調(diào)補肺腎三方對慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎縮的療效評價

沈婷婷，李素云，李亞，卞晴晴

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州）

0 引言

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種與呼吸道炎癥反應(yīng)增強有關(guān)的肺部疾病，其特征性表現(xiàn)為肺泡，氣道以及微血管的進行性炎癥反應(yīng)[1]，除累及肺臟外（影響氣道重塑以及肺氣腫的發(fā)生發(fā)展）[2]，可引發(fā)腦血管疾病，骨骼肌功能障礙，心臟病等全身肺外效應(yīng)[3]。世界衛(wèi)生組織將其與心腦血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤以及代謝性疾病合稱為全球“四大慢病”[4]。

骨骼肌萎縮作為COPD 主要的肺外并發(fā)癥之一，常出現(xiàn)在疾病的早期階段，是患者活動受限的主要原因，也是加快其病情惡化的關(guān)鍵因素，與COPD 患者致殘率和死亡率密切相關(guān)，影響生活質(zhì)量與預(yù)后[5]。骨骼肌結(jié)構(gòu)與代謝的改變是COPD 患者骼肌功萎縮的主要原因[6]。研究表明，COPD 骨骼肌萎縮患者的肌纖維類型可從氧化型慢肌纖維（I 型）轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒饪旒±w維（Ⅱ型）[7]，同時伴有肌纖維橫截面積的減低[8]。骨骼肌代謝方面，炎癥與機體健康狀態(tài)密切相關(guān)，COPD 患者體內(nèi)多種炎癥因子含量的增高可影響多個細胞通路，使蛋白降解速率加快，導(dǎo)致患者骨骼肌萎縮的發(fā)生[9-10]。

據(jù)研究表明瘦素（leptin,LEP）與促炎癥因子如白細胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子a（TNF-a）相關(guān)[11]。COPD 急性加重期瘦素水平會顯著增加，導(dǎo)致疾病過程中患者攝入量減少，代謝加快，出現(xiàn)消瘦、肌無力的癥狀。補肺健脾方可以顯著改善COPD大鼠骨骼肌萎縮，降低LEP 水平有關(guān)，其機制可能與下調(diào)核因子（nuclear factor，NF）-? B 活性有關(guān)[5]。

本研究以香煙煙霧暴露聯(lián)合細菌感染制備的COPD 大鼠模型為研究對象，觀察調(diào)補肺腎三方對COPD 大鼠骨骼肌萎縮的療效評價。

1 材料

1.1動物和細菌

SPF 級SD 大鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，河南省實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SYXK(豫)2017-0001。肺炎克雷伯桿菌，購自中國生物品檢驗鑒定所（貨號：46114），細菌濃度根據(jù)實驗所需調(diào)整為6×108CFU/mL。

1.2藥物氨茶堿片（0.1g/片)，購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。補肺健脾方（黨參15g，黃芪15g，白術(shù)12g，陳皮9g，茯苓12g 等，每毫升含生藥量2.6496g），補肺益腎方（人參9g，黃芪15g，枸杞子12g，浙貝母9g，山茱萸128 等，每毫升含生藥量1.8480g），益氣滋腎方（人參9g，黃芪15g，熟地黃15g，構(gòu)杞子12g，麥冬l5g 等，每毫升含生藥量2.0160g）,由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑實驗室提供。

1.3試劑與儀器

紅旗渠牌過濾嘴香煙（焦油量：14mg，煙氣煙堿量：1.2mg；煙氣一氧化碳量：15mg），購自河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司。水合氯醛由鄭州派尼化學(xué)試劑公司提供。病理儀器：PM-10AD 光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus，日本）；Image- ProRPus6.0 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc，美國）。

2 方法

2.1模型制備

大鼠購回后適應(yīng)環(huán)境7d，實驗室室溫為（25±1）℃，相對濕度（50±10）%，換氣量10-15 次/h，氨濃度≤14mg/m3，噪聲≤60db，定期檢查凈化操作系統(tǒng)，保持環(huán)境安靜。滅菌飼料喂養(yǎng)，自由飲用滅菌水，采用香煙煙霧暴露聯(lián)合肺炎克雷伯桿菌反復(fù)感染的方法建立COPD穩(wěn)定期大鼠模型；經(jīng)鼻腔滴入肺炎克雷伯桿菌液0.1mL，每5天1次，持續(xù)8周。給予大鼠香煙煙霧暴露，煙霧通過導(dǎo)管進入300L的煙霧吸入箱內(nèi)，2次/d，30min/次，2次吸煙間隔至少3h，持續(xù)12周。

每周測體重，每月測定肺功能，并根據(jù)癥狀表現(xiàn)、肺組織病理變化、肺功能數(shù)據(jù)整理分析等確定模型成功與否。

2.2分組與處理

60只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分成對照組、模型組、氨茶堿組、補肺健脾方組、補肺益腎方組以及益氣滋腎方組，共6組，每組10只。

自造模后第13周的第1天，對照組和模型組用同等劑量（2mL）的0.9%氯化鈉溶液灌胃；氨茶堿組與中藥3方組分別給予氨茶堿（2.3mg/kg），補肺健脾方4.84g/kg（0.5g/m L），補肺益腎方4.44g/kg（0.5g/m L），益氣滋腎方4.84gkg（0.5g/m L）灌胃，2次/d，共8周。給藥劑量需根據(jù)每周稱取大鼠體質(zhì)量及時調(diào)整。給藥至第20周結(jié)束后取材。

3 指標測定

3.1肺組織于第20周結(jié)束后取材。10%的中性甲醛固定72h，石蠟包埋，4um切片，常規(guī)HE染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察支氣管、肺泡病理變化，并根據(jù)典型而有意義的病理改變進行圖像定量分析。

3.2骨骼肌組織形態(tài)學(xué)

10%的中性甲醛將骨骼肌組織固定72h，進行石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察股四頭肌的病理變化。

3.3血漿中LEP含量測定

LEP濃度采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（EISA）進行測定，單位均為：ng/l。試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，操作過程嚴格按照試劑盒說明操作，每個指標測3次，取均值。

3.4統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件分析處理。組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。顯著性水準取a=0.05。

4 結(jié)果

4.1一般情況

模型組大鼠自第2周開始，出現(xiàn)不同程度的躁動、皮毛無光澤，大便溏薄，活動量減少等癥狀，各組在用藥治療后上述癥狀均有不同程度的改善，3個中藥治療組中以補肺健脾方組和補肺益腎方組尤為顯著。

4.2肺組織病理（見圖1）

光鏡下觀察，對照組肺臟組織大致正常，模型組大鼠肺組織的肺泡間質(zhì)以及肺支氣管可見大量的炎性細胞浸潤，部分肺泡壁出現(xiàn)斷裂、融合形成氣腔、纖維網(wǎng)被破壞，3個中藥治療組和氨茶堿組均可一定程度減輕上述病理改變。

4.3股四頭肌病理變化（見圖2）

圖2 第20周各組大鼠股四頭肌病理照片（HE染色）

光鏡下觀察，對照組股四頭肌肌纖維橫截大致正常，模型組股四頭肌肌纖維橫截面積減少伴有一定程度肌纖維的損壞，3個中藥治療組和氨茶堿組肌纖維橫截面積較模型組均有所改善，其中以補肺健脾方組較為明顯。

4.4LEP水平（見表3）

表3 各組大鼠血漿中LEP的含量s，n=6）

表3 各組大鼠血漿中LEP的含量s，n=6）

注：與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

對照組 351.34±67.05模型組 1396.86±299.07**氨茶堿組 570.40±246.71##補肺健脾方組 642.21±290.47#補肺益腎方組 361.44±143.15##益氣滋腎方組 478.50±94.96##

Elisa結(jié)果顯示LEP水平模型組較對照組有明顯的升高（P＜0.01），在用藥治療后，3個中藥治療組和氨茶堿組可明顯降低LEP水平(P＜0.05，P＜0.01)。

5 討論

COPD病位在肺，通常可累及到脾和腎；其穩(wěn)定期屬本虛標實，以肺脾腎三臟的虛損較為常見,氣（陽）虛、氣陰兩虛是其病機[12]，主要表現(xiàn)為肺脾氣虛證、肺腎氣虛證、肺腎氣陰兩虛證等[13-14]，并據(jù)此擬定調(diào)補肺腎三方（補肺健脾、補肺益腎、益氣養(yǎng)陰滋腎）。多中心、隨機對照臨床試驗表明，對COPD穩(wěn)定期患者，補肺健脾方能夠改善患者肺功能，改善臨床癥狀，提高運動能力和生活質(zhì)量，延緩和改善骨骼肌萎縮的發(fā)生和發(fā)展等[15]。

慢性支氣管炎、小氣道和小動脈重塑、肺氣腫等損傷是COPD主要的病理表現(xiàn)，本研究結(jié)果表明，經(jīng)治療后，較模型組而言，3個中藥治療組和氨茶堿組可明顯改善支氣管壁增厚、肺泡破裂融合、炎性細胞浸潤等表現(xiàn)；其中3個中藥組改善肺泡破裂融合較氨茶堿組顯著。

骨骼肌萎縮屬于中醫(yī)學(xué)“痿癥”、“痿壁”等病癥的范疇，是一種可以發(fā)生于多種疾病和狀態(tài)的嚴重并發(fā)癥，特征是其纖維橫截面積，蛋白質(zhì)含量和強度的降低導(dǎo)致疲勞性增加[16,17]，其機制可能是由于蛋白質(zhì)降解增加或合成減少或兩者兼而有之[18,19]，影響COPD患者呼吸肌肉和外周肌肉的功能、運動能力、健康狀態(tài)和預(yù)后。

LEP是一種由脂肪組織分泌的激素，在調(diào)節(jié)機體能量代謝、體質(zhì)量方面起著重要作用[20]，其主要生理功能為抑制攝食、增加能量消耗、維持正常的血脂代謝。COPD是一種以炎性反應(yīng)為核心的慢性進行性的的疾病，COPD肺部炎性反應(yīng)“溢出”，可產(chǎn)生全身炎性反應(yīng)和全身效應(yīng)[21-23]。COPD骨骼肌萎縮患者由于慢性炎癥刺激，炎癥介質(zhì)的增多，導(dǎo)致脂肪細胞上的瘦素mRNA表達增加，從而導(dǎo)致血液循環(huán)中瘦素水平升高[24],在COPD急性加重期患者血液循環(huán)中隨炎癥反應(yīng)的嚴重程度升高，出現(xiàn)高代謝，低攝入的狀況，從而造成患者體內(nèi)營養(yǎng)入不敷出的現(xiàn)象，使骨骼肌質(zhì)量和功能大幅下降[25]。本研究表明，3個中藥方均可以降低LEP水平，效果優(yōu)于氨茶堿。

綜上所述，調(diào)補肺腎三方對COPD大鼠骨骼肌萎縮有明顯的療效，表現(xiàn)為改善肺組織和股四頭肌病理損傷，降低LEP水平。