核酸適配體在消化系統(tǒng)疾病中的應用

蔡凌宇，王孝通，孔桂美★

（1.揚州大學醫(yī)學院（轉化醫(yī)學研究院），江蘇 揚州；2.江蘇省老年病防治重點實驗室，江蘇 揚州）

0 引言

二十世紀九十年代初，核酸適配體(aptamer)和基于指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（SELEX）技術這兩個影響深遠的概念被提出。簡而言之，即通過體外PCR擴增技術與大容積的核苷酸文庫，篩選出與噬菌體T4DNA聚合酶特異性結合的一段寡核苷酸序列（RNA或DNA）。自此，由于核酸適配體的篩選效率大大提高，與靶標的親和力、特異性、分子穩(wěn)定性、生產(chǎn)工藝可比肩抗體，核酸適配體在生物醫(yī)學領域的應用空間就愈發(fā)廣泛了。

1 核酸適配體用于在臨床實驗診斷

1.1 應用于胃癌診斷

目前，胃癌仍是全球癌癥主要相關死因之一，占癌癥死亡總數(shù)的8.2%[1]。有研究分析表明CT、MRI及PET-CT等檢測技術在診斷胃癌有無淋巴結轉移存在一定不足；而病理學檢測則存在操作繁瑣、假陽性高等問題[2]。因此，更可靠、準確、操作簡單的預測生物標志物對于胃癌的診斷、分期、靶向治療及提高生存率是極有價值的。而核酸適配體能夠作為示蹤劑應用到疾病的診斷與成像上，并最終將結合的各類藥物或毒素遞送到靶組織中且其自身也可以直接抑制靶蛋白，從而在體內顯像[3]。目前，學者們通常使用細胞SELEX技術，即以整個胃癌細胞為篩選靶標，利用細胞表面的不同結構組成或蛋白質的多樣性，篩選出能夠特異性結合靶細胞的核酸適配體。而為了使篩選的核酸適配體獲得更強的結合特異性，通常會在篩選過程中引入消減的策略，并在每輪正向篩選后加入一個反向篩選[4]。通過細胞SELEX技術成功篩選到了多條胃癌核酸適配體，如表1。

表1 通過細胞SELEX技術篩選出的胃癌核酸適配體

除了以胃癌細胞為篩選靶標進行細胞SELEX篩選也有其他相關報道，如以正常血清和牛血清白蛋白（BSA）的等體積混合物作為反篩物質，以用適配體Bio-Ap7 (生物素標記) 及所建立生物素-鏈霉親和素磁珠方法提取到過氧化物酶4（PRDX4）蛋白作為正篩目的蛋白質，利用消減SELEX技術篩選核酸適配體Ap-EGACS-11、Ap-EGACS-5。經(jīng)過進一步特異性和親和力分析后，PRDX4是具有特異性早期胃癌血清標志物的潛能，且Ap-EGACS-11可直接作為早期胃癌的檢測試劑[9]。另有學者[10]以胃癌及非癌性血清互為正篩與消減的靶標，利用雙向熱循環(huán)消減SELEX技術，實現(xiàn)特異性篩選。并通過最終鑒定，顯示其親和力均在納摩爾水平。除此之外，也有學者利用[11]毛細管電泳法成功篩選出針對Mucin16胞外域的核酸適配體，不僅為胃癌腹腔轉移的診療中提供了新的靶向分子，也為篩選提供了新的思路。

1.2 應用于幽門螺桿菌診斷

幽門螺桿菌是胃癌的主要致病菌[12-13]，目前，快速尿素酶試驗和尿素呼氣試驗是臨床和組織學中常用的檢測幽門螺桿菌的方法，需要大量的時間和嚴格的操作環(huán)境，并且需要從病人身上實際采集樣本。固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術可以檢測幽門螺桿菌釋放的揮發(fā)性有機化合物[14]，但是過程復雜，并且需要昂貴的設備與高技能人員的支持。高親和力的核酸適配體可以實現(xiàn)對幽門螺桿菌感染的有效、迅速、簡單的識別，如核酸適配體hp4[15]，可對幽門螺桿菌表面重組抗原（HP-Ag）具有較高的親和力與選擇性，能夠特異性檢測幽門螺桿菌。

1.3 應用于腸癌診斷

盡管繼肺癌之后，結直腸癌為男性癌癥死亡的主要原因[1]，但是核酸適配體診斷結直腸癌的系統(tǒng)尚處于萌芽時期，需要更多低廉簡易的納米材料來促進其發(fā)展[16]。Tertis M 等[17]在修飾的電極表面固定針對白細胞介素-6的核酸適配體，通過電化學阻抗光譜法進行檢測，用于血液檢測結直腸癌，效果良好。

1.4 應用于肝癌診斷

臨床工作中，肝癌是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)展趨勢依舊十分嚴峻[1,18]。早發(fā)現(xiàn)、早治療逐漸成為改善肝癌患者預后和降低病死率的關鍵因素。以肝癌細胞系為篩選靶標進行細胞SELEX所占比例較大并且具有針對性，以肝癌血清、臨床肝癌組織為靶標的核酸適配體篩選則可能為以后適配體發(fā)展提供新的思路[19]。

1.5 應用于胰腺癌診斷

胰腺癌作為目前死亡率最高的癌癥之一，其診斷也已經(jīng)成為熱門研究方向[20-21]，目前已有學者通過小鼠模型研究核酸適配體改善臨床用藥[22]。

1.6 應用于膽管癌診斷

目前，學者們對膽管癌細胞研究較少，多以人肝癌細胞株SMMC-7721為對照細胞進行多輪篩選，如葉玲[23]篩選出兩條對膽管癌細胞有高度特異性的核酸適配體y119和y123，并通過流式細胞術證實其可對非膽管癌細胞有良好的區(qū)分度。

1.7 應用于肝炎診斷

核酸適配體對于肝炎的研究從上個世紀起就已經(jīng)開始，通常將適配體或肝炎病毒固定于某一載體上進行檢測。Xi Z 等[24]采用磁性納米顆粒作為載體，將乙肝表面抗原HBsAg進行固定化，篩選DNA適配體，并基于磁分離和免疫分析，對臨床血液標本進行檢測，即使在有干擾物質存在的情況下，核酸適配體也能很好的工作，并且具有良好的特異性；將適配體將固定于原子力顯微鏡芯片表面，作為分子探針進行檢測[25]，發(fā)現(xiàn)A14序列的適配體即可用于整個丙型肝炎病核心抗原濃度的分析；Lee S等[26]利用溶膠-凝膠固定方法固定高特異性的核酸適配體研制HCV生物傳感器。

1.8 應用于胃腸道病原微生物診斷

核酸適配體在檢測胃腸道病原微生物上也獲得較好的發(fā)展，除了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法外，已報道的對病原體檢測的方法還有聚合酶鏈反應、免疫學檢測、基因芯片和其他生物傳感方法[27-30]。

近些年，利用表面增強拉曼光譜技術（SERS）進行細菌的快速檢測成為研究熱點。Ma X等[31]提出了SGNP-SERS生物傳感器，將拉曼信號分子p-MBA和硫酸化的斑疹傷寒核酸適配體附著于棘狀金納米粒子（SGNPs）表面，作為SERS納米探針。另一方面，將生物素化適配體固定在微效價板上，用SERS信號定量檢測，最終實現(xiàn)對斑疹傷寒桿菌快速的特異性識別與檢測。同樣基于核酸適配體SERS技術，有學者成功建立快速檢測大腸埃希菌O157：H7的方法[32]，但是其方法對于特異性檢測腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)等血清型仍需要更多的學者進一步研究。

另外，隨著微芯片技術的發(fā)展，微芯片毛細管電泳（MCE）也由于其反應速度快、信息量大、允許使用微量樣品和試劑等優(yōu)點，引起學者們極大的興趣。如：Law W S等[33]描述了MCE測定腸道致病菌大腸桿菌的方法。而Zhang Y等[34]根據(jù)細菌適配體(ST1)復合物與游離適配體電荷質量比的差異，利用MCE方法分離細菌適配體復合物與游離適配體。Bayra? C等[35]則首次展示應用腸沙門氏菌適配體crn-1、crn-2構建基于毛細管的三明治式檢測平臺。

除此之外，還有研究[36]首創(chuàng)熒光生物傳感策略，即利用目標分子-核酸適配體之間的特異性結合誘導酶修復放大反應，實現(xiàn)循環(huán)酶切放大反應，從而實現(xiàn)了超靈敏和高特異的沙門氏菌檢測。較傳統(tǒng)檢測方法而言，操作更簡單、快速且具有更高的靈敏度和更好的重現(xiàn)性。Duan N等[37]首次報道了細胞SELEX技術篩選痢疾桿菌適配體S1，并將適配體固定在微板上，形成三明治式熒光檢測方法?；耍醒芯縖38]利用金屬有機骨架材料(Uio-66-NH2)對核酸適配體的吸附特性及熒光猝滅特性，成功構建了針對沙門氏菌檢測的熒光生物傳感器。更值得一提的是，有利用表面等離子體共振（SPR）技術，以核酸適配體作為免疫識別元件，通過芯片表面光線發(fā)生的折射變化對食品中腸炎沙門氏菌進行快速、準確、特異地識別檢測[39]。

2 核酸適配體在消化道疾病治療中的應用

2.1 作為載體進行藥物運輸

核酸適配體與藥物的結合形成一種運輸工具，核酸適配體耦連藥物的模型正在進行廣泛的臨床前評價。Zhu G等[40]提出的“納米火車”的核酸適配體耦連藥物模型可以讓阿霉素（DOX）有效的殺傷腫瘤細胞；Li W等[41]通過核酸適配體L33，構建了抗腫瘤藥物阿霉素的靶向運輸系統(tǒng)(L33-DOX)，該運輸系統(tǒng)不僅選擇性地殺傷腫瘤細胞，還可以降低對非靶細胞的毒副作用。

基于各種納米材料如脂質體、聚合物膠束、聚合型納米載體、仿生型納米載體、其它納米載體等[42]，核酸適配體靶向的納米藥物結構可以被成功建立。核酸適配體靶向的納米藥物或成為各種大分子向腫瘤細胞傳遞的先導分子，可被用于治療特定的疾病。Li Y等[43]使用核酸適配體與納米材料形成的復合產(chǎn)物作為結直腸癌的靶向治療藥物，促使DM1（美登素衍生物，一種細胞毒性強烈的抗癌藥物）誘導直腸癌細胞的凋亡，并降低抗癌藥物對非癌性細胞的細胞毒副作用。Zheng H等[44]已經(jīng)將乙肝病毒表面抗原核酸適配體附著在瓊脂糖微球表面，連接鏈霉素，制備新型血液吸附劑，可以對HBV感染患者血清中HBsAg進行吸附去除，且沒有細胞毒性。

核酸適配體可結合細胞表面受體的特性實現(xiàn)了將物質靶向運輸至特定的細胞或組織中的愿景[45]。Liu Z等[46]基于臨床病例標本，通過免疫熒光成像分析技術，評估了核酸適配體SYL3C在上皮細胞粘附分子（EpCAM）的表達能力，從而說明適配體SYL3C可以代表一類能針對食管癌（EC）的運載工具，間接表明了EpCAM可以作為食管癌的治療靶點；另外，其研究團隊還利用相同的EC組織切片進行競爭性結合試驗，為適配體和抗體聯(lián)合雙相加載靶向治療提供理論依據(jù)。Yoon S等[22]在胰腺導管腺癌（PDAC）小鼠模型基礎上通過C/EBPα小激活RNA（C/EBPαsaRNA）與核酸適配體TR14結合，發(fā)現(xiàn)其結合物可聯(lián)合吉西他濱治療有明顯的抗腫瘤作用，推論核酸適配體-C/EBPα-saRNA可作為潛在佐劑，并可能輻射到其他類型的腫瘤應用。

2.2 作為藥物進行消化道疾病治療

自美國FDA在2004年批準第一個核酸適配體藥物哌加他尼鈉[47]治療年齡相關性黃斑變性以來，越來越多的學者們關注核酸適配體結合信號轉導分子的特性，以期待將其研制成可阻斷信號傳導的抑制劑[48]。Z Li 等[49]利用實驗性結腸炎小鼠模型，通過2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導小鼠結腸炎，腹腔注射補體成分5a（C5a）。其結果表明，C5a寡核苷酸適配體可以降低由TNBS誘導的小鼠血清中特定細胞因子（如IL-6INFγ等）水平，推測C5a適配體可能是治療炎性腸病的潛在治療方案。盡管由于SELEX技術的專利限制一定程度上影響了核酸適配體產(chǎn)品商業(yè)化進程，加之臨床實驗研究階段周期長，導致目前能應用于消化系統(tǒng)疾病的核酸適配體藥物少之又少。但是，核酸適配體藥物的開發(fā)終將會在消化道疾病治療方面，尤其是癌癥治療方面提供一個新的平臺，從而顯著改善人類健康。

3 討論

目前單克隆抗體仍然占據(jù)靶向診斷與治療的大部分市場，但其高昂的生產(chǎn)成本仍然給臨床帶來極大的困擾。人們需要更多的易于合成，親和力更高的生物標志物。而隨著核酸適配體技術提出及深入發(fā)展，核酸適配體技術的基礎研究和商業(yè)化開發(fā)呈爆發(fā)式增長。盡管核酸適配體在臨床應用有極大的潛力和優(yōu)勢，但其篩選技術還需要進一步提升。

在基礎研究方面，由于細胞表面分子的復雜與篩選過程復雜，難度大等問題，每次篩選并不都能保證得到理想的核酸適配體。高效的標準化SELEX篩選技術成為其應用的關鍵。除此之外，有學者認為[15]，未來的核酸適配體的研究需要考慮核酸適配體的潛在核降解。盡管學者們也一直在不斷改進化學修飾和選擇方法，然而目前沒有統(tǒng)一的標準確定修飾出的核酸適配體是最能滿足需求的。另外，還需要針對不同的核酸適配體及不同的應用條件，對修飾方法進行個體化考量。

在臨床試驗方面，人們獲得的有效數(shù)據(jù)還不夠（如哌加他尼鈉現(xiàn)已暫時退出市場）而且大多數(shù)基于核酸適配體的產(chǎn)品仍處于臨床前的研發(fā)階段。并且臨床用藥安全性評價體系、臨床試驗方案及上市后臨床監(jiān)測等還需要不斷考量。

但是，無論如何，核酸適配體在疾病診斷與治療上的潛力都是可見的。可以預測，在不久的將來，基于核酸適配體的診斷、治療技術很可能會與現(xiàn)有的抗體技術一樣成為主流方法甚至將其取代。