不同氮磷濃度梯度對(duì)礁膜配子體生長的影響

徐日升 崔建軍 王曉梁 徐聰 黃博文 翁曼欣 謝恩義

摘 要：為探索礁膜（Monostroma nitidium）配子體生長的適宜氮、磷濃度需求，以NaNO3為氮源、KH2PO4為磷源，在不同氮（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、磷（0.5、1、2 μmol/L）濃度梯度下，室內(nèi)培養(yǎng)礁膜配子體7 d，測定各處理組藻體的生長率、光合色素（葉綠素a、b和類胡蘿卜素）和可溶性糖。結(jié)果表明，藻體生長最適氮、磷濃度比值為20∶1;且氮濃度為20 μmol/L、磷濃度為1 μmol/L時(shí)，礁膜配子體生長率取得最大值（13.80 %/d）;氮濃度為20 μmol/L 、磷濃度為2 μmol/L時(shí)，藻體光合色素含量最高（分別為0.320 7 mg/g、0.170 8 mg/g和0.103 6 mg/g）;氮濃度為0 μmol/L 、磷濃度為2 μmol/L時(shí)，藻體可溶性糖含量最高（19.03 mg/mL）。

關(guān)鍵詞：礁膜（Monostroma nitidium）;氮磷濃度;生長率;光合色素;可溶性糖

中圖分類號(hào)：S954.4

礁膜（Monostroma nitidium）又稱綠紫菜，屬綠藻門、石莼目、礁膜科、礁膜屬，配子體是單層細(xì)胞組成的膜狀體[1]。礁膜屬海藻食用價(jià)值高，營養(yǎng)豐富且口感極佳，同時(shí)具有藥用價(jià)值，其硫酸多糖有降血脂、抗氧化以及抗炎等生物活性[25]，礁膜具有產(chǎn)業(yè)化的栽培前景[6]。國內(nèi)有關(guān)報(bào)道礁膜栽培和生長生態(tài)因子的文獻(xiàn)較少，陳昌生[78]側(cè)重于鹽度與營養(yǎng)鹽對(duì)配子體快速成熟形成配子囊的影響;以及光照強(qiáng)度對(duì)合子生長發(fā)育的研究;而礁膜配子體生長適宜的氮、磷營養(yǎng)鹽需求未見報(bào)道，本文以NaNO3和 KH2PO4作為氮、磷來源， 設(shè)計(jì)不同添加氮、磷濃度梯度下的礁膜配子體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)， 觀察其生長情況，旨在探明其礁膜配子體生長的最適氮、磷濃度及比例，為礁膜人工產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的營養(yǎng)鹽調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 礁膜藻種

礁膜配子體2019年4月份采自廣東湛江硇洲島附近海域的高潮帶（E110°36.0923'N20°56.8266'），藻體加冰低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，先用消毒海水（經(jīng)高壓滅菌30 min，冷卻至常溫）清洗去除藻體表面的泥沙和雜藻，然后在消毒海水中暫養(yǎng)7 d，條件為：溫度15 ℃;光照2 000 lx;鹽度26‰;pH 8.2;光暗比為12 h∶12 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選預(yù)培養(yǎng)后形態(tài)完好、顏色鮮綠的礁膜藻體0.2 g（鮮重）培養(yǎng)于250 mL錐形瓶中，置于智能型光照培養(yǎng)箱（GXZ-300D）中培養(yǎng)。試驗(yàn)條件[9]：溫度15 ℃;光照4 000 lx;鹽度30‰;pH 8.2;光暗比12 h∶12 h。以NaNO3為氮源（N）、KH2PO4為磷源（P），設(shè)置不同氮（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、磷（0.5、1、2 μmol/L）濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)過程中每隔2 d更換一次相同氮、磷濃度的滅菌消毒人工海水（AW）[10]，每處理組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)7 d后開始進(jìn)行相關(guān)測定分析（表1）。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 生長率 培養(yǎng)結(jié)束后，用吸水紙把藻體表面的水分吸干后稱取藻體鮮重，計(jì)算生長率[11];藻體重量的生長率的計(jì)算公式如下：

GR（%/d）=[（Wt/W0）1/t -1]×100%

其中W0為初始藻的鮮重，g;Wt為培養(yǎng)結(jié)束后藻體的鮮重，g;t為培養(yǎng)周期，d。

1.3.2 光合色素含量 色素的測定按照李合生[12]《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》中的浸提法測定。先用95%乙醇提取色素，再用分光光度法測定吸光度值。以95%乙醇為空白對(duì)照，分別于波長665 nm、649 nm和470 nm處測定吸光度（A），計(jì)算公式為：

葉綠素a含量=（13.95A665-6.88A649） V/M/1 000

葉綠素b含量=（24.96A649-7.32A665） V/M/1 000

類胡蘿卜素含量=（4.08A470-11.56A649+3.29A665）V/M/1 000

式中： A為吸光度值;V為待取液體積mL;M為樣品質(zhì)量，g;各色素含量以mg/g 為單位。

1.3.3 可溶性糖 以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚硫酸法進(jìn)行測定[13]。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS19.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，并作方差分析和Duncan多重比較，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氮、磷對(duì)礁膜配子體生長率的影響

礁膜配子體在不同NaNO3濃度（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、KH2PO4濃度（0.5、1、2 μmol/L）下培養(yǎng)7 d的生長率見圖1，如圖所示，在NaNO3濃度為 0～80 μmol/L時(shí)， 藻體的生長率均隨氮濃度的增加而呈先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)N/P為20∶1，即KH2PO4濃度在0.5、1、2 μmol/L條件下，藻體分別在NaNO3濃度為10、20、40 μmol/L時(shí)，最大生長率分別為8.7±0.6、13.8±0.8、（11.1±1.5）%/d（P<0.05）;而后隨氮濃度的進(jìn)一步增加呈降低趨勢(shì)。

2.2 不同濃度氮、磷對(duì)礁膜配子體光合色素含量的影響

表2顯示的是礁膜配子體在不同氮、磷濃度下培養(yǎng)7 d后的光合色素含量，包括葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素。由表2可得，在磷濃度為0.5、1、2 μmol/L條件下，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素三個(gè)色素隨氮濃度的增加而均呈先上升后下降的趨勢(shì)，與生長率呈正相關(guān)性。對(duì)磷濃度為0.5 μmol/L處理組而言，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均在氮濃度為10 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于氮濃度為0 μmol/L組（P<0.05），葉綠素a含量在10～80 μmol/L組之間差異不顯著（P>0.05）;而葉綠素b含量在10～60 μmol/L組之間差異不顯著（P>0.05），80 μmol/L組含量最低，顯著低于10、20、60 μmol/L組（P>0.05），但與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）;類胡蘿卜素含量10～40 μmol/L組顯著高于0 μmol/L組（P<0.05），40、60、80 μmol/L類胡蘿卜素顯著低于10 μmol/L處理組（P<0.05），而60、80 μmol/L則與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）。對(duì)磷濃度為1 μmol/L處理組而言，葉綠素a和葉綠素b含量均在20 μmol/L組達(dá)到最大值，而類胡蘿卜素含量則在0 μmol/L組最高，但與20 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05），葉綠素a在0和20 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05），而葉綠素b的20 μmol/L組顯著大于0 μmol/L組（P<0.05）;葉綠素a含量在0、10、20、40、80 μmol/L組之間無顯著性差異（P>0.05），60 μmol/L組含量最低，顯著低于20 μmol/L組（P<0.05），但與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）;葉綠素b含量各處理組均顯著低于20 μmol/L組（P<0.05），各組之間無顯著性差異（P>0.05）;類胡蘿卜素含量在60 μmol/L組最低，顯著低于0、10、20 μmol/L組（P<0.05），而除60 μmol/L組外，其余各組之間無顯著性差異（P>0.05）。對(duì)磷濃度為2 μmol/L處理組而言，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均在氮濃度為20～40 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于氮濃度為0 μmol/L組（P<0.05），隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，80 μmol/L組含量最低，顯著低于10～60 μmol/L組（P<0.05），與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）。

2.3 不同濃度氮、磷對(duì)礁膜配子體可溶性糖含量的影響

礁膜配子體在不同NaNO3濃度（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、KH2PO4濃度（0.5、1、2 μmol/L）下培養(yǎng)7 d的可溶性糖含量見圖2，如圖所示，在磷濃度為0.5、1、2 μmol/L條件下，總體上看，藻體可溶性糖含量隨氮濃度的增加而均呈先下降后上升的趨勢(shì)，與生長率呈負(fù)相關(guān)性。對(duì)磷濃度為0.5 μmol/L而言，氮濃度為80 μmol/L時(shí)，藻體的可溶性糖含量最高，達(dá)到（16.19±0.82）mg/mL，顯著高于0 μmol/L處理組（P<0.05）;氮濃度為10 μmol/L時(shí)，藻體的可溶性糖含量最低，只有（10.69±0.57）mg/mL，顯著低于0 μmol/L處理組（P<0.05）。對(duì)磷濃度為1 μmol/L而言，氮濃度為10 μmol/L時(shí)，藻體的可溶性糖含量最高，達(dá)到（10.90±1.19）mg/mL，顯著高于0 μmol/L處理組（P<0.05）;氮濃度為20 μmol/L時(shí)，藻體的可溶性糖含量最低，只有（6.93±0.34）mg/mL，但與0 μmol/L處理組無顯著性差異（P>0.05）。對(duì)磷濃度為2 μmol/L而言，氮濃度為0 μmol/L時(shí)，藻體的可溶性糖含量最高，達(dá)到（19.03±0.29）mg/mL，顯著高于其余處理組（P<0.05）;氮濃度為40 μmol/L時(shí)，藻體的可溶性糖含量最低，只有（7.44±1.50）mg/mL，顯著低于其余各處理組。

3 討論

3.1 不同濃度氮、磷對(duì)礁膜配子體生長率與光合色素的影響

氮和磷是藻類生長所必需的主要元素， N、P等營養(yǎng)元素的添加，對(duì)植物的生長有較大促進(jìn)作用[14-15]。

本研究結(jié)果表明， 在三種不同KH2PO4（0.5、1、2 μmol/L）水平下，不同摩爾質(zhì)量濃度的NaNO3對(duì)礁膜的生長有顯著影響 （P<0.05），總體呈現(xiàn)出藻體的生長率隨氮濃度的增加而都呈先上升后下降的趨勢(shì)，這與眾多有關(guān)研究結(jié)果相符[16-18]。藻體生長率呈現(xiàn)先升后降的原因可能是對(duì)氮、磷比例存在一個(gè)飽和點(diǎn)，達(dá)到飽和點(diǎn)時(shí)生長速率大，此處為拐點(diǎn)，隨后氮、磷比例增加，藻體生長會(huì)受到抑制而呈現(xiàn)生長速率下降的趨勢(shì)。同時(shí)，許多研究表明， 不同N/P對(duì)藻類的生長有顯著影響，丁剛[18]等人指出N/P為20∶1，鼠尾藻幼苗特定生長率最高，而李慧等[19]人發(fā)現(xiàn)銅藻幼苗的特定生長率在N/P為10∶1時(shí)達(dá)到最大，還有楊彬[20]等人表明莫氏馬尾藻幼苗的適宜N/P為15∶1，蔡煜[21]等人則發(fā)現(xiàn)氮、磷比為8∶1 和 10∶1 時(shí)，長莖葡萄蕨藻的特定生長率升高，本研究中礁膜配子體則在N/P為20∶1時(shí)達(dá)到最大生長率，說明礁膜配子體的生長也有特定的最優(yōu)氮、磷比濃度需求。

光合色素是反映藻類生長和光合作用的重要指標(biāo)。關(guān)于氮、磷濃度對(duì)光合色素的研究中，李文慧[22]等人發(fā)現(xiàn)緣管滸苔的葉綠素和類胡蘿卜素的含量是隨著實(shí)驗(yàn)中氮的濃度升高而升高的，徐智廣[23]指出氮的加富可以提高龍須菜的色素含量。而徐永健[24]則認(rèn)為葉綠素a與實(shí)驗(yàn)的氮的濃度關(guān)系不密切。本實(shí)驗(yàn)中，在三種固定的磷濃度（0.5、1、2 μmol/L），礁膜配子體的光合色素，包括葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素總體上都是隨著氮濃度的升高而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與其生長率正相關(guān)，而且色素之間也有一定的正相關(guān)性。在磷濃度為0.5和1 μmol/L時(shí)，藻體的葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素都是在N/P為20∶1時(shí)達(dá)到最大值;而磷濃度為2 μmol/L則是在氮濃度為20 μmol/L光合色素達(dá)到最大值，與氮濃度為40 μmol/L時(shí)的光合色素沒有顯著性差異（P>0.05），此時(shí)N/P為20∶1。也就是說磷濃度為0.5 μmol/L，藻體的光合色素在氮濃度為0～10 μmol/L呈現(xiàn)上升趨勢(shì);磷濃度為1 μmol/L，藻體的光合色素在氮濃度為0～20 μmol/L呈現(xiàn)上升趨勢(shì);磷濃度為2 μmol/L，藻體的光合色素在氮濃度為0～40 μmol/L呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在一定的氮濃度范圍內(nèi)，藻體的光合色素會(huì)隨濃度的升高而升高，這也與李文慧、徐智廣[22-23]的研究結(jié)果相符合，但是光合色素含量達(dá)到最高點(diǎn)之后，開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。對(duì)磷濃度為0.5 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組而言，藻體的葉綠素a含量在氮濃度為10～80 μmol/L并無顯著性差異（P>0.05）;葉綠素b含量在氮濃度為10～60 μmol/L并無顯著性差異（P>0.05），原因可能是氮作為合成葉綠素的原料之一必須跟磷一起吸收才能發(fā)揮作用，而在氮濃度的不斷上升的時(shí)候，磷已經(jīng)缺乏，磷就成了限制因子，所以不能促進(jìn)葉綠素的合成與積累。而在10～40 μmol/L時(shí)，類胡蘿卜素含量都顯著高于0 μmol/L組（P<0.05），說明此時(shí)氮濃度范圍適宜類胡蘿卜素的積累;60～80 μmol/L類胡蘿卜素顯著低于10～20 μmol/L處理組（P<0.05），說明氮濃度過高也開始對(duì)類胡蘿卜素的積累產(chǎn)生不利影響，但并沒有抑制作用，因?yàn)?0、80 μmol/L組與0 μmol/L組沒有顯著性差異（P>0.05）。對(duì)磷濃度為1 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組而言，葉綠素a含量雖然是氮濃度為20 μmol/L組達(dá)到最大值，但是總體來說變化不大，只有氮濃度為60 μmol/L組顯著低于20 μmol/L組（P<0.05），說明此氮濃度開始對(duì)葉綠素a的合成產(chǎn)生不利影響，而0、10、20、40和80 μmol/L組均無顯著性差異（P>0.05），這與徐永健[24]的結(jié)果相似，認(rèn)為葉綠素a與氮的濃度關(guān)系不密切。該組的類胡蘿卜素含量與葉綠素a含量正相關(guān)性，除了60 μmol/L組顯著低于0～20 μmol/L組（P<0.05），其余各組無顯著性差異（P>0.05）。而葉綠素b含量20 μmol/L組顯著高于其余各組（P<0.05），而其余各組均無顯著性差異（P>0.05）。說明在該磷濃度下，葉綠素b對(duì)氮濃度變化并不敏感，且在20 μmol/L時(shí)含量最高，且顯著高于其他組，且該濃度下藻體的相對(duì)生長率也是最好的。對(duì)于磷濃度為2 μmol/L組而言，葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素呈正相關(guān)性，且三種色素含量也與藻體的相對(duì)生長率有正相關(guān)性關(guān)系，與生長率一樣都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。20、40 μmol/L組，藻體的三種色素含量顯著大于其余各組（P<0.05），而其生長率則是在40 μmol/L時(shí)最大，這有很大的相關(guān)性體現(xiàn)。這與李信書[25]等人對(duì)條斑紫菜的研究發(fā)現(xiàn)各種光合色素含量存在一定的相關(guān)關(guān)系，與本文研究相似。

總體來說，在三種不同KH2PO4水平下光合色素隨氮濃度的變化規(guī)律跟生長率的趨勢(shì)相符，且三種色素之間也存在一定的正相關(guān)性。

3.3 不同摩爾質(zhì)量濃度NaNO3對(duì)礁膜配子體可溶性糖含量的影響

有研究表明[26]，可溶性糖是植物適應(yīng)環(huán)境的信號(hào)物質(zhì)，對(duì)植物的生長與發(fā)育有調(diào)控作用。

有學(xué)者認(rèn)為[27]，藻體過量的糖會(huì)對(duì)藻類的生長造成不利的影響。本實(shí)驗(yàn)中，總體上礁膜體內(nèi)的可溶性糖含量變化趨勢(shì)與生長呈負(fù)相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，在KH2PO4濃度為0.5 μmol/L下，NaNO3濃度為80 μmol/L時(shí)， 藻體的可溶性糖含量最高，顯著高于0 μmol/L處理組（P<0.05），而此時(shí)的生長率反而是最小的;10 μmol/L處理組，可溶性糖含量最低，顯著低于0 μmol/L處理（P<0.05），而此時(shí)的生長率最大。KH2PO4濃度為1 μmol/L下， 在NaNO3濃度為20 μmol/L時(shí)， 藻體的可溶性糖含量最低，而此時(shí)的生長率也為最高，在KH2PO4濃度為2 μmol/L下，NaNO3濃度為40 μmol/L時(shí)， 藻體的可溶性糖含量最低，而此時(shí)的生長率也是最高的。

而劉婷[28]等人則認(rèn)為可溶性糖的含量會(huì)隨著氮濃度的升高而降低。本實(shí)驗(yàn)中，在三種固定的磷濃度下，在氮濃度不斷上升的過程中，可溶性糖會(huì)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)最低點(diǎn)。可溶性糖不斷下降到最低點(diǎn)的過程與劉婷的研究結(jié)果相符，原因可能是，在這個(gè)階段藻體需要吸收氮用于合成葉綠素和蛋白質(zhì)，而可溶性糖的合成就較少，而當(dāng)生長達(dá)到飽和之后，培養(yǎng)液的氮過剩，葉綠素和蛋白質(zhì)的合成就減緩，而可溶性糖的含量就開始上升不斷積累胞內(nèi)物質(zhì)，以抵抗以后氮缺乏的階段。

4 小結(jié)

藻體的生長率隨氮濃度的增加而都呈先上升后下降的趨勢(shì)，本研究中，當(dāng)N/P為20∶1即KH2PO4濃度在0.5、1、2 μmol/L條件下，藻體分別在NaNO3濃度為10、20、40 μmol/L時(shí)具有最大生長率，分別為8.68±0.62、13.80±0.84、（11.10±1.50）%/d（P<0.05），光合色素含量與生長趨勢(shì)相符，也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在N/P為20∶1色素含量最高，而此時(shí)可溶性糖含量最低。

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Abstract：[Objective] To explore the appropriate nitrogen and phosphorus concentration requirements for the growth of Monostroma nitidium gametophyte.[Methods] With NaNO3 as the nitrogen source and KH2PO4 as the phosphorus source， the concentration gradients of different nitrogen （0， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L） and phosphorus （0.5， 1， 2 μmol/L） were set， and the M.nitidium gametophytes were cultured for 7 days in nutrient solution mentioned above， in order to determine their growth rate， photosynthetic pigments（Chla， Chlb， Carotenoides） and soluble sugar.[Results] The optimum ratio of nitrogen and phosphorus concentration for algals growth is 20∶1， and when nitrogen concentration is 20 μmol/L and phosphorus concentration is 1 μmol/L， the growth rate of the M.nitidium gametophyte reaches the maximum value （13.80 %/d）， when nitrogen concentration is 20 μmol/L and phosphorus concentration is 2 μmol/L， the photosynthetic pigments content of algal is the highest （0.320 7 mg/g， 0.170 8 mg/g and 0.103 6 mg/g， respectively）， when nitrogen concentration is 0 μmol/L and phosphorus concentration is 2 μmol/L， the content of soluble sugar was the highest （19.03 mg/mL）.[Conclusion] when N/P is 20∶1， the growth rate of M.nitidium reach the maximum value.This study provides supporting data and theoretical basis for the regulation of nutrients in cultivation of M.nitidium.

Key words：Monostroma nitidium; nitrogen and phosphorus concentration; growth rate; photosynthetic pigment; soluble sugar