活中患糖尿病的風險增加[3]。因此,GDM被認為是糖尿病前期狀態(tài),兩者的病理學改變明顯相關(guān)。近年來的研究表明,脂代謝異常能通過介導氧化應(yīng)激等信號轉(zhuǎn)導通路廣泛參與肥胖、2型糖尿病等一系列代謝相關(guān)性疾病的病理生理過程[4]。然而,關(guān)于氧化應(yīng)激參與GDM的機制尚不明朗。炎癥是氧化應(yīng)激的一種表現(xiàn),氧化應(yīng)激可誘發(fā)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì),如腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。TNF-α擁有較強的生物學活性,作用于眾多疾病的炎癥反應(yīng)中。TNF-α主要分布在血管內(nèi)皮細胞,可直接影響胰島細胞,造成胰島素抵抗,并最終導致糖尿病的發(fā)生[5]。8-異前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)是異前列腺素中性質(zhì)最穩(wěn)定和含量最多的一種代謝產(chǎn)物,能夠準確、穩(wěn)定地反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)受自由基誘導后過氧化程度[6]。2型糖尿病患者循環(huán)和尿中的8-iso-PGF2α濃度升高[6-7]。此外,有研究顯示8-iso-PGF2α與胎兒生長受限、胎死宮內(nèi)、胎盤早剝、低出生體重、絨毛膜羊膜炎等相關(guān)[8]。通過對這些因子的特性探討,對預測及干預GDM具有潛在的重要意義。
本研究擬通過測定GDM患者及正常孕婦中TNF-α、8-iso-PGF2α的水平差異,探討氧化應(yīng)激與GDM發(fā)病機制的相關(guān)性,為GDM患者進行孕期抗氧化治療提供依據(jù);同時探討孕早期檢測血清TNF-α和8-iso-PGF2α濃度,以預測GDM發(fā)生的可行性。
選取2016年11月至2017年11月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院正規(guī)產(chǎn)檢和手術(shù)分娩的孕婦作為研究對象,排除糖尿病、高血壓病、慢性肝腎疾病及甲狀腺等內(nèi)分泌疾病。對孕11~13周經(jīng)超聲確認正常單胎妊娠孕婦263例,于孕24~28周行75g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT),依據(jù)GDM診斷標準[9]納入GDM患者為GDM組,同期非GDM孕婦為對照組。所有研究對象均簽署知情同意書,并取得醫(yī)院倫理委員會的批準。
根據(jù)OGTT結(jié)果將研究對象分組后,收集研究對象不同孕期的血清樣本。將兩組研究對象根據(jù)孕周分為三期:A組(孕11~13+6周)、B組(孕24~29+6周)、C組(孕37~40+6周)。足月后,于本院分娩的研究對象在胎兒娩出后采集臍血。最終納入25例GDM患者為GDM組,同期25例非GDM患者為對照組。
本研究依據(jù)謝幸主編《婦產(chǎn)科學》:孕24~28周75g OGTT,空腹血糖≥5.1mmol/L,OGTT 1h血糖≥10.0mmol/L,OGTT 2h血糖≥8.5mmol/L,上述血糖之一超標即診斷GDM。
在早孕期測量孕婦身高(m)和體重(kg),計算身體質(zhì)量指數(shù)(BMI),BMI=體重/身高2。所有入組孕婦每次空腹采集靜脈血2mL,分娩時抽取臍靜脈血3mL。所有血液標本緩慢貼壁注入含有肝素鈉的抗凝管中,室溫靜置30min,3 000rpm離心10min后吸取上層血清,存于-80℃冰箱待檢。
采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定孕婦外周血和臍血血清中TNF-α和8-iso-PGF2α水平。試劑盒包括純化的羊抗兔IgG抗體包被的微孔板、兔抗人TNF-α或8-iso-PGF2α抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗及相關(guān)試劑組成。在酶標儀上進行定量檢測。
檢測前1h把試劑盒和待測樣品從-80℃冰箱內(nèi)取出,放在室溫下復溫。將標準品倍比稀釋,將樣品稀釋液作為標準濃度0g/mL。在酶聯(lián)板上依次設(shè)定空白孔、標準孔和樣品孔??瞻卓滋砑?0μL樣品稀釋液,余孔依次加入50μL各濃度的倍比稀釋標準品或待測樣品。使用蓋板膜覆蓋酶標板,室溫下置于搖床上反應(yīng)。3h后棄去孔內(nèi)液體并甩干,每孔加入檢測工作液,放入37℃溫箱內(nèi)反應(yīng)1h。棄去孔內(nèi)液體,并洗滌3次。依次給每個孔添加200μL底物溶液,37℃避光顯色45min后終止反應(yīng)。使用酶標儀在405nm波長檢測各孔OD值。利用標準品制作標準曲線,再根據(jù)標準曲線計算各樣品OD值的對應(yīng)濃度。
GDM組與對照組的年齡、孕前BMI、孕產(chǎn)次比較均無顯著性差異(均P>0.05),見表1。
表1 孕婦的一般情況Table 1 General information of all pregnant
2.2.1對照組各孕期血清TNF-α和8-iso-PGF2α水平的比較
對照組各孕期血清TNF-α水平分別為:A組(11.76±2.94)μg/mL,B組(19.10±4.78)μg/mL,C組(20.94±4.06)μg/mL,孕中期(B組)顯著高于孕早期(A組)(t=6.544,P<0.001),孕中期(B組)與孕晚期(C組)比較無顯著性差異(t=1.466,P=0.149)。
對照組各孕期血清8-iso-PGF2α水平分別為:A組(114.25±14.72)pg/mL,B組(107.38±27.06)pg/mL,C組(118.66±7.73)pg/mL,孕早期(A組)與孕中期(B組)比較無顯著性差異(t=1.115,P=0.270),孕中期(B組)與孕晚期(C組)比較無顯著性差異(t=2.004,P=0.051)。
2.2.2 GDM組各孕期血清TNF-α和8-iso-PGF2α水平的比較
患者在確診GDM前血清TNF-α、8-iso-PGF2α水平已升高,并隨著妊娠進展逐漸增加。
GDM組各孕期血清TNF-α水平分別為:A組(16.87±2.33)μg/mL,B組(21.67±3.30)μg/mL,C組(25.83±2.88)μg/mL,孕中期(B組)顯著高于孕早期(A組)(t=5.937,P<0.001),孕晚期(C組)顯著高于孕中期(B組)(t=4.746,P<0.001)。
GDM組各孕期血清8-iso-PGF2α水平分別為:A組(121.63±11.25)pg/mL,B組(150.91±30.89)pg/mL,C組(268.50±25.21)pg/mL,孕中期(B組)顯著高于孕早期(A組)(t=4.454,P<0.001),孕晚期(C組)顯著高于孕中期(B組)(t=14.747,P<0.001)。
2.2.3 GDM組與對照組各孕期血清TNF-α、8-iso-PGF2α水平的比較
GDM組各孕期血清TNF-α水平均顯著高于對照組(A組:t=6.820,P<0.001,B組:t=2.212,P=0.032,C組:t=4.910,P<0.001),見圖1;GDM組各孕期血清8-iso-PGF2α水平也均高于對照組,在孕中期(B組)和孕晚期(C組)均有顯著性差異(B組:t=5.301,P<0.001,C組:t=28.414,P<0.001),而在孕早期(A組)無顯著性差異(A組:t=1.992,P=0.052),見圖2。
注:*P<0.05。
圖1孕婦外周血TNF-α檢測對比結(jié)果
Fig.1 Comparison of detection result of TNF-α in peripheral blood of pregnant women between the two groups
注:*P<0.05。
圖2孕婦外周血8-iso-PGF2α檢測對比結(jié)果
Fig.2 Comparison of detection result of 8-iso-PGF2α in peripheral blood of pregnant women between the two groups
GDM組臍血TNF-α、8-iso-PGF2α水平均高于對照組,經(jīng)比較均有顯著性差異(均P<0.05),見表2。
表2 對照組與GDM組臍血TNF-α和8-iso-PGF2α水平的比較結(jié)果Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α and 8-iso-PGF2α in umbilical cord blood of the newborns between the control group and GDM
GDM是常見的妊娠期并發(fā)癥,一直以來受到國內(nèi)外醫(yī)學研究者的廣泛關(guān)注。GDM在不同程度上影響孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的健康,其影響程度與患者的血糖控制情況有著密切的關(guān)系。GDM會加大婦女自然流產(chǎn)、早產(chǎn)發(fā)生率,并發(fā)高血壓的概率是健康孕婦的3~5倍。GDM婦女在分娩后10年內(nèi)有20%~70%的概率會發(fā)展成2型糖尿病患者[3]。糖尿病的病理機制復雜,β細胞功能紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌功能異常、脂代謝異常等均參與GDM的病理發(fā)展[10-11]。目前對于GDM的治療手段有限,僅飲食干預和胰島素被廣泛接受。然而,由于胰島素抵抗的存在,治療效果往往不理想。所以,深入分析GDM發(fā)病原因、機理及其治療對策對降低妊娠并發(fā)癥、新生兒患病率等方面具有重要意義。
脂肪組織作為一種重要的內(nèi)分泌器官,既保證了能量的安全分配,又積極分泌循環(huán)因子,包括脂肪因子(如瘦素、脂聯(lián)素等)和細胞因子[如TNF-α、白介素(IL)-6和IL-1β)],具有廣泛的代謝作用,并在GDM病理機制中扮演了重要的角色[4]。本研究通過檢測GDM孕婦血清及臍血中的TNF-α和8-iso-PGF2α進一步證實脂代謝與GDM患者發(fā)病機制密切相關(guān)。
TNF-α是一種重要的脂肪源性促炎介質(zhì),是參與炎癥、肥胖和胰島素抵抗相關(guān)的主要炎性脂肪因子。TNF-α與糖代謝及脂代謝密切相關(guān),并且在胰島素信號轉(zhuǎn)導、葡萄糖轉(zhuǎn)運和外周組織胰島素抵抗等方面發(fā)揮重要作用。有研究報道TNF-α與孕前BMI呈正相關(guān)[12]。TNF-α通過降低過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)的mRNA表達來減少其產(chǎn)生,而PPAR-γ具有抗炎和促凋亡的作用,同時可減少體內(nèi)游離脂肪酸的生成,進而減少體內(nèi)胰島素抵抗,調(diào)節(jié)血糖平衡。TNF-α不但減少了PPAR-γ的產(chǎn)生,還減少脂肪細胞分化和脂聯(lián)素表達,通過多種途徑引起糖代謝失衡[13]。T細胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(Tim-3)可以通過活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-kB)/TNF-α通路加重糖尿病腎病,TNF-α還可誘導肝細胞凋亡[14-16]。肺損傷最早出現(xiàn)的異常之一是炎癥細胞因子水平的升高,其中,TNF-α起著關(guān)鍵作用,對上皮細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生細胞毒性,從而加重水腫[17]。本研究顯示,GDM孕婦外周血和臍血中的TNF-α均高于對照組,并且隨著妊娠進程持續(xù)升高,提示GDM孕婦及胎兒均存在脂質(zhì)過氧化。TNF-α在GDM的發(fā)病機制及子代的肺發(fā)育不良中可能起到重要作用。
8-iso-PGF2α是評價氧化應(yīng)激的理想指標,8-iso-PGF2α與氧化應(yīng)激造成的損傷關(guān)系極為密切,可以很好地反映機體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。相關(guān)研究報道,機體氧化應(yīng)激失衡在高血壓、糖尿病等血管病變中發(fā)揮著重要作用,8-iso-PGF2α水平成為國內(nèi)外研究人體脂質(zhì)過氧化的重點內(nèi)容,也是異前列腺素中含量最多、最穩(wěn)定的一種形式,可以正確反映人體的氧化應(yīng)激及自由基誘導之后過氧化情況[6]。8-isoPGF2α是一種具有生物學活性的前列腺素樣物質(zhì),這是細胞生物膜經(jīng)過氧自由基過氧化作用之后的特異性產(chǎn)物,該指標能準確反映缺氧缺血再灌注患者的脂質(zhì)過氧化作用[7]。8-iso-PGF2α的生成不依賴環(huán)氧化酶(COX),是氧自由基損害脂質(zhì)細胞膜多不飽和脂肪酸(花生四烯酸)后的產(chǎn)物,其在體內(nèi)的表達水平不會因使用阿司匹林等非甾體消炎藥影響COX而發(fā)生改變。因此,8-iso-PGF2α是臨床判斷人體自由基氧化程度及其抗氧化療效最佳的生化指標。有研究表明孕婦的外周血8-iso-PGF2α水平上升與病癥的嚴重 程度呈正相關(guān)[8]。檢查8-iso-PGF2α水平無需過于貴重的儀器,檢測費用不高,檢測結(jié)果具有敏感性、準確性、特異性均較高的特點[18-19]。8-iso-PGF2α水平升高會增加自閉癥的風險[19-20]。有文獻報道8-iso-PGF2α與呼吸系統(tǒng)疾病也密切相關(guān)[21]。本研究顯示,對照組孕婦血清8-iso-PGF2α水平在妊娠期間保持穩(wěn)定。GDM患者8-iso-PGF2α顯著升高,并且隨著妊娠進程持續(xù)升高。孕中期確診GDM的孕婦在妊娠早期體內(nèi)可能已存在脂質(zhì)過氧化損傷,提示氧化應(yīng)激與GDM的發(fā)病相關(guān),可能是GDM的發(fā)病機制之一。
妊娠早期測定TNF-α和8-iso-PGF2α水平可能預測GDM的發(fā)生,可早期采取干預措施預防GDM的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示GDM組患者不僅血清TNF-α和8-iso-PGF2α水平較對照組升高,臍血中的表達水平也較對照組升高。有研究報道臍血中的8-iso-PGF2α水平與孕婦血清水平呈正相關(guān)[22]。因此,通過檢測孕婦血清中TNF-α和8-iso-PGF2α水平,有可能幫助早期預測新生兒體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷。通過早期檢測孕婦外周血TNF-α和8-iso-PGF2α水平,預測GDM的發(fā)生,根據(jù)檢測結(jié)果選擇性開展抗氧化治療,可能有利于減少GDM的發(fā)生,或減輕GDM對母親、胎兒及新生兒的不良影響。
綜上所述,GDM孕婦血清TNF-α、8-iso-PGF2α顯著高于正常妊娠孕婦,且TNF-α、8-iso-PGF2α隨著GDM患者妊娠進程持續(xù)升高,因此TNF-α、8-iso-PGF2α可以作為GDM檢測診斷的重要指標。