昌黎產(chǎn)區(qū)產(chǎn)酶酵母多樣性及其應(yīng)用潛力分析

何曼，劉暢，朱鳳妹，葛超，李軍，閻賀靜

(河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 昌黎,066600)

為避免非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae, NSC)的不利影響，目前葡萄酒釀造多使用活性干酵母(Saccharomycescerevisiae，SC)作發(fā)酵劑。近年來，隨著對NSC研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)許多NSC對葡萄酒的風(fēng)味和感官具有積極作用，一些非NSC可作為發(fā)酵啟動菌用于葡萄酒的釀造[1-5]。優(yōu)選NSC與SC混菌發(fā)酵，可增加酒中甘油的含量，同時引起其他重要風(fēng)味物質(zhì)種類和含量的顯著變化[3,6-7]。因此，選擇適宜的NSC和SC混合發(fā)酵是改善葡萄酒品質(zhì)和風(fēng)味的有效途徑[8-9]。研究證實，除代謝生成甘油、高級醇和酯等各種風(fēng)味物質(zhì)外，NSC影響葡萄酒結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的另一個重要因素是能夠產(chǎn)生豐富的胞外酶，這些酶作用于葡萄汁中相關(guān)底物對葡萄酒的組分和風(fēng)味產(chǎn)生重要影響[9-11]。目前，葡萄酒釀造中廣泛使用外源果膠酶以提高過濾通透性，同時利于香氣物質(zhì)和色素的提取[12]。β-葡萄糖苷酶在葡萄酒增香領(lǐng)域的重要作用也已經(jīng)被許多研究所證明，但黑曲酶來源的糖苷酶專一性較差，作用于色素糖苷具有產(chǎn)生不良氣味的風(fēng)險[13-14]。同時，外源糖苷酶釀造環(huán)境耐性低，使用量大，釀造成本高。因此，產(chǎn)酶酵母在釀酒工業(yè)具有重要的釀造學(xué)意義。

目前，對產(chǎn)酶酵母的研究主要集中于產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母的開發(fā)利用。對葡萄酒產(chǎn)區(qū)產(chǎn)酶酵母的多樣性、產(chǎn)酶種類及開發(fā)利用等相關(guān)研究報道較少。昌黎產(chǎn)區(qū)是我國著名的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，酵母資源豐富，已有研究者對昌黎產(chǎn)區(qū)酵母多樣性進行了研究[15]，但對該產(chǎn)區(qū)產(chǎn)酶酵母的研究和開發(fā)利用的報道還較少。本研究對昌黎產(chǎn)區(qū)4個不同地理位置的土壤樣品產(chǎn)酶酵母多樣性和應(yīng)用潛力進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采自于河北省秦皇島市昌黎產(chǎn)區(qū)嘉泰酒莊、耿氏酒堡、果樹研究所和瑪?shù)倌峋魄f的葡萄園，采用5點取樣法取樣，最后進行混合，用封口袋包裝好置于-20 ℃下保藏備用。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

活性干酵母為英納蒂斯紅佳釀(菌種為Saccharomycescerevisiae)；對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(pNPG)和果膠均購自Sigam公司，其他試劑均為分析純。

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-25pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母分離和計數(shù)培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，自然pH，固體培養(yǎng)基加入20的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

賴氨酸培養(yǎng)基(g/L)：賴氨酸5.6，葡萄糖10，KH2PO40.85，MgSO40.5，瓊脂20。

WL培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉4，蛋白胨5，葡萄糖50，瓊脂20；儲液A：KH2PO45.5 g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，121 ℃滅菌20 min后4 ℃保存，用時按40 mL/L添加。儲液B：FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min后4 ℃保存，用時按1 mL/L添加。儲液C：0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL無菌水和10 mL 95%酒精中，用時按1 mL/L添加。

β-葡萄糖苷酶篩選培養(yǎng)基、淀粉酶篩選培養(yǎng)基的配制參照文獻[11]。

果膠酶篩選培養(yǎng)基、纖維素酶篩選培養(yǎng)基的配制參照文文獻[16]。

模擬葡萄汁培養(yǎng)基的配制參照文獻[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品中產(chǎn)酶酵母的分離和初步鑒定方法

將0.5 g土壤樣品加入含玻璃珠的49.5 mL無菌水中，振蕩30 min后靜置，梯度稀釋后取適當(dāng)稀釋度的樣品0.1 μL，涂布于含氯霉素的YPD固體培養(yǎng)基(每組3個平行)，28 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。將單菌落分別轉(zhuǎn)接至賴氨酸培養(yǎng)基、產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基和WL培養(yǎng)基，28 ℃下分別培養(yǎng)48 h，可在賴氨酸培養(yǎng)基上生長的酵母為NSC，相反則為SC；轉(zhuǎn)接至產(chǎn)β-葡萄糖苷酶篩選培養(yǎng)基的酵母，噴灑Na2CO3后產(chǎn)黃色光圈的菌落為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母；轉(zhuǎn)接至產(chǎn)果膠酶篩選培養(yǎng)基中的酵母，有透明圈的菌落為產(chǎn)果膠酶的酵母菌；轉(zhuǎn)接至產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基的酵母，噴灑碘液后觀察5 min，出現(xiàn)透明圈的菌落為產(chǎn)淀粉酶的酵母菌；轉(zhuǎn)接至產(chǎn)纖維素酶的篩選培養(yǎng)基中的酵母，有透明圈的菌落為產(chǎn)纖維素酶的酵母。將所有分離的單菌落，轉(zhuǎn)接至WL培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)120 h，觀察菌落形態(tài)、大小和顏色，參照文獻報道，對其進行初步鑒定[18-19]。

1.2.2 產(chǎn)酶酵母釀造因子耐受性分析

將保存的酵母菌接入新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h進行活化?；罨蟀凑?06CFU/mL的接種量接入以下不同的YPD培養(yǎng)基中，以不接種酵母的空白YPD培養(yǎng)基為對照，28 ℃培養(yǎng)48 h后，測定600 nm處吸光度，考察酵母菌的釀造因子耐受性。初始糖質(zhì)量濃度為200、300、400、500 g/L的培養(yǎng)基，考察酵母的糖耐受性；SO2初始質(zhì)量濃度為50、100、150、200 mg/L(SO2的濃度以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的的H2SO3調(diào)整)的培養(yǎng)基，考察酵母的SO2耐受性；無水乙醇初始體積分?jǐn)?shù)為9%、12%、15%、18%的培養(yǎng)基，考察酵母的酒精耐受性；檸檬酸初始質(zhì)量濃度為1(pH 4.0)、5(pH 3.5)、10(pH 3.0)、20 g/L(pH 2.5)，考察酵母菌的酸耐受性；不同酵母菌接入YPD培養(yǎng)基，分別在15、20、25、30 ℃培養(yǎng)48 h，考察酵母的溫度耐受性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中圖由origin軟件生成。

2 結(jié)果與討論

2.1 昌黎產(chǎn)區(qū)4個葡萄園土壤樣品產(chǎn)酶酵母的分離

通過1.2.1的方法，從4個土壤樣品中共分離到165株酵母菌，其中82株為SC、83株為NSC，產(chǎn)酶酵母為108株，占分離到的酵母總數(shù)的65%。由圖1可見，產(chǎn)果膠酶的酵母數(shù)量最多(84株)，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌數(shù)量最少(13株)。其中55%的產(chǎn)酶酵母能分泌2種以上水解酶，44%的產(chǎn)酶酵母能分泌3種以上水解酶，說明昌黎產(chǎn)區(qū)產(chǎn)酶酵母資源豐富。

2.2 四個土壤樣品產(chǎn)酶酵母產(chǎn)酶情況分析

A-4個土壤樣品產(chǎn)酶酵母的產(chǎn)酶數(shù)量;B-4個土壤樣品產(chǎn)酶酵母的產(chǎn)酶種類;1-嘉泰酒莊；2-耿氏酒堡；3-果樹研究所；4-瑪?shù)倌峋魄f；5-合計

由表1和表2綜合分析可見，4個葡萄園中的產(chǎn)酶酵母，產(chǎn)酶種類以產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和果膠酶為主，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母數(shù)量較少。同時產(chǎn)果膠酶和纖維素酶的酵母數(shù)量較多(16株)，同時產(chǎn)果膠酶和β-葡萄糖苷酶的酵母次之，同時產(chǎn)纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的酵母最少，同時產(chǎn)果膠酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶3種酶的酵母僅有1株，為M09(T.delbrueckii)。果膠酶和纖維素酶在果酒釀造過程中具有提高出汁率，澄清果汁。同時還能提高果皮中花色素苷、香氣糖苷及單寧等物質(zhì)的浸出率，改善果酒的品種和色澤[2-3]。β-葡萄糖苷酶是風(fēng)味修飾的關(guān)鍵酶，它能水解葡萄酒中香味前體物質(zhì)(萜烯-葡萄糖苷)，釋放天然香味濃郁的香氣糖苷，對改善葡萄酒的香氣有重要作用[20]。因此，同時產(chǎn)果膠酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的酵母和同時產(chǎn)其中2種酶的酵母在果酒釀造中具有很重要的釀造學(xué)意義。因此，在果酒釀造中應(yīng)用上述3種酶產(chǎn)生酵母作為發(fā)酵劑，可以大大降低商業(yè)釀造酶的用量，降低成本，簡化工藝，對提高葡萄酒的品質(zhì)和改善香氣具有非常重要的作用。

根據(jù)國內(nèi)外的研究報道，H.uvarum是葡萄園和葡萄酒釀造環(huán)境中常見的含量最豐富的NSC[21]，本試驗分離到的產(chǎn)酶NSC中H.uvarum占12.96%，僅次于P.kluyveri和P.membranaefaciens。H.uvarum在葡萄酒自然發(fā)酵過程中主要出現(xiàn)在發(fā)酵前期，是其中主要的NSC。因為H.uvarum能夠產(chǎn)生大量的乙酸，所以傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為H.uvarum是一種酸敗菌，對葡萄酒的風(fēng)味帶來不利影響。但最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，如果能夠?qū).uvarum進行有效的控制，和SC混菌發(fā)酵，會對葡萄酒的風(fēng)味帶來積極影響，增加葡萄酒的復(fù)雜性[21-22]。另外，還有研究報道，發(fā)現(xiàn)H.uvarum具有豐富的酶系，對提高葡萄酒的香氣和品質(zhì)具有積極作用，而且還發(fā)現(xiàn)，來源于H.uvarum的β-葡萄糖苷酶往往具有較高的耐性，在酒精發(fā)酵結(jié)束后仍有活性[23]。

此外，以上分離得到的產(chǎn)酶NSC中，Brettanomyces被認(rèn)為是一種破敗菌，通常對葡萄酒的釀造不利。而P.membranaefaciens、H.anomala、P.kluyveri、Z.bailii、S.pombe等在不同情況下對葡萄酒風(fēng)味的影響不同。如果進行很好的控制，將會對葡萄酒的風(fēng)味有積極作用[25]。T.delbrueckii、C.zemplinina、M.pulcherrima，因具有一些比較優(yōu)良的特性，是近些年來研究較多的NSC，它們其中的一些已被制備成制劑應(yīng)用于果酒的釀造。文獻報道，Hanseniaspora、Debaryomyces、Hansenual及Metschnikowia等，不僅能完全發(fā)酵葡萄汁或其他高糖培養(yǎng)基，還能產(chǎn)生具有愉快的香味[24]。C.zemplinina用于高糖果汁的發(fā)酵，不僅耐高滲，還能利用果糖發(fā)酵，同時高產(chǎn)甘油，降低SC在高糖果汁中乙醇和乙酸的產(chǎn)量，因此可以用于低醇果酒的釀造[23-24]。

表1 產(chǎn)酶酵母產(chǎn)酶種類分析

表2 不同酵母產(chǎn)酶基本情況

續(xù)表2

產(chǎn)酶數(shù)量數(shù)量/株菌株編號酵母種類菌株來源產(chǎn)酶種類產(chǎn)2種酶 30J05酒香酵母(S. cerevisiae)嘉泰酒莊淀粉酶、纖維素酶J08釀酒酵母(S. cerevisiae)嘉泰酒莊淀粉酶、果膠酶J11酒香酵母(Brettanomyces)嘉泰酒莊果膠酶、纖維素酶J15戴爾有孢圓酵母(T. delbrueckii)嘉泰酒莊淀粉酶、果膠酶J27膜醭畢赤酵母(P. membranaefaciens)嘉泰酒莊淀粉酶、果膠酶GS01葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)耿氏酒堡淀粉酶、果膠酶GS21栗酒裂殖酵母(S. pombe)耿氏酒堡淀粉酶、果膠酶GS38克魯維畢赤氏酵母(P. kluyveri)耿氏酒堡淀粉酶、纖維素酶GY19釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、果膠酶GY22釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、纖維素酶GY23釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、果膠酶GY32-果樹研究所淀粉酶、果膠酶產(chǎn)2種酶 30GY38克魯維畢赤氏酵母(P. kluyveri)果樹研究所β-葡萄糖苷酶、纖維素酶GY42釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、果膠酶GY52釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、果膠酶GY53釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、果膠酶GY57釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、果膠酶GY58釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所β-葡萄糖苷酶、果膠酶GY62釀酒酵母(S. cerevisiae)果樹研究所淀粉酶、果膠酶M01葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、纖維素酶M04戴爾有孢圓酵母(T. delbrueckii)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、纖維素酶M13釀酒酵母(S. cerevisiae)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶M15美極梅奇酵母(M. pulcherrima)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶M16戴爾有孢圓酵母(T. delbrueckii)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶M20克魯維畢赤氏酵母(P. kluyveri)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶M22克魯維畢赤氏酵母(P. kluyveri)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、纖維素酶M23釀酒酵母(S. cerevisiae)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶M25釀酒酵母(S. cerevisiae)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶M27釀酒酵母(S. cerevisiae)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶M30釀酒酵母(S. cerevisiae)瑪?shù)倌峋魄f淀粉酶、果膠酶

注：“-”表示菌種未進行分類

本試驗中，分離得到了1株同時產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的C.zemplinina(表2)，將該酵母應(yīng)用于甜型低醇果酒的發(fā)酵，具有非常大的應(yīng)用潛力，一方面避免了傳統(tǒng)低醇果酒生產(chǎn)方法對香氣成分的損失，同時該酵母產(chǎn)3種酶，對于提高果酒的品質(zhì)和香氣具有一定的潛力。

酵母分泌的胞外酶，在果酒釀造中具有提高出汁率、澄清度、過濾速度、香氣物質(zhì)釋放、色素提取率以及香氣糖苷水解等過程[10,25]。β-葡萄糖苷酶在葡萄酒增香領(lǐng)域的重要作用已經(jīng)被許多研究所證明[26]。α-淀粉酶有利于水果原料中不溶性淀粉的水解和利用。此外，纖維素酶以及木聚糖酶等可以協(xié)同果膠酶提高果汁的出汁率。因此，參與葡萄酒釀造的酵母，尤其是NSC內(nèi)源酶的種類和含量，對于提升葡萄酒的香氣和品種非常重要。本實驗僅對4種與葡萄酒釀造緊密相關(guān)的酶包括果膠酶、纖維素酶、淀粉酶和β-葡萄糖苷酶進行了考查。研究證實葡萄酒相關(guān)酵母還能分泌蛋白酶、木聚糖酶、酯酶、脲酶等胞外酶，上述酶對葡萄酒的風(fēng)味也有一定的影響[9]。本試驗并沒有涉及這些酶，需要后期進行補充和進一步研究。果膠酶在果酒的釀造中應(yīng)用最為成熟和廣泛。目前的商用釀造酶制劑除果膠酶外，還含有一定比例的纖維素酶、木聚糖酶甚至是β-葡萄糖苷酶，上述酶組分協(xié)同作用，既能達到提高果汁出汁率和澄清的目的，也具有一定的呈香作用，是非常高效的釀造酶制劑，但這些釀造用酶多為進口商品，成本高。以上的研究結(jié)果表明，分離到的很多產(chǎn)酶酵母具有多種酶組分，既具有果膠酶活性，又具有纖維素酶和β-葡糖苷酶活性。開發(fā)這樣的酵母作為果酒發(fā)酵劑，既能達到提高出汁率、澄清和增香的效果，又減少了釀造酶制劑的使用量，降低了葡萄酒生產(chǎn)成本，具有很重要的釀造學(xué)意義。

2.3 產(chǎn)酶酵母釀造因子耐受性分析

釀造環(huán)境條件復(fù)雜，具有低溫、高糖、高酸的特點，同時發(fā)酵過程乙醇含量逐漸增高。因此，分離得到的產(chǎn)酶酵母是否具有一定的釀造因子耐受性和發(fā)酵能力及增香作用，需要進一步的釀造耐性和特性分析。根據(jù)產(chǎn)酶酵母產(chǎn)酶量的高低(數(shù)據(jù)未給出)，本試驗選擇其中1株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶一種酶的SC和16株產(chǎn)3種酶的酵母，以活性干酵母為對照，進行釀造因子耐受性分析。

2.3.1 產(chǎn)酶酵母糖耐受性分析

綜上所述，果農(nóng)要想實現(xiàn)果樹健康的成長，提高果實的質(zhì)量。果樹管理人員需要根據(jù)不同種類果樹的實際情況，采取科學(xué)的修剪方式，加強對果樹病蟲害的防治工作。此外，在果樹病蟲害的防治工作當(dāng)中，要積極的將綠色防治方式融入到實際的防治工作當(dāng)中。不但可以有效的對病蟲害進行防治，而且還有助于環(huán)保，進而提高果實的數(shù)量及產(chǎn)量。

表3結(jié)果表明，酵母菌的活性與培養(yǎng)基的糖濃度呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)糖濃度過高時，會形成較高的滲透壓，導(dǎo)致酵母細胞失水，從而降低酵母的活性，不利于發(fā)酵。

表3 產(chǎn)酶酵母的糖耐受性

注：*代表將菌液稀釋10倍之后所測得的OD600值

由表3可知，除J21和GY5的耐受性較差，活性干酵母和所測產(chǎn)酶酵母均能耐受200 g/L糖含量；當(dāng)糖含量>400 g/L時，僅有活性干酵母、GY1(S.cerevisiae)、M9(T.delbrueckii)和J24(P.membranaefaciens)仍具有較高活性。以上結(jié)果說明不同種類的酵母以及相同種類的酵母，糖耐受性不同，說明酵母的耐受性存在種屬間和種內(nèi)差異。釀造甜型酒的果汁初始糖含量在300 g/L以上，具有較高糖耐受性的酵母適合于釀造甜型果酒。上述3種產(chǎn)酶酵母都具有一定的高糖耐受性，符合甜型酒釀造的要求。甜型酒釀造時，需要具有高糖耐受性的SC和NSC協(xié)同作用，因為SC在高糖環(huán)境中會上調(diào)醛脫氫酶基因的表達，代謝產(chǎn)生更多的乙酸，影響果酒的口感[33]，NSC的作用可以降低糖度從而降低滲透壓，能有效地降低SC產(chǎn)生的乙酸的含量[27]。另外，產(chǎn)酶的高糖耐受性酵母應(yīng)用于甜型果酒的釀造，將會有效增加果酒中的品種香氣，具有非常大的應(yīng)用潛力。據(jù)報道T.delbrueckii是一種低乙酸生產(chǎn)菌[28]，該菌與SC混菌發(fā)酵，可以降低約53%的揮發(fā)酸[29]。本試驗篩選到的產(chǎn)酶T.delbrueckii(M9)，耐高糖，同時可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶(表2)，因此該菌應(yīng)用于甜型酒的釀造，既具增香潛力，又能降低揮發(fā)酸的含量，是一株極具潛力的甜型果酒釀造用酵母。

2.3.2 產(chǎn)酶酵母SO2耐受性分析

不同微生物對SO2的耐受力不同，其中細菌最為敏感，其次為檸檬型酵母，SC耐受力最強，因而可使用SO2殺菌來選擇發(fā)酵微生物。在葡萄酒生產(chǎn)過程中，添加SO2可以起到殺死雜菌，防氧化，防止葡萄酒腐敗變質(zhì)的作用。葡萄質(zhì)量好的情況下，SO2使用量在30～100 mg/L；在葡萄質(zhì)量相對較差的情況下，使用量不超過80～150 mg/L。所以，能夠耐受較高含量SO2的NSC才能進行充分發(fā)酵。從表4可以看出，以活性干酵母為對照，這17株產(chǎn)酶酵母耐SO2能力都比較強。

表4 產(chǎn)酶酵母對SO2耐受性

注：(0)表示沒有稀釋；未標(biāo)(0)的為稀釋5倍的菌液所測得的OD600值

2.3.3 產(chǎn)酶酵母酒精耐受性分析

大多文獻報道中證明NSC在發(fā)酵前期較為活躍，但發(fā)酵過程中隨著乙醇含量的增加，其活性逐漸下降。由于混菌發(fā)酵有利于果酒風(fēng)味物質(zhì)的形成，因此篩選出耐酒精的NSC，對提升果酒品質(zhì)具有重要意義。酒精濃度過高會抑制酵母菌的生長繁殖及發(fā)酵活性。所以，酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于其自身對酒精耐受力的大小。由表5可知，酵母菌的活性與酒精濃度呈負(fù)相關(guān)。以活性干酵母作為對照，活性干酵母、GY5(S.cerevisiae)、GY1(S.cerevisiae)、J25(P.membranaefaciens)、 GY13(Z.bailii)、 M9(T.delbrueckii)、J23(P.membranaefaciens)、GY44(S.cerevisiae)和 J20(P.membranaefaciens)的酒精耐受性相對較高，能耐受9%的酒精度，其中GY13(Z.bailii)和M9(T.delbrueckii)的耐酒精能力最好，能耐受體積分?jǐn)?shù)為15.000%的酒精。果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)一般在11.000%～12.000%左右，僅從酒精耐受性來看，GY13(Z.bailii)和M9(T.delbrueckii)的耐酒精能力是符合要求的。據(jù)文獻報道，Z.bailii、S.pombe和P.fermentants以耐酒精能力而著稱，經(jīng)常存在于酒廠環(huán)境中，這3種酵母可以利用蘋果酸，因此可以作為降酸菌種開發(fā)[30]。T.delbrueckii具有較高的發(fā)酵力，可以作為果酒發(fā)酵的啟動菌，同時該種酵母對葡萄酒的感官有積極作用[30]。本試驗中分離獲得的M9(T.delbrueckii)可以同時分泌β-葡萄糖苷酶、果膠酶和纖維素酶，因此綜合考慮產(chǎn)酶特性和酒精耐性，該菌在提高葡萄酒品質(zhì)和增香方面具有一定的應(yīng)用潛力。

2.3.4 產(chǎn)酶酵母酒精耐受性分析

酵母菌在pH值為4.5～5.5時，發(fā)酵能力最強。pH很低的情況下，酵母的生長會受到抑制，并且NSC與SC混合發(fā)酵具有生物降酸的作用，有利于降低果酒的酸澀感。因此酸耐受性較強的NSC具有實際應(yīng)用價值。

表5 不同酵母菌對酒精的耐受性

由表6可知，pH 3.0時，J24(P.membranaefaciens)和GY1(S.cerevisiae)依舊保持較高的活性，活性干酵母的活性有所下降；pH 2.5時，活性干酵母的活性明顯下降，J24(P.membranaefaciens)和GY1(S.cerevisiae)的活性雖有下降，但仍具有較高活性。而糖耐受性和酒精耐受性較高的M9(T.delbrueckii)僅在pH 4.0時具有一定的活性，因此其對酸的耐受性低是其應(yīng)用于果酒釀造工藝不利的方面。

表6 不同酵母對酸的耐受性

注：(*5)代表將菌液稀釋5倍后測得的OD600值；(*10)代表將菌液稀釋10倍后測得的OD600值

2.3.5 產(chǎn)酶酵母溫度耐受性分析

由表7可見，所測產(chǎn)酶酵母均在20～30 ℃范圍內(nèi)生長情況較好。溫度為15 ℃時，各酵母活性均明顯下降，但仍有一定活性。因此，所測產(chǎn)酶酵母菌生長溫度范圍比較寬。果酒釀造的溫度一般控制在20～28 ℃，在此溫度范圍內(nèi)，NSC的活性都很好。此外，紅葡萄酒和白葡萄酒發(fā)酵溫度不同，有時為了提升葡萄酒的風(fēng)味或者果酒的風(fēng)味，會采取低溫長時間的發(fā)酵策略，所以在低溫條件下尤其在10～15 ℃范圍內(nèi)具有較高活性的酵母，例如本試驗中的菌株M7(P.kluyveri)、J24(P.membranaefaciens)、J26(P.membranaefaciens)、M9(T.delbrueckii)、GY5(S.cerevisiae)、GY13(Z.bailii)和J21(P.membranaefaciens)在果酒釀造中也具有一定的實際應(yīng)用潛力。

表7 不同酵母對溫度的耐受性

注：*代表將菌液稀釋10倍后測得的OD600值

3 結(jié)論

本文對昌黎4個葡萄園的土壤樣品進行了產(chǎn)酶酵母分離，分析了其產(chǎn)酶酵母多樣性和應(yīng)用潛力，結(jié)果表明，昌黎產(chǎn)區(qū)產(chǎn)酶酵母資源豐富，富含產(chǎn)果膠酶、纖維素酶等多種酶的酵母。產(chǎn)酶酵母中SC占50%左右，其余NSC共有9類。通過產(chǎn)酶酵母釀造因子耐受性分析，綜合產(chǎn)酶情況，認(rèn)為菌株GY1(S.cerevisiae)、M9 (T.delbrueckii)和J24 (P.membranaefaciens)適合高糖低醇果酒釀造的產(chǎn)酶酵母；菌株GY13(Z.bailii)和M9 (T.delbrueckii)在酒精體積分?jǐn)?shù)為15.000%時具有較強活性，是高酒精度耐受性酵母；菌株J24 (P.membranaefaciens)和GY1(S.cerevisiae)具有高酸耐受性，在pH值為2.5時仍具有較高活性；同時所測產(chǎn)酶酵母溫度適用范圍較寬，在15～30 ℃范圍內(nèi)均具有較高活性，其中菌株M7(P.kluyveri)、J24(P.membranaefaciens)、J26(P.membranaefaciens)、M9(T.delbrueckii)、GY5(S.cerevisiae)、GY13(Z.bailii)和J21(P.membranaefaciens)7株菌在15 ℃具有較高活性，適用于低溫長期的釀造工藝。從以上結(jié)果可以看出，M9 (T.delbrueckii)同時產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、果膠酶和纖維素酶，除酸耐受性較差外，具有高糖、高酒精度和低溫耐受性，綜合文獻報道和以上結(jié)果，認(rèn)為M9 (T.delbrueckii)在果酒釀造，尤其是高糖低醇果酒釀造工藝中具有很大的應(yīng)用潛力。但上述酵母能否進一步應(yīng)用于特定果酒的釀造工藝，以及其釀造特性及對果酒風(fēng)味的影響，還需要進一步具體的實驗數(shù)據(jù)分析和驗證，課題組將針對上述不同特性的酵母進行具體實驗，挖掘其葡萄酒增香潛力并開發(fā)應(yīng)用工藝。