基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在食品檢測(cè)中的研究進(jìn)展

汪寧　林子豪　曾羲　劉璐　周慶瓊　陳婷　陳羽中　戚平

摘 要：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）方法目前廣泛應(yīng)于微生物、蛋白質(zhì)、多肽與多糖等的檢測(cè)。由于該技術(shù)前處理簡(jiǎn)單、操作便捷、適用于高通量檢測(cè)，所以近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該技術(shù)的研究非常關(guān)注，普遍認(rèn)為MALDI-TOF-MS有很強(qiáng)的的基質(zhì)依賴性，更適合做定性檢測(cè)。而眾多學(xué)者主要的研究創(chuàng)新為新型基質(zhì)的合成、檢測(cè)方法的適用性、數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與定量檢測(cè)方法的開發(fā)等，這些研究方向都將拓寬MALDI-TOF-MS的應(yīng)用領(lǐng)域，使得該技術(shù)的使用更加廣泛。本文主要對(duì)MALDI-TOF-MS在食源性微生物鑒定、食品品質(zhì)檢測(cè)、食品中有毒有害物質(zhì)測(cè)定中的應(yīng)用進(jìn)行概述。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）;食品檢測(cè);微生物鑒定;食品摻假

Abstract：Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）method was widely used in the detection of microorganisms， proteins， peptides， polysaccharides and so on. Because the pre-processing of this technology is simple， the operation is convenient， and it is suitable for high-throughput detection， scholars at home and abroad have paid great attention to the research of this technology in recent years. It is generally believed that MALDI-TOF-MS has a strong matrix dependence and is more suitable for qualitative detection. The main innovations of the research are the synthesis of new matrix， the applicability of detection methods， the establishment of database and the development of quantitative detection methods. These research directions will broaden the application field of MALDI-TOF-MS and make the technology more widely used. This review summarized the identification of food-borne microorganisms， the detection of food quality， the determination of toxic and harmful substances in food.

Key words：Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）; Food detection; Microorganism identification; Food adulteration

中圖分類號(hào)：O657.63

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)[1]，由于靈敏度高、測(cè)定速度快、易于實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，近十年來得到了快速發(fā)展。它主要用于生物大分子分析，如分析微生物、蛋白質(zhì)、多肽、核酸以及聚合物等[2]，近年來，在小分子物質(zhì)的分析上也取得了很大進(jìn)展[3]。MALDI-TOF-MS

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究、基因組研究以及生物天然藥物的開發(fā)等領(lǐng)域起到了重要作用，并在包括微生物鑒定、多肽指紋圖譜鑒定和基因檢測(cè)等生物醫(yī)療方面做出了突出貢獻(xiàn)。MALDI-TOF-MS在近年來也逐漸得到各國(guó)醫(yī)療儀器監(jiān)管部門的認(rèn)可，可作為醫(yī)療器械在中國(guó)推廣和銷售，國(guó)內(nèi)也有多家公司生產(chǎn)的飛行時(shí)間質(zhì)譜取得了中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）認(rèn)證。

在食品領(lǐng)域，MALDI-TOF-MS主要用于食源性微生物鑒定[4-8]、食用油的真假鑒別[10-14]、肉類的品質(zhì)分析[16-20]等。

1 食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

MALDI-TOF-MS是細(xì)菌鑒定的新趨勢(shì)。MALDI-TOF-MS的出現(xiàn)改變了微生物鑒定依賴于傳統(tǒng)的生物化學(xué)、分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等方法的工作模式，其周轉(zhuǎn)快、鑒定速度快、高通量的優(yōu)點(diǎn)，大大提高了工作效率。SN/T 3872-2014《出口食品中四種致病菌檢測(cè)方法 MALDI-TOF-MS法》[4]和GB/T 33682-2017《基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》[5]

標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施促使該技術(shù)的應(yīng)用日趨普及。SN/T 3872-2014[4]中規(guī)定了食品中4種致病菌的MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法，可用于食品中沙門菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌以及霍亂弧菌4種致病菌的快速檢測(cè)，其他致病菌可參照使用。楊祖順等[6]

應(yīng)用MALDI-TOF-MS對(duì)210株食源性金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定。通過軟件分析，與傳統(tǒng)的生化鑒定結(jié)果相比，鑒定結(jié)果無差異。MALDI-TOF-MS高通量、低成本、簡(jiǎn)便、快速且準(zhǔn)確，適用于食源性金黃色葡萄球菌的快速鑒定。李鳳琴等[7]研究了培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MALDI-TOF-MS分析真菌的影響以及應(yīng)用該法鑒別產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒真菌的可能性，得出了應(yīng)用該方法進(jìn)行分析的最適培養(yǎng)基及最佳培養(yǎng)時(shí)間;但是不能較好的區(qū)分低產(chǎn)毒株、高產(chǎn)毒株或非產(chǎn)毒株。王曄茹[8]利用MALDI-TOF-MS對(duì)88株沙門菌進(jìn)行了分型，根據(jù)親緣關(guān)系的差異水平值、結(jié)合耐藥表型、結(jié)合血清學(xué)和結(jié)合PFGE等，88株沙門菌被分別分為15、44、46、64個(gè)亞型。該方法在沙門菌分型中具有很好的分型能力，在檢測(cè)與鑒定食源性微生物中具有方法穩(wěn)定、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可用于食源性微生物的溯源。與大多數(shù)新技術(shù)一樣，MALDI-TOF-MS技術(shù)用于微生物檢測(cè)時(shí)，也存在著一定的局限性，如菌種鑒定需進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，盡管大部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)可進(jìn)行擴(kuò)展，添加本地菌種譜庫(kù)，但未列入庫(kù)中的菌種仍無法被識(shí)別。

2 食品品質(zhì)鑒別中的應(yīng)用

2.1 食用油

食用油是人類攝入脂肪的主要來源，但是食用油摻假是食品安全中的一個(gè)長(zhǎng)期問題，近年來隨著“地溝油”“橄欖油摻假”等事件的出現(xiàn)，人們對(duì)食用油的品質(zhì)尤為關(guān)注。GB 2716-2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》[9]明確規(guī)定了食用植物調(diào)和油的標(biāo)簽標(biāo)識(shí)應(yīng)注明各種食用植物油的比例。但是，在油脂流通及消費(fèi)領(lǐng)域，仍存在以次充好或者在高價(jià)值油脂中添加低價(jià)值油脂等欺騙消費(fèi)者的情況，而目前的檢測(cè)手段尚不能有效的檢測(cè)出來。在食用油的檢測(cè)中，國(guó)際上采用的標(biāo)準(zhǔn)方法是氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)（GC-FID）方法[10]，但是該方法存在需要化學(xué)衍生、柱分離耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。為滿足食用油的高分析要求，拉曼光譜法、紅外光譜法、MALDI-TOF-MS等許多簡(jiǎn)便、快速的分析技術(shù)被開發(fā)出來。吳杰等[11]以合成的磁性沸石咪唑酯框架-8（Fe3O4@ZIF-8）微球?yàn)榛|(zhì)，以花生油、豬油、菜籽油中的甘油三酯為研究對(duì)象，利用基質(zhì)表面輔助激光解吸離子化質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)食用油實(shí)際樣品的快速鑒別。Tsz-Tsun Ng等[12]用改進(jìn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜方法獲得了高質(zhì)量和高再現(xiàn)性的MALDI-MS光譜，并建立了食用油的初步光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。食用油樣品的真實(shí)性可通過將其MALDI-MS光譜和主成分分析結(jié)果（PCA）與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)記油結(jié)果進(jìn)行比較來確定。該方法簡(jiǎn)單，只需幾分鐘就能完成一個(gè)油樣品的分析。并且該方法對(duì)油組合物的變化敏感，可用于測(cè)量調(diào)和油。Tsz-Tsun Ng等[13]在另一項(xiàng)研究中利用MALDI-TOF-MS對(duì)900多種食用油樣品進(jìn)行了分析，建立了一個(gè)包括各食用油特征峰和光譜特征的綜合光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)435種食用油產(chǎn)品進(jìn)行分類，獲得了97.2%（98.1%的檢測(cè)集）的總體正確率。并且該研究還可以基于MALDI-MS光譜來區(qū)分食用油摻假、重復(fù)烹調(diào)食用油和普通食用油中的地溝油。Jergovi等[14]

研究了特級(jí)初榨橄欖油摻假其他植物油或較低級(jí)別的橄欖油的問題。開發(fā)了一種基于MALDI-TOF-MS的三?；叶嫉馁|(zhì)譜法，用于檢測(cè)特級(jí)初榨橄欖油摻雜的快速方案。在1%、10%和20%w/w下，加入葵花籽油和橄欖油與初榨橄欖油的混合物，模擬特級(jí)初榨橄欖油的摻假，結(jié)果表明，該技術(shù)與統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合，能夠區(qū)分特級(jí)初榨橄欖油中的摻假油。

2.2 羊乳

隨著羊乳市場(chǎng)的擴(kuò)大，在羊乳中摻雜牛乳成份是羊乳摻假的常見問題。黃漩等[15]以商品化二氧化鈦（TiO2）為富集材料，建立一種羊乳中磷酸化肽段的檢測(cè)方法。通過MALDI-TOF-MS分析，經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，從羊乳中鑒定出八個(gè)磷酸化肽段，建立了快速鑒定羊乳是否摻假的磷酸肽指紋圖譜。

2.3 水產(chǎn)品及肉類

水產(chǎn)品、肉類等動(dòng)物源性食品的追溯性通常采用DNA方法，然而該方法并不能很好的滿足時(shí)間和成本效益需求，因此需要改進(jìn)。通過MALDI-TOF-MS確定物質(zhì)特異性蛋白或磷脂分子來鑒定物種，既省時(shí)又節(jié)約成本。沈青等[16]建立了MALDI-TOF-MS快速分析三文魚肌肉組織磷脂質(zhì)的方法。該實(shí)驗(yàn)采用正離子模式，以非自然磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺為標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)三文魚中有豐富的高不飽和磷脂，共鑒定出28種磷脂分子，平均加標(biāo)回收率為74%～83%，為從脂質(zhì)組學(xué)角度評(píng)價(jià)三文魚的營(yíng)養(yǎng)提供了可靠的理論依據(jù)。Stahl等[17]通過MALDI-TOF-MS確定了24種原核生物的物種特異性蛋白，同時(shí)使用該方法建立了一個(gè)容易替代的常見的食用魚的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)中包括54種魚的相關(guān)數(shù)據(jù)。迄今為止，已成功確定118個(gè)確認(rèn)樣本。Salla等[18]采用布魯克公司商業(yè)質(zhì)譜指紋圖譜軟件，對(duì)凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦等6種重要的蝦類構(gòu)建了質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)蝦的鑒定。該方法能對(duì)74個(gè)樣本中的72個(gè)樣本鑒定到種，鑒定率為97%，2個(gè)鑒定到屬。Mazzeo等[19]獲得了來自25種不同種魚類的高度特異性質(zhì)譜圖譜，將分子量約為11 kD的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)選為鑒別特異性生物的標(biāo)志物。Christophe等[20]用MALDI-TOF-MS方法檢測(cè)肉類和明膠，方法一是通過提取豬肉、牛肉、馬肉、雞肉中的蛋白質(zhì)，測(cè)定肉類的來源，采用聚類分析及計(jì)算，不同來源的肉類樣品被有效的分離。方法二是將明膠消化成多肽，根據(jù)特征峰確定了不同來源的明膠。這兩種方法可對(duì)肉類和明膠進(jìn)行系統(tǒng)和常規(guī)追溯。

3 食品中有毒有害物質(zhì)的測(cè)定

食品中的有毒有害物質(zhì)如苯并芘、殘留的農(nóng)藥獸藥等均為小分子物質(zhì)，用傳統(tǒng)的基質(zhì)檢測(cè)小分子物質(zhì)時(shí)，背景具有很強(qiáng)的基質(zhì)離子峰干擾，難以準(zhǔn)確的找到待檢物信號(hào)峰。王瀅[21]合成了金屬有機(jī)骨架材料MIL-101（Fe），以合成材料作為基質(zhì)，建立了苯并（α）芘的定量檢測(cè)方法，方法的最低檢出限為0.1 μg·L-1，曲線的線性范圍為0.25～50 μg·L-1，R2為0.998 6，將該方法用于芝麻油、胡麻油、茶油等食用油的檢測(cè)，樣品加標(biāo)回收率為80.0%～114.8%，適用于實(shí)際樣品分析。張繼東等[22]以二氧化硅/磁性氧化石墨烯復(fù)合材料為富集和檢測(cè)平臺(tái)，建立了牛奶中環(huán)丙沙星及尿液中諾氟沙星和氧氟沙星3種藥物的測(cè)定方法。與傳統(tǒng)基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸相比，該材料對(duì)這三種物質(zhì)的檢測(cè)具有更好的富集及檢測(cè)靈敏度和信噪比。張建剛等[23]用溫和氧化石墨烯做基質(zhì)，檢測(cè)了阿克泰、高效氯氰菊酯、殘殺威、吡蟲啉、猛殺威與樂果6種農(nóng)藥，能有效解決農(nóng)藥小分子測(cè)定時(shí)基質(zhì)的干擾。

4 結(jié)論

MALDI-TOF-MS的應(yīng)用十分廣泛。在MALDI-TOF-MS的檢測(cè)中，選擇合適的基質(zhì)對(duì)分析物的離子化起著非常重要的作用，許多學(xué)者致力于新基質(zhì)的研究;特征標(biāo)志物的確定對(duì)食品品質(zhì)的鑒定也有重要的意義，還能為食品的真假鑒別、溯源、污染監(jiān)測(cè)等提供科學(xué)依據(jù)。

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