三種離子通道在中國鱟腦神經(jīng)節(jié)的分布

摘 要：應(yīng)用組織切片和免疫組織化學(xué)的方法在中國鱟腦神經(jīng)中定位了3種離子通道的分布。研究檢測到Na+通道和K+通道免疫陽性細(xì)胞和陽性纖維，但沒有檢測到Ca2+通道的免疫陽性。Na+通道主要分布在中間體神經(jīng)纖維網(wǎng)和背面中央細(xì)胞群，K+通道分布于背面?zhèn)群蠓降诙?xì)胞群和背面中央細(xì)胞群。

關(guān)鍵詞：中國鱟（Tachypleus tridentatus）;離子通道;免疫組化

中國鱟（Tachypleus tridentatus）隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、螯亞門（Chelicerta）、肢口綱（Merostomata）、劍尾目（Xiphosura），其存在于世已有數(shù)億年的歷史，被稱為“活化石”，是一種具有極其重要科研價值的生物，一直是國內(nèi)外學(xué)者感興趣的研究對象[1]。國內(nèi)學(xué)者對中國鱟的研究主要集中在保護(hù)區(qū)建設(shè)、人工育苗[2]、復(fù)眼形態(tài)[3]、抗菌肽研究[4]和性腺、胚胎發(fā)育[5-7]方面，有關(guān)中國鱟神經(jīng)器官的研究卻鮮有報道，筆者曾利用組織切片，HE染色研究了中國鱟腦神經(jīng)節(jié)的形態(tài)結(jié)構(gòu)[8]，利用免疫組化分析了5羥色胺（5-HT）和促性腺激素釋放激素（GnRH）在中國鱟腦神經(jīng)節(jié)的分布[9-10]。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)方法，對中國鱟腦神經(jīng)節(jié)內(nèi)Na+、K+、Ca2+通道進(jìn)行了定位，旨在為中國鱟神經(jīng)內(nèi)分泌的研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

成體中國鱟購買于廈門市第八水產(chǎn)品市場，雄鱟殼寬為21～25 cm，雌鱟殼寬為25～31 cm。快速去除中國鱟背部外殼，其消化道位于鱟身體中軸線位置。沿著消化道向食道方向剝離其他組織，可見圍咽神經(jīng)環(huán)位于食道靠近口的部位。腦神經(jīng)節(jié)即為圍咽神經(jīng)環(huán)的前部。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Ca2+通道抗體（ab93606）和Na+通道抗體（ab56240）購于Abcam公司，K+通道抗體（p4872）購與Sigma公司。DAB顯色試劑盒和羊抗兔SABC免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

迅速解剖出腦神經(jīng)節(jié)，于波恩氏液4 ℃固定過夜。組織塊經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、透蠟，包埋后連續(xù)切片，切片厚度為7 μm。

切片脫蠟至水;3% H2O2-PBS溶液室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;滴加正常山羊血清（1∶10）室溫孵育10 min;滴加5-HT兔抗體（1∶8 000），陰性對照實(shí)驗(yàn)采用正常羊血清代替一抗，4 ℃孵育過夜;PBS 浸洗三次;滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG;室溫反應(yīng)30 min;PBS浸洗三次;滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫反應(yīng)20 min;PBS浸洗三次;0.06% DAB顯色5～10 min;蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，Olympus BX51型顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)中國鱟腦中分布著Na+和K+通道免疫陽性細(xì)胞和神經(jīng)纖維，Ca2+通道在腦神經(jīng)節(jié)所有的區(qū)域呈免疫陰性。所有結(jié)果如表1所示。

Na+通道存在于中國鱟腦神經(jīng)節(jié)中的視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的少數(shù)神經(jīng)纖維中，視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的細(xì)胞體中沒有發(fā)現(xiàn)Na+通道的陽性反應(yīng)。在中間體中Na+通道分布在神經(jīng)纖維網(wǎng)的外側(cè)的少數(shù)神經(jīng)纖維，中間體細(xì)胞群沒有Na+通道的陽性反應(yīng)。在背面中央細(xì)胞群的腹面靠近蕈形體前葉處存在著Na+通道的陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞直徑為15～30 μm。另外在蕈形體和蕈形體周圍的細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)Na+通道的陽性反應(yīng)。在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)中有部分靠近圍咽神經(jīng)環(huán)后方的神經(jīng)纖維表現(xiàn)出Na+通道免疫陽性（如圖1）。

K+通道存在于中國鱟腦神經(jīng)節(jié)中的視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的少數(shù)神經(jīng)纖維中，視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的細(xì)胞體中沒有發(fā)現(xiàn)K+通道的陽性反應(yīng)。在中間體中K+通道分布在神經(jīng)纖維網(wǎng)的外側(cè)和兩臂的神經(jīng)纖維，其陽性較強(qiáng)。中間體細(xì)胞群和背面中央細(xì)胞群沒有K+通道的陽性反應(yīng)。在背面?zhèn)群蠓降诙?xì)胞群存在著K+通道的陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞直徑為15～30 μm。另外在蕈形體沒有發(fā)現(xiàn)K+通道的陽性反應(yīng)。在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)中有部分靠近圍咽神經(jīng)環(huán)后方的神經(jīng)纖維表現(xiàn)出K+通道免疫陽性（如圖1）。

3 討論

離子通道是一類跨膜糖蛋白，它們在細(xì)胞膜上形成的親水性孔道使帶電荷的離子得以進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，是神經(jīng)、肌肉、腺體等許多組織細(xì)胞膜上的基本興奮單元，它們能產(chǎn)生和傳導(dǎo)電信號，具有重要的生理功能[11]。

有關(guān)鱟的離子通道的研究主要是以美洲鱟的腹部光感受器為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)該光感受器內(nèi)的Ca2+通道是光線依賴的[12]。對于鱟的神經(jīng)系統(tǒng)中的離子通道的分布和特性尚未見報道。

在脊椎動物中Na+通道廣泛存在于可興奮的細(xì)胞中，它的開放主要是使細(xì)胞去極化，并傳播動作電位。在維持細(xì)胞興奮性和正常的生理功能中起重要的作用[13]。在背面中央細(xì)胞群的某些細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Na+通道的存在，這說明Na+通道可能與這些神經(jīng)細(xì)胞的興奮有關(guān)。在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)的神經(jīng)纖維上也發(fā)現(xiàn)了Na+通道，這些Na+通道定位在軸突上，或許該區(qū)域的Na+通道與背面中央細(xì)胞群的功能不同。

K+通道是細(xì)胞動作電位復(fù)極的主要離子電流。它們的變化對動作電位的形狀和時程均有較大影響[14]。該通道是許多藥物的主要靶位點(diǎn)。研究表明K+通道在視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓中有少數(shù)陽性纖維，說明其與視覺信號的傳遞有關(guān)。在中間體區(qū)域又發(fā)現(xiàn)了大量的陽性纖維，普遍認(rèn)為鱟的中間體主要功能是視覺信息的處理和附肢的協(xié)調(diào)運(yùn)作[15-16]。暗示這些功能與K+通道有關(guān)。

我們沒有在中國鱟腦神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)Ca2+通道的陽性細(xì)胞或纖維，但是Ca2+通道是廣泛存在于動物的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的[17]。可能是由于鱟腦神經(jīng)節(jié)中的Ca2+通道的亞型不同。由于關(guān)于鱟腦神經(jīng)節(jié)離子通道的報道很少，我們只能描述其的分布情況，對離子通道功能的確定還需進(jìn)一步研究。

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Abstract：The presence and distribution of 3 kinds of ion channels in the brain of Tachypleus tridentatus was investigated by immunocytochemistry.The immunoreactivity-cell （ir-cell） and ir-fiber of Na+ channels and K+ channels were found in the brain of T.tridentatus.Howerer，there was no ir-Ca2+ channels in T.tridentatus brain.Na+ channels located in CBN and DMG.K+ channels located in DMG and DLPG#2.

Key words：Tachypleus tridentatus;ion channels;immunohistochemistry