黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠內(nèi)分泌、免疫相關(guān)因子的影響

趙文曉 季旭明 王媛

摘要 目的：研究黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠內(nèi)分泌、免疫相關(guān)因子的影響，探討黃芪多糖健脾祛濕機(jī)制。方法：高脂低蛋白飲食加力竭游泳法建立脾虛濕困大鼠模型。黃芪多糖干預(yù)后觀察脾虛濕困大鼠體質(zhì)量變化，檢測(cè)血清總蛋白（TP）、球蛋白（GLB）含量變化，ELISA法檢測(cè)血清垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽（PACAP）含量，免疫組化法檢測(cè)十二指腸組織IL-6、IL-10表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，黃芪多糖高劑量組大鼠體質(zhì)量增加（P<0.05）;黃芪多糖中、高劑量組血清TP含量升高（P<0.05）;黃芪多糖低、中、高劑量組GLB水平出現(xiàn)升高（P<0.01），血清PACAP水平降低（P<0.01），十二指腸組織IL-6及IL-10陽(yáng)性面積百分比降低（P<0.01，P<0.05）。結(jié)論：黃芪多糖可調(diào)節(jié)脾虛濕困大鼠內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)相關(guān)因子進(jìn)而發(fā)揮健脾祛濕功效。

關(guān)鍵詞 黃芪多糖;脾虛濕困;健脾祛濕;內(nèi)分泌免疫;血清蛋白;垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽，白細(xì)胞介素-6;白細(xì)胞介素-10

Abstract Objective：To study effects of astragalus polysaccharides（APS）on endocrine and immune-related factors in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency， and to explore the mechanism of APS in invigorating spleen for eliminating dampness.Methods：Rat model with dampness stagnancy due to spleen deficiency was established by the high fat and low protein diet and exhaustive swimming method.After APS intervention， the change in body weight was observed， changes in serum levels of total protein（TP）and globulin（GLB）were determined， the content of pituitary adenylate cyclase activating peptide（PACAP）was determined by the ELISA method， and expressions of IL-6 and IL-10 in the duodenum were measured by an immunohistochemical method.Results：Compared with model group， the rats′ body weights in high dose APS group were increased（P<0.05）; the serum TP levels in medium and high dose APS groups were increased（P<0.05）; the GLB levels in the low， medium and high dose APS groups were increased（P<0.01）， the serum PACAP levels were decreased（P<0.01）， and positive area percentages of IL-6 and IL-10 in the duodenum were decreased（P<0.01， P<0.05）.Conclusion：APS can regulate endocrine and immune-related factors in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency to exert the effects of invigorating spleen for eliminating dampness.

Keywords Astragalus polysaccharides; Dampness stagnancy due to spleen deficiency; Invigorating spleen for eliminating dampness; Endocrine and immune; Serum protein; Pituitary adenylate cyclase activating peptide; Interleukin-6; Interleukin-10

中圖分類號(hào)：R242文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.03.018

黃芪是豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪干燥根，性溫味甘，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利水消腫等功效[1-2]。黃芪多糖是黃芪主要活性成分之一，可以調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化，在防治糖尿病、腫瘤、神經(jīng)性疾病等方面具有一定作用[3-4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪及其拆分組分可改善脾虛濕困大鼠一般狀況，黃芪多糖效果最好[5]。本實(shí)驗(yàn)將從內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)角度，探討黃芪多糖改善脾虛濕困的機(jī)制，為脾虛濕困的機(jī)制研究及黃芪多糖臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠，48只，雌雄各半，4周齡，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2014-0004。大鼠在IVC獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠中飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物 黃芪生藥材購(gòu)自山東濟(jì)南中魯醫(yī)院中藥房，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為黃芪干燥根。參苓白術(shù)散（No.20140704）產(chǎn)自山西華康藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 PACAP試劑盒（No.CK-E95360R）購(gòu)自上海創(chuàng)祥生物科技有限公司，IL-6（No.GB11117）、IL-10兔多克隆抗體（No.GB13108）購(gòu)自武漢Servicebio生物;RT-2100型多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀（深圳雷杜公司）。

1.2 方法

1.2.1 黃芪多糖制備 2.49 kg黃芪加10倍量水煎煮2次，濃縮，加95%乙醇至含醇量為80%，下層多糖溶解后，過(guò)濾上層液，再次醇沉，冷藏過(guò)夜。取下層多糖，放-80 ℃凍存，凍干機(jī)凍干。經(jīng)硫酸蒽酮法檢測(cè)其含量為56.29%。

1.2.2 分組與模型制備 4周齡大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為模型組和空白組，模型組大鼠按照文獻(xiàn)方法[5]，每日給與高脂低蛋白飼料與力竭游泳的方法復(fù)制脾虛濕困大鼠模型，連續(xù)誘導(dǎo)8周。模型復(fù)制成功后，模型大鼠隨機(jī)分為模型組、參苓白術(shù)散組、黃芪多糖低、中、高劑量組。第9周起，

1.2.3 給藥方法 按成人臨床劑量換算大鼠等效劑量，參苓白術(shù)散為2.5 g/kg，黃芪多糖分別為300、600、1 200 mg/（kg·d），1次/d，1 mL/100 g，連續(xù)灌胃2周。每天下午觀察大鼠一般狀況，記錄體質(zhì)量變化。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1 血清TP、GLB 大鼠麻醉后，腹腔靜脈取血，室溫靜置后，3 000 r/min離心10 min，獲得血清，使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行TP、GLB檢測(cè)。

1.2.4.2 血清PACAP 血清PACAP含量嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4.3 十二指腸組織IL-6、IL-10 大鼠麻醉后迅速剪取十二指腸組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，3 μm組織切片脫蠟后，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，沖洗后加入二抗，室溫孵育50 min，PBS沖洗，加入二氨基苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。采用Image J軟件對(duì)陽(yáng)性染色區(qū)進(jìn)行陽(yáng)性面積百分比（%Area）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對(duì)體質(zhì)量影響

第1周模型復(fù)制前各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第8周模型復(fù)制結(jié)束時(shí)與空白組比較，造模后模型大鼠體質(zhì)量顯著下降（P<0.01）。第10周給藥后與模型組比較，黃芪多糖高劑量組和參苓白術(shù)散組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 黃芪多糖對(duì)血清TP、GLB水平的影響

與空白組比較，模型組血清TP及GLB水平下降（P<0.05）。與模型組比較，黃芪多糖中劑量組、高劑量組血清TP水平升高（P<0.05），黃芪多糖低、中、高劑量組血清GLB水平顯著增加（P<0.01），參苓白術(shù)散組GLB水平升高（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 黃芪多糖對(duì)血清PACAP水平的影響

與空白組比較，模型組血清PACAP水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，黃芪多糖低、中、高劑量組血清PACAP水平顯著降低（P<0.01）。參苓白術(shù)散組PACAP水平顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 黃芪多糖對(duì)十二指腸組織IL-6、IL-10的影響

與空白組比較，模型組大鼠十二指腸組織IL-6和IL-10陽(yáng)性面積百分比顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，黃芪多糖低、中、高劑量組IL-6表達(dá)均出現(xiàn)降低（P<0.01），IL-10表達(dá)也出現(xiàn)不同程度的降低（P<0.05，P<0.01），參苓白術(shù)散組IL-6、IL-10表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表4。

3 討論

中醫(yī)理論中脾為后天之本，氣血生化之源，是以消化系統(tǒng)為主的多系統(tǒng)、多功能綜合單位，其功能與消化、血液、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。若脾失健運(yùn)，則會(huì)引起出現(xiàn)水谷精微運(yùn)化障礙，表現(xiàn)為消瘦、氣血衰少、倦怠、眩暈、水腫等脾虛濕困癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證患者內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素、免疫球蛋白等出現(xiàn)異常[6]。遞質(zhì)、激素及細(xì)胞因子等相互聯(lián)系的遞質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]。脾臟通過(guò)胃腸道內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)間相關(guān)因子的作用發(fā)揮運(yùn)化、統(tǒng)血等功能。胃腸道存在大量神經(jīng)元、內(nèi)分泌及免疫細(xì)胞，成為內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要部位。因此，本研究以胃腸道內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)中相關(guān)因子變化為切入點(diǎn)，使用本課題組依據(jù)飲食失節(jié)、勞倦傷脾中醫(yī)理論建立的脾虛濕困動(dòng)物模型，研究黃芪多糖健脾祛濕的作用機(jī)制。

黃芪是一味補(bǔ)氣扶正要藥?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》明列黃芪具有“扶正固本、補(bǔ)中益氣”的功效。據(jù)報(bào)道黃芪對(duì)內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)均有廣泛的作用[8]。黃芪多糖使其主要活性物質(zhì)之一，對(duì)內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)同樣具有廣泛作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖可增加體質(zhì)量及血清蛋白水平，我們推測(cè)黃芪多糖通過(guò)脾虛濕困大鼠的內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)從而增加體質(zhì)量，增強(qiáng)免疫功能等，發(fā)揮健脾祛濕功效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脾虛濕困大鼠血清PACAP顯著升高。PACAP是一種具有廣泛活性的內(nèi)分泌多肽，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等神經(jīng)纖維中，是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)共同的化學(xué)信號(hào)分子之一，可通過(guò)腸道神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)水鹽吸收和分泌，降低攝食量、胃酸分泌等[14-15]。此外，還在免疫和抗炎中發(fā)揮重要作用。PACAP38可以刺激元代培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細(xì)胞釋放IL-6，同時(shí)還可以增加IL-10基因表達(dá)[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型大鼠PACAP水平升高提示機(jī)體內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)失調(diào)，食物消化、水液代謝及免疫等代謝異常，黃芪多糖通過(guò)降低PACAP水平從而改善脾虛濕困時(shí)機(jī)體消化吸收、水液潴留、免疫低下等狀況。

我們還發(fā)現(xiàn)，脾虛濕困大鼠十二指腸組織IL-6和IL-10水平升高。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞等產(chǎn)生，是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答、造血調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，還可減少白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等多種蛋白表達(dá)，控制B細(xì)胞，調(diào)節(jié)IL-10分泌等[9]。正常機(jī)體血清IL-6濃度相對(duì)較低，當(dāng)疾病發(fā)生時(shí)IL-6濃度急速升高。IL-10是多細(xì)胞分泌的多效價(jià)細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞和中樞神經(jīng)細(xì)胞均可分泌。研究發(fā)現(xiàn)，脾虛患者IL-6水平及基因表達(dá)增加，脾虛大鼠腦內(nèi)IL-6受體、IL-10水平及基因表達(dá)增加[10-13]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，黃芪多糖通過(guò)調(diào)節(jié)脾虛濕困大鼠IL-6、IL-10水平，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等系統(tǒng)，以改善脾虛濕困癥狀。

總之，黃芪多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)中PACAP、IL-6、IL-10水平，進(jìn)而增加體質(zhì)量，促進(jìn)消化吸收，增強(qiáng)機(jī)體免疫，調(diào)控機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而改善機(jī)體脾虛濕困狀態(tài)，發(fā)揮健脾祛濕的功效。

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（2018-11-03收稿 責(zé)任編輯：徐穎）