復(fù)方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能的效果及其機(jī)制

林深常 李運(yùn)景 趙偉國(guó)

摘要 目的：探討復(fù)方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能的效果及其機(jī)制。方法：將SPF級(jí)雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，每組20只。觀察組采用L-羥脯氨酸注射法誘導(dǎo)創(chuàng)立腎草酸鈣結(jié)石大鼠模型，并以復(fù)方廣金錢草合劑灌胃干預(yù)28 d。分別于對(duì)照組入組后和觀察組建模前、建模后1 d、建模后28 d收集尿液標(biāo)本，進(jìn)行尿量、尿蛋白、尿肌酐、尿鈣等腎功能相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。并在收集尿液標(biāo)本的同時(shí)取2組尾靜脈血2 mL，進(jìn)行血肌酐、血尿素氮等腎功能指標(biāo)的檢測(cè)。觀察組干預(yù)28 d均雙腎標(biāo)本，其中左腎制成10%勻漿進(jìn)行丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）水平檢測(cè)，右腎組織切片并通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨橋蛋白（OPN）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等炎性相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與同組建模前比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與同組建模后1 d比較，觀察組建模后28 d尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，觀察組腎組織MDA水平以及OPN、TGF-β陽(yáng)性表達(dá)率升高，SOD、GSH-Px水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：復(fù)方廣金錢草合劑可改善腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能，而改善氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)可能為其作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞 復(fù)方廣金錢草合劑;腎結(jié)石;草酸鈣;大鼠;腎功能;氧化應(yīng)激;炎性反應(yīng)

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of Compound Herba Desmodii Mixture on renal function in rats with calcium oxalate calculi.Methods：A total of 40 male SPF SD rats were randomly divided into a study group and a control group， with 20 rats in each group.The model of calcium oxalate nephrolithiasis was induced by L-hydroxyproline injecting in the study group.The rats were treated with Compound Herba Desmodii Mixture for 28 days.Urine samples were collected from the control group and study group before modeling， 1 day after modeling and 28 days after modeling.The urine volume， urinary protein， urinary creatinine and urinary calcium were detected.At the same time of urine samples taking， 2 mL of caudal vein blood were collected from the 2 groups.Serum creatinine， blood urea nitrogen and other renal function indexes were detected.The left kidney was made into 10% homogenate to detect the contents of MDA， SOD and GSH-Px.The right kidney was sectioned and the expressions of osteopontin（0PN）and transforming growth factor-beta（TGF-beta）were detected by immunohistochemistry.Results：Compared with those of the control group， the urine volume of the study group one day after the establishment of the model decreased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group one day after the establishment of the mode were increased（P<0.05）.Compared with those of the same group before modeling， the urine volume of the study group 1 day after modeling decreased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group 1 day after modeling increased（P<0.05）.Compared with those of the same group one day after model was established， the urine volume of the study group 28 days after modeling increased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group 28 days after modeling decreased（P<0.05）.Compared with those of the control group， the content of MDA and the positive expression rate of 0PN and TGF-beta in renal tissue of the study group increased， while the content of SOD and GSH-Px of the study group decreased（P<0.05）.Conclusion：Compound Herba Desmodii Mixture can improve renal function in rats with calcium oxalate calculi， and improvement of oxidative stress and inflammation may be its mechanism.

Keywords Compound Herba Desmodii Mixture; Kidney stone; Calcium oxalate; Rat; Renal function; Oxidative stress; Inflammation

中圖分類號(hào)：R289.5;R695文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.03.019

腎結(jié)石為臨床常見(jiàn)多發(fā)病，其中腎草酸鈣結(jié)石為其常見(jiàn)類型，不但可給患者帶來(lái)較大痛楚，且可影響其腎功能[1-2]。對(duì)腎草酸鈣結(jié)石進(jìn)行治療十分重要。尋找有效抑制結(jié)石形成的藥物或抑制結(jié)石沉積于腎的藥物并揭示其機(jī)制為目前研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，中藥在腎結(jié)石中的應(yīng)用較多，其中廣金錢草在腎結(jié)石中的應(yīng)用已得到研究認(rèn)可[3-5]。本研究亦關(guān)注了復(fù)方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能的效果，并通過(guò)其腎臟氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)變化分析藥物可能作用機(jī)制，旨在為腎草酸鈣結(jié)石治療中復(fù)方廣金錢草合劑的應(yīng)用提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180～230 g，均采用正常顆粒飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，自由攝食飲水。所有大鼠購(gòu)置后均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后方入組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.2 藥物 復(fù)方廣金錢草合劑。

1.1.3 試劑與儀器 丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、骨橋蛋白（OPN）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等相關(guān)試劑盒均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。采用lympus Aul000自動(dòng)分析儀，相關(guān)試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，具體檢測(cè)操作嚴(yán)格按照儀器及相關(guān)試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將SPF級(jí)雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，每組20只。觀察組采用2.5 kg/kg體質(zhì)量的0.25%L-羥脯氨酸連續(xù)腹腔注射7 d誘導(dǎo)創(chuàng)立腎草酸鈣結(jié)石大鼠模型。

1.2.2 給藥方法 觀察組采用中山市人民醫(yī)院制劑室生產(chǎn)的復(fù)方廣金錢草合劑（金錢草60 g、海金沙15 g、郁金10 g、雞內(nèi)金10 g、車前子10 g、瞿麥15 g、黨參15 g、黃芪15 g、菟絲子10 g、山藥15 g、木通10 g、滑石25 g、澤瀉10 g、甘草5 g，科室自制，批號(hào)：20181005）以涼開水沖泡為10 mL混懸液灌胃連續(xù)干預(yù)28 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 對(duì)照組入組后和觀察組建模前、建模后1 d、建模后28 d收集尿液標(biāo)本，進(jìn)行尿量、尿蛋白、尿肌酐、尿鈣等腎功能相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。并在收集尿液標(biāo)本的同時(shí)取2組尾靜脈血2 mL，進(jìn)行血肌酐、血尿素氮等腎功能指標(biāo)的檢測(cè)。將獲取的尿液和血液標(biāo)本以3 500 r/min轉(zhuǎn)速，3 cm半徑離心5 min，待分層后分裝于1 mL冷凍管中常規(guī)進(jìn)行冷藏待測(cè)處理。觀察組干預(yù)28 d后取2組雙腎標(biāo)本，其中左腎制成10%勻漿進(jìn)行丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）水平檢測(cè)。2組大鼠右腎組織切片并通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨橋蛋白（OPN）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等炎性相關(guān)蛋白表達(dá)情況，將獲得的標(biāo)本常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片，常規(guī)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察，相關(guān)試劑盒均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。每個(gè)樣本均隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行觀察，以出現(xiàn)黃色或棕黃色染色為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布并采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者腎功能比較

與對(duì)照組比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與本組建模前比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與同組建模后1 d比較，觀察組建模后28 d尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 2組患者氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，觀察組腎組織MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平則降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 2組患者OPN、TGF-β比較

與對(duì)照組比較，觀察組腎組織OPN、TGF-β陽(yáng)性表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 2組患者腎組織OPN和TGF-β免疫組織化學(xué)染色比較 見(jiàn)圖1、2。

3 討論

尿石癥是一種常見(jiàn)的威脅人類健康疾病，其中約70%為草酸鈣結(jié)石[6-7]。腎草酸鈣結(jié)石患者的草酸鈣結(jié)晶在腎小管上皮細(xì)胞中黏附形成結(jié)石顆粒，可給患者帶來(lái)較大困擾，且其造成的腎小管上皮損傷可進(jìn)一步導(dǎo)致腎功能損傷，嚴(yán)重威脅患者健康[8-10]。因此，對(duì)腎草酸鈣結(jié)石進(jìn)行及時(shí)有效的防治十分重要。大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型在鼠腎草酸鈣結(jié)石發(fā)病機(jī)制及其干預(yù)研究中的應(yīng)用較多，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法確定可能有效藥物及其機(jī)制[11-13]。本研究亦采用采用L-羥脯氨酸注射法誘導(dǎo)創(chuàng)立腎草酸鈣結(jié)石大鼠模型并進(jìn)行相關(guān)研究，研究中發(fā)現(xiàn)腎草酸鈣結(jié)石大鼠尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，提示腎草酸鈣結(jié)石可對(duì)腎功能造成較為明顯的影響。

近年來(lái)結(jié)石治療取得了較大進(jìn)展。以往結(jié)石的治療以西醫(yī)治療為主，最為常見(jiàn)的臨床治療方法為手術(shù)治療，患者經(jīng)體外沖擊波碎石常可出現(xiàn)多種后遺癥，而一般的保守西藥治療效果欠佳，?？纱嬖诮Y(jié)石殘留，且臨床復(fù)發(fā)極為常見(jiàn)[14-15]。改善結(jié)石治療方法是目前急需解決的難題。中醫(yī)藥在臨床的應(yīng)用近年來(lái)不斷增加，已有研究表明廣金錢草在結(jié)石干預(yù)中效果良好，廣金錢草中黃酮、生物堿、酚類、鞣質(zhì)、多糖、皂苷、有機(jī)酸等化學(xué)成分，尤其是其中的黃酮，酮類化合物在腎結(jié)石治療中的效果已得到研究認(rèn)可[16-17]。本研究亦探討復(fù)方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能的效果及其機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方廣金錢草合劑干預(yù)28 d后腎草酸鈣結(jié)石大鼠的尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平降低，證實(shí)了復(fù)方廣金錢草合劑干預(yù)腎草酸鈣結(jié)石的良好效果，這與劉天竹等[18]研究中廣金錢草干預(yù)結(jié)石效果良好的結(jié)論一致。而本研究中腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織MDA水平以及OPN、TGF-β陽(yáng)性表達(dá)率均升高，SOD、GSH-Px水平則降低，提示氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)可能在腎草酸鈣結(jié)石形成中具有重要作用，而其中腎臟指標(biāo)改善效果良好大鼠的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)均較輕，提示改善氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)可能為復(fù)方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能的機(jī)制。

綜上所述，復(fù)方廣金錢草合劑可改善腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能，而氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)干預(yù)可能為其作用主要途徑。

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（2019-03-07收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）